Name: Híbrido de imagem μCT-FMT e análise de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Aprenda a realizar imagem híbrida μCT-FMT em camundongos anestesiados para quantificar distribuição de fluorescência. Este protocolo integra tomografia por fluorescência e micro CT para análise de processos biológicos em neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos Marek Weiler para a realização dos experimentos fantasmas. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC Starting Grant 309.495: NeoNaNo), o Estado federado da Renânia do Norte-Vestfália (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE); ForSaTum), o alemão Ministério de Educação e Pesquisa (BMBF) (programas de financiamento do fígado Virtual (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), photonik Forschung Deutschland (13N13355)), a RWTH Aachen University (I 3 TM Fundo Semente), e Pesquisa da Philips (Aachen, Alemanha).

O protocolo contém uma descrição detalhada das seguintes etapas: Em primeiro lugar, os fantasmas ou ratos e a cama multimodal de rato são preparadas por imagiologia. Em seguida, uma pesquisa de corpo inteiro é adquirido no μCT. Posteriormente, o leito do mouse é transferido para a FMT onde duas varreduras são adquiridas (para cima e cabeça para baixo). Isto pode ser repetido para vários ratinhos em vários pontos de tempo. Após a conclusão da aquisição de dados, os dados precisam ser exportados e ordenadas para permitir a segmentação automática (o que exige uma licença de software Definiens), bem como a fusão de imagens e reconstrução de fluorescência (o que exige uma licença de software Imalytics pré-clínica). Finalmente é mostrado como os conjuntos de dados são multimodais e visualizado como órgãos são interactivamente segmentado para quantificar a biodistribuição de sondas fluorescentes. 1. Preparação Fantasma NOTA: Fantasmas são úteis para testar o sistema de imagem, mas também para determinar a calibração factor para uma nova sonda. <ol><li> Prepara-se uma solução de 200 ml de água, 2% de agarose, 1,8 g de TiO 2 em pó, 50 ul de azul de tripano. Depois de ferver, preencher a solução em uma forma retangular, aproximadamente, de 8 cm de comprimento, 3 cm de largura e 1,5 cm de altura. </li><li> Prepare várias inclusões fluorescentes no simulador usando pontas de pipeta, contendo uma mistura de fluorescência e agente de contraste μCT. Para criar as inclusões, corte as pontas de pipeta e selá-los com um isqueiro. </li><li> Depois que a solução solidificou, insira as inclusões no fantasma. Cortar algumas partes do phantom para alcançar uma forma irregular e para ajustá-lo ao titular multimodal mouse. </li><li> Para determinar o factor de calibragem para uma nova sonda, alguns scans fantasmas são necessários. Para isso, o fantasma FMT padrão é utilizado em combinação com quantidades conhecidas da sonda. Para uma maior precisão, adicionar 4% emulsão lipídica para a solução de receber o mesmo coeficiente de dispersão no interior da inclusão como noresto do fantasma. Também adicionar uma pequena quantidade (2%) de agente de contraste μCT para análise de imagem mais fácil. </li></ol> 2. Preparação do rato NOTA: μCT-FMT imagem requer uma preparação especial, incluindo anestesia e depilação. <ol><li> Posicione o mouse sobre alimentos sem clorofila 7 dias antes da imagem. Isto irá reduzir o sinal de fundo e é particularmente importante para os canais FMT abaixo de 750 nm. </li><li> Todas as experiências com animais são realizadas sob anestesia. Para iniciar a anestesia, colocar o rato numa câmara cheia com isoflurano a 2% em ar (caudal de 5 L / min) até o rato é adormecer. Confirme anestesia adequada por toe suave ou pele beliscar e verificando relaxamento do tônus ​​muscular (por exemplo., Músculo da mandíbula). Para manter a anestesia, continuar a aplicação isoflurano utilizando um tubo que é colocado sobre o nariz do rato (isoflurano a 2% em ar, caudal de 1 L / min). A fim de evitar drynes olhos, use veterinário pomada em ratos anestesiados. </li><li> Para injetar agente de contraste, corrigir o rato anestesiado em uma almofada de aquecimento usando fita. Coloque um (agulha de seringa ligada a um tubo) do cateter na veia da cauda e injectar o agente de contraste fluorescente (por exemplo, 2 nmol, com o volume máximo de injecção de 5 ml / kg de peso corporal, isto é, 150 ul para um ratinho de 30 g). </li><li> Para digitalizar um rato peludo, a área de digitalização tem de ser depiladas com antecedência. Para isso, use um creme da remoção da máquina de barbear ou cabelo. Algumas cepas de camundongos pode desenvolver erupções cutâneas do creme de depilação. Portanto, monitorar os ratos para alterações na pele e entre em contato com o pessoal veterinário para a assistência se necessário. Também testar a tolerância em um pequeno número de animais ao usar novas linhagens de camundongos. </li><li> Manter o rato anestesiado durante μCT e imagiologia FMT (isoflurano a 2% em ar, caudal de 1 L / min). </li></ol> 3. Rato Bed Preparação NOTA: Para a digitalização μCT-FMT, use uma multimodalcama do mouse, que se encaixa tanto no μCT ea FMT. <ol><li> Antes de imagem, limpe o rato cama com tecidos molhados. Não use álcool, pois isso pode danificar o vidro acrílico. Certifique-se de que os marcadores são livres de água, pois isso pode prejudicar a detecção do marcador automatizado. </li><li> Abra os parafusos da cama multimodal mouse e remover a parte superior. </li><li> Fixe o tubo de gás anestésico na cama mouse e fixar-lo com fita adesiva. </li><li> Posicione o mouse anestesiados para o leito do mouse e colocar o nariz para dentro do tubo de gás. Certifique-se a cabeça do rato é o indicador de frente da cama do mouse (Figura 1). </li><li> Certifique-se de que o ratinho está no meio do leito de rato para utilizar de forma óptima o campo de visão da FMT. </li><li> Feche a cama do mouse e apertar os parafusos até que o mouse é bem realizada. Verifique se o mouse pode respirar de forma constante pelo monitoramento visual dos movimentos respiratórios torácicos. </li></ol> 4. μCT Imaging NOTA: uma pesquisa de corpo inteiro é realizado usando o μCT. Os dados anatómica gerado é necessária para a fusão de imagens, para uma melhor reconstrução de fluorescência e para análise de imagem. <ol><li> Coloque a cama do mouse com o mouse para o μCT. Certifique-se de que o mouse é colocado de uma forma que ele vai &quot;cauda-primeiro&quot; no μCT. Isto é importante para a fusão automatizado. </li><li> A fim de manter a anestesia quando o μCT-tampa está fechada, volte a ligar os tubos para canalizar o gás através do caso do μCT. Primeiro retire o tubo longo do leito do mouse e anexá-lo ao conector na parte externa do μCT. Em seguida, ligue a extremidade livre restante ao conector dentro do μCT. </li><li> Dirija a cama do mouse na μCT. Certifique-se de que o tubo do gás não está solto e não pode ser pego pelo pórtico rotativo. Se necessário, fixam-o com fita adesiva. Insira o tubo no cut-out do titular da cama mouse. </li&gt; <li> Feche a μCT e adquirir uma topograma. Seleccionar pelo menos dois subscans para cobrir uma parte substancial do rato e do leito do rato, o que é importante para a fusão e reconstrução. </li><li> Selecione o protocolo de digitalização μCT chamado HQD-6565-360-90, que adquire 720 projeções com 1032 x 1012 pixels, durante uma rotação completa que exige um tempo de leitura de 90 s por subscan. Tubos são operados com tensão de 65 kV e corrente de 1,0 mA. Como alternativa, para reduzir a duração da dose de radiação e digitalização, selecione o protocolo de digitalização SQD-6565-360-29 que adquire 720 projeções com 516 x 506 pixels com o tempo de digitalização 29 s por subscan. </li><li> Inicie a digitalização μCT. A barra azul indica o progresso. Os subscans serão adquiridas posteriormente. Hipotermia e perda de fluido não são um problema por causa da duração da verificação curta de apenas alguns minutos. Não abra a tampa do μCT durante a verificação, porque isso irá interromper automaticamente a digitalização para proteger o usuário deradiação. </li><li> Quando a análise é completada, abra a tampa, volte a ligar o tubo anestésico e retire a cama do rato do suporte para transportá-lo para a FMT. </li></ol> 5. FMT Imagem NOTA: Imediatamente após a digitalização μCT, o rato é digitalizado na FMT em duas configurações (para cima e cabeça para baixo) que são usados ​​em conjunto para uma melhor reconstrução de fluorescência. <ol><li> Ligar o fornecimento de gás anestésico (isoflurano a 2% em ar, caudal de 1 L / min) para o FMT antes de colocar a cama do rato para a FMT. Usando o software de controle FMT, criar um grupo de estudo com um número adequado de sujeitos (ou seja, os ratos). Selecione as sondas que serão utilizados para a imagem latente (uso OsteoSense para novas sondas que não estão listadas). </li><li> Leve a cama multimodal do mouse com o mouse para a FMT. O tubo do gás anestésico de longa flexível mantém o fluxo de gás. Antes de inserir o leito do mouse na FMT, remova cuidadosamente o tubo, uma vez quenão é necessária dentro da FMT. Evite os parafusos da cama mouse. </li><li> Coloque a cama do mouse na FMT com o indicador vermelho primeiro (&quot;head-first&quot;). Isto é importante para a fusão de imagens para ser consistente com o μCT. </li><li> Feche a FMT. </li><li> Selecione o grupo de estudo correta e assunto. Selecione o canal desejado da FMT (para OsteoSense 750EX, usar o canal 750 nm). </li><li> Adicione uma descrição, por exemplo., &quot;Para cima&quot; ou &quot;para baixo&quot; e adquirir uma visão geral de digitalização pressionando &quot;Capture&quot;. Esta captura uma imagem de reflectância de todo o campo de vista. Certifique-se de não ter &quot;reflectância Images Only&quot; selecionado, porque caso contrário não é possível adquirir 3D verifica posteriormente. </li><li> Ajustar os parâmetros de imagem para a digitalização 3D. Ampliar o campo de visão para incluir o máximo possível do mouse. Geralmente, a cabeça e cauda não inteiramente encaixar-se no campo de vista, no entanto. Clique em &quot;Avançado221; e verifique as configurações de imagem. Definir densidade de amostragem a 3 mm, sensibilidade ao min / max normal e iluminação para 5000 e 50.000, respectivamente. </li><li> Clique em &quot;Adicionar à fila reconstrução&quot; e clique em &quot;Scan&quot; para iniciar a digitalização FMT. Isto levará cerca de 5 a 15 minutos, dependendo do tamanho e espessura do rato, porque os tempos de exposição mais longos são necessários para os objectos mais espessos. O dispositivo contém uma câmara de imagem aquecido para evitar a hipotermia. </li><li> Após a verificação, virar a cama do mouse incluindo o mouse de cabeça para baixo e adquirir outra digitalização. Isso fornece dados adicionais para a reconstrução de fluorescência. </li><li> Quando o μCT e os FMT-varreduras são concluídas eo rato acorda da anestesia, não deixá-lo sozinho até que ele recuperou a consciência suficiente, por exemplo, para passear ou para manter decúbito esternal. </li></ol> 6. Imagem Fusão e Reconstrução NOTA: Depoisconclusão da digitalização μCT-FMT, por exemplo, no final do estudo, a aquisição de dados tem de ser resolvida para permitir a fusão de imagens e de reconstrução de fluorescência automatizada. <ol><li> Para classificar os exames para posterior processamento, crie uma pasta para o estudo. Para cada varredura μCT-FMT, crie uma subpasta cujo nome contém a identificação do mouse, o ponto de tempo, por exemplo., M01_02h. </li><li> Para cada μCT-FMT varredura, exportar os scans FMT (para cima e para baixo) como .fmt arquivos e guardá-los para a subpasta usando nomes de arquivos que terminam com o &quot;_up.fmt&quot; ou &quot;_down.fmt&quot;. Cada arquivo .fmt contém os dados brutos adquiridos, ou seja, as imagens de excitação e emissão adquiridos pela câmara, os metadados, tais como os tempos de exposição, bem como a reconstrução de fluorescência gerada pela FMT. </li><li> Usando o software μCT, criar uma reconstrução com o tamanho do voxel isotrópico de 35 mm. Selecione um kernel reconstrução liso (T10). Ajuste o campo de visão de modoque todo o leito do rato, incluindo os marcadores é coberto. Selecione MIFX / RAW como formato de saída e começar a reconstrução. Após a reconstrução é feita, mova os arquivos de reconstrução μCT para a subpasta da digitalização μCT-FMT. </li><li> Exportar os dados μCT e FMT para todas as digitalizações. Certifique-se de que cada subpasta contém dois arquivos .fmt (para cima e para baixo) e à reconstrução μCT na / formato RAW MIFX. Para verificar a integridade selecionar Menu-&gt; CT-FMT-&gt; Verificar Integridade usando o software Imalytics pré-clínica. Uma lista de erros podem aparecer, como falta .fmt arquivos ou reconstruções μCT. Corrigir os erros e verificar se há integridade até que todos os erros sejam resolvidos. </li><li> Usando Menu-&gt; CT-FMT-&gt; Configurações, verifique o nome do servidor do software Definiens e ajustar, se necessário. O padrão é http: // localhost: 8184, assumindo que o software Definiens está instalado no mesmo computador. O software Definiens é necessária no passo seguinte para realizar o ausegmentação tomated da cama mouse e marcadores. </li><li> Clique Menu-&gt; CT-FMT-&gt; grupo de fusível no software Imalytics pré-clínica para realizar a fusão automatizado μCT-FMT para o estudo inteiro. Isso leva alguns minutos por μCT-FMT digitalizar e resulta em uma pasta com o sufixo &quot;Pacote&quot; paralela para a pasta estudo. Este contém um subconjunto menor de arquivos (os dados μCT ea FMT reconstrução fornecido pelo fabricante fundido) que são relevantes para uma análise mais aprofundada. </li><li> Clique Menu-&gt; CT-FMT-&gt; Reconstruçã grupo (FMT) no software Imalytics pré-clínica para executar a reconstrução de fluorescência, incluindo a geração de mapas de absorção e de difusão 13. Mesmo que o processamento é acelerada por GPU 20, cada reconstrução requer 1 a 4 horas, dependendo do tamanho do rato. Os resultados será armazenado na pasta pacote. Nota: Para permitir um caudal superior, que atualmente executar essas reconstruções em um cluster GPU com 56 GPUs. </li&gt; </ol> 7. Análise de Imagem NOTA: Para extrair medições quantitativas a partir dos dados da imagem, é necessário segmentação de lesões e órgãos. <ol><li> Uma vez que todos os conjuntos de dados são fundidos e reconstruídos, criar uma segmentação para cada μCT-FMT digitalizar utilizando o software Imalytics pré-clínica. </li><li> Carregue um arquivo μCT como underlay eo arquivo de fluorescência como sobreposição. Pressione o botão &quot;3D&quot; para ligar a renderização de volume e inspecionar o conjunto de dados. </li><li> Para o segmento de pulmão, clique em Menu-&gt; classes:&gt; Adicionar classe e criar uma classe chamada &quot;tmp&quot;. Isso também pode ser feito através do menu de contexto. Criando uma nova classe define automaticamente como classe de saída para as operações de segmentação subsequentes. <ol><li> Executar uma operação de limiar para o segmento todas as regiões com baixa intensidade no conjunto de dados μCT (clique Menu-&gt; Segmentation-&gt; Thresholding-&gt; Abaixo e digite 600). Agora a classe tmp contém o ar fora do mousar, mas também o tecido pulmonar. </li><li> Crie uma classe de &quot;pulmão&quot;. Executar uma &quot;Encha Região&quot; operação (botão direito do mouse no pulmão e selecionar Menu-&gt; Preencher Região-&gt; Preencher região ilimitado), para separar o pulmão do ar exterior. </li><li> Excluir a classe tmp, pois não é mais necessário. </li></ol></li><li> Para regiões convexas segmento, por exemplo., A bexiga, utilize o modo rabisco. Primeiro, crie uma &quot;bexiga&quot; classe. <ol><li> Pressione F1 para excluir todos os rabiscos. </li><li> Usando o rato do computador, desenhar rabiscos para delinear as fronteiras da bexiga. </li><li> Pressione F3 para preencher a região delimitada pelos rabiscos com uma máscara temporária que aparece como sobreposição de vermelho. Iterativamente adicionar mais rabiscos (em qualquer orientação slicing) e pressione F3 até que uma precisão suficiente é alcançada. Tipicamente, rabiscos em 10 fatias são suficientes. </li><li> Pressione F4 para armazenar a máscara temporária como &quot;bexiga&quot;. </li><li> Proceda assim para o segmentooutras regiões convexas, tais como o coração e os rins. Muitas regiões, por exemplo., O estômago ou o fígado, pode ser aproximada por algumas regiões convexas. </li></ol></li><li> Para segmento da coluna vertebral, primeiro crie uma classe &quot;Bone&quot;. <ol><li> Escolha ContextMenu-&gt; Thresholding-&gt; acima para executar uma operação de limiar para classificar todos os voxels brilhante (por exemplo., Acima de 1600) como &quot;osso&quot;. </li><li> Uma operação de enchimento região não seria suficiente para segmento da coluna vertebral, porque está ligada com muitas outras partes do esqueleto, por exemplo., As nervuras. Executar algumas operações de corte por iterativamente desenho rabiscos e pressionando F2 para separar a espinha do crânio, as costelas, e o osso sacro. </li><li> Finalmente, criar uma classe &quot;Spine&quot; e realizar uma operação de enchimento região para obter a coluna vertebral (botão direito do mouse na coluna e selecionar ContextMenu-&gt; Preencher Região-&gt; Preencher região ilimitado). </li></ol></li><li> Salve a segmentação como um arquivo dentro the subpasta da varredura μCT-FMT. Use um nome consistente, por exemplo, organs.seg, para permitir o processamento em lote. </li><li> Selecione Menu-&gt; Estatísticas-&gt; Class estatísticas (overlay), para gerar uma planilha que contém a intensidade de fluorescência média, o volume eo valor total (produto de média e volume) para cada classe. </li><li> Para gerar uma única planilha que contém os valores para todas as regiões de todos os rastreamentos μCT-FMT, clique em Menu-&gt; batch-&gt; Definir configurações em lote e clique em Menu-&gt;&gt; batch- estatísticas lote. Isso evita o esforço de criar e fundir muitas limas de planilha, ou seja, um para cada varredura μCT-FMT. </li></ol> 8. Calibração Probe <ol><li> Para calcular o fator de calibração de uma sonda, várias varreduras fantasmas μCT-FMT são obrigatórios diferentes quantidades conhecidas de sonda (veja o passo 1.4), por exemplo., Com 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol e 0 pmol. </li><li> Digitalizar os fantasmas como descrito noseções 4 e 5. Também para varreduras fantasmas, para cima e para baixo scans na FMT são obrigatórios. </li><li> Exportar os dados e realizar a fusão e reconstrução conforme descrito no capítulo 6. </li><li> Segmento a inclusão usando os dados μCT para cada varredura por limiarizar (acima de 1200) e enchimento região. </li><li> Gerar uma planilha com os valores de fluorescência medidos e traçar-los em função das quantidades conhecidas. Calcular a inclinação de um ajuste de regressão linear. Este é o factor de calibração para a sonda. </li></ol>

<ol><li>Hoffman, R. M., Yang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+imaging+in+the+live+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Subcellular imaging in the live mouse.</a> Nature Protocols. 1 (2), 775-782 (2006).</li>
<li>Ale, A., Ermolayev, V., Herzog, E., Cohrs, C., Angelis, M. H., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMT-XCT%3A+in+vivo+animal+studies+with+hybrid+fluorescence+molecular+tomography-X-ray+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FMT-XCT: in vivo animal studies with hybrid fluorescence molecular tomography-X-ray computed tomography.</a> Nature Methods. 9 (9), 615-620 (2012).</li>
<li>Eaton, V. L., Vasquez, K. O., Goings, G. E., Hunter, Z. N., Peterson, J. D., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tomographic+imaging+of+near+infrared+imaging+agents+quantifies+disease+severity+and+immunomodulation+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo.</a> Journal of Neuroinflammation. 10 (138), (2013).</li>
<li>Lederle, W., Arns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+annexin-based+apoptosis+imaging+in+the+assessment+of+antiangiogenic+therapy+effects%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Research%22%5BJournal%5D)">Failure of annexin-based apoptosis imaging in the assessment of antiangiogenic therapy effects.</a> EJNMMI Research. 1 (26), (2011).</li>
<li>Ntziachristos, V., Tung, C. -H., Bremer, C., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+tomography+resolves+protease+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo.</a> Nature Medicine. 8 (7), (2002).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+uses+of+fluorescent+proteins+to+visualize+cancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (10), 796-806 (2005).</li>
<li>Schulz, R. B., Ale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+system+for+simultaneous+fluorescence+and+x-ray+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Hybrid system for simultaneous fluorescence and x-ray computed tomography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 29 (2), 465-473 (2010).</li>
<li>Stuker, F., Baltes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+small+animal+imaging+system+combining+magnetic+resonance+imaging+with+fluorescence+tomography+using+single+photon+avalanche+diode+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Hybrid small animal imaging system combining magnetic resonance imaging with fluorescence tomography using single photon avalanche diode detectors.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (6), 1265-1273 (2011).</li>
<li>Leblond, F., Davis, S. C., Valdés, P. A., Pogue, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Whole-body+Fluorescence+Imaging%3A+Review+of+Instruments%2C+Methods+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Preclinical Whole-body Fluorescence Imaging: Review of Instruments, Methods and Applications.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 98 (1), 77-94 (2010).</li>
<li>Kunjachan, S., Gremse, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+optical+imaging+of+nanomedicine+biodistribution%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Noninvasive optical imaging of nanomedicine biodistribution.</a> ACS Nano. 7 (1), 252-262 (2013).</li>
<li>Radrich, K., Ale, A., Ermolayev, V., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+limited-projection-angle+fluorescence+molecular+tomography+using+a+co-registered+x-ray+computed+tomography+scan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Improving limited-projection-angle fluorescence molecular tomography using a co-registered x-ray computed tomography scan.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126011(2012).</li>
<li>Freyer, M., Ale, A., Schulz, R. B., Zientkowska, M., Ntziachristos, V., Englmeier, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+automatic+segmentation+of+anatomical+structures+in+x-ray+computed+tomography+images+to+improve+fluorescence+molecular+tomography+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Fast automatic segmentation of anatomical structures in x-ray computed tomography images to improve fluorescence molecular tomography reconstruction.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (3), 036006(2010).</li>
<li>Gremse, F., Theek, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+Reconstruction+Improves+Biodistribution+Assessment+of+Fluorescent+Nanoprobes+Using+Hybrid+Fluorescence-mediated+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Absorption Reconstruction Improves Biodistribution Assessment of Fluorescent Nanoprobes Using Hybrid Fluorescence-mediated Tomography.</a> Theranostics. 4 (10), 960-971 (2014).</li>
<li>Cheong, W. -F., Prahl, S. A., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+optical+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">A review of the optical properties of biological tissues.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).</li>
<li>Doleschel, D., Mundigl, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+near-infrared+imaging+of+the+erythropoietin+receptor+in+human+lung+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%3A+Official+Publication%2C+Society+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts.</a> Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).</li>
<li>Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tomography+of+MMP-activity+allows+a+sensitive+non-invasive+characterization+of+the+invasiveness+and+angiogenesis+of+SCC-xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts.</a> Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).</li>
<li>Kunjachan, S., Pola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+versus+Active+Tumor+Targeting+Using+RGD-+and+NGR-Modified+Polymeric+Nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines.</a> Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).</li>
<li>Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-126-5p+promotes+endothelial+proliferation+and+limits+atherosclerosis+by+suppressing+Dlk1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1.</a> Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).</li>
<li>Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+associates+with+inflammation+in+early-stage+atherosclerosis+evaluated+by+molecular+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo.</a> Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).</li>
<li>Gremse, F., Höfter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPU-Accelerated+Sparse+Matrix-Matrix+Multiplication+by+Iterative+Row+Merging%5BTitle%5D)+AND+%22SIAM+Journal+on+Scientific+Computing%22%5BJournal%5D)">GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging.</a> SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).</li>
<li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Whole+Body+Biodistribution+of+Fluorescent-Labeled+Agents+by+Non-Invasive+Tomographic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative Whole Body Biodistribution of Fluorescent-Labeled Agents by Non-Invasive Tomographic Imaging.</a> PLoS ONE. 6 (6), e20594(2011).</li>
<li>Theek, B., Gremse, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+EPR-mediated+passive+drug+targeting+using+contrast-enhanced+functional+ultrasound+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Characterizing EPR-mediated passive drug targeting using contrast-enhanced functional ultrasound imaging.</a> Journal of Controlled Release. 182 (1), 83-89 (2014).</li>
<li>Hyde, D., Schulz, R., Brooks, D., Miller, E., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+dependence+of+hybrid+x-ray+computed+tomography%2Ffluorescence+molecular+tomography+on+the+optical+forward+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America.+A%2C+Optics%2C+Image+Science%2C+and+Vision%22%5BJournal%5D)">Performance dependence of hybrid x-ray computed tomography/fluorescence molecular tomography on the optical forward problem.</a> Journal of the Optical Society of America. A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).</li>
<li>Jacques, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+properties+of+biological+tissues%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Optical properties of biological tissues: a review.</a> Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37(2013).</li>
<li>Loening, A. M., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMIDE%3A+a+free+software+tool+for+multimodality+medical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">AMIDE: a free software tool for multimodality medical image analysis.</a> Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).</li>
<li>Gremse, F., Schulz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Data+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Animal+Imaging%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Data Analysis.</a> Small Animal Imaging. , 363-378 (2011).</li>
<li>Baiker, M., Milles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas-based+whole-body+segmentation+of+mice+from+low-contrast+Micro-CT+data%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Atlas-based whole-body segmentation of mice from low-contrast Micro-CT data.</a> Medical Image Analysis. 14 (6), 723-737 (2010).</li>
<li>Sevick-Muraca, E. M., Rasmussen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+with+optics%3A+primer+and+case+for+near-infrared+fluorescence+techniques+in+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine.</a> Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303(2008).</li>
</ol>

Felix Gremse é fundador e proprietário da Gremse-IT, uma empresa iniciante que oferece software e serviços para análise de imagem médica em cooperação com a Philips e do Departamento de Experimental Imagem Molecular da Universidade RWTH Aachen.

Nós descrevemos e aplicar um protocolo para multimodal imagem μCT-FMT. Nós usamos comercialmente disponível e amplamente utilizado FMT e dispositivos μCT 3,11,15 - 17,21. Embora o protocolo requer uma FMT específico, o μCT pode ser substituído por outro μCT com funcionalidade semelhante e os parâmetros de digitalização comparáveis, por exemplo, o campo de visão deve ser suficientemente grande para cobrir a cama de rato, incluindo os marcadores. A FMT foi usado para a análise de biodistribuição sem combinando-o com μCT ou ressonância magnética 21, no entanto, os dados anatómica é benéfica para aumentar a reprodutibilidade porque a segmentação pode basear-se nos limites de órgãos que são visíveis nos dados μCT 10. Embora os dispositivos μCT-FMT integrados foram desenvolvidos 2,7, estes ainda não estão disponíveis comercialmente. Além disso, a utilização de dois dispositivos separados permite tubagem, isto é., A próxima ca raton ser trabalhada na μCT enquanto o primeiro ratinho ainda está no FMT, para aumentar o rendimento. Para reduzir a carga de trabalho manual, realizar a detecção de marcador automatizado e de fusão. Além disso, a forma do rato é automaticamente segmentado e esta informação melhora significativamente a reconstrução 11,13,22 fluorescência. Para a reconstrução de fluorescência quantitativa, mapas absorção e espalhamento são necessários 13,23. Obtivemos o mapa de dispersão por segmentação automatizada dos dados μCT e atribuir coeficientes de dispersão conhecidos de vários tipos de tecidos (pulmão, ossos, pele, gordura, e restantes tecidos moles) 24. Posteriormente, reconstruir um mapa da absorção a partir dos dados em bruto óptico que é particularmente importante para os órgãos perfundidos bem como o coração e o fígado 13,20. Digitalizar vários ratos em vários pontos de tempo rapidamente resulta em um grande número de conjuntos de dados a serem analisados. Para BIODIStribuição estudos, vários órgãos precisam ser segmentados para cada varredura μCT-FMT. Infelizmente, as segmentações não pode ser reutilizado, porque o rato foi recentemente posicionado no leito rato repetidamente. Nós usamos uma ferramenta de segmentação interativo, desenvolvido no nosso instituto, no entanto, outras ferramentas pode também ser apropriada 25. Geramos segmentações baseada em voxel, porque estes corresponder melhor aos órgãos complexos do que formas simples, como elipses e cubos 26. Segmentação de todo animal automatizado seria útil para reduzir ainda mais a carga de trabalho manual de 27, mas uma ferramenta de segmentação interativa ainda seria necessário para corrigir erros de segmentação. Além disso, ferramentas de segmentação automatizados dificilmente pode antecipar casos especiais, tais como patologias corretamente. Desde que nós usamos varreduras μCT nativos, alguns órgãos como o baço são muito difíceis de segmento mesmo manualmente. Os agentes de contraste ajudaria, mas existem problemas com a tolerância e que é difícil de manutenna distribuição de agente de contraste constante ao longo do imaging longitudinal. O nosso estudo mostra que fantasma a localização do sinal é melhorado quando se usa a informação da forma de reconstrução por fluorescência. In vivo, a uma melhoria semelhante é evidente para o ponto de tempo inicial (15 minutos após a injecção), quando uma grande quantidade da sonda já está no bexiga urinária. A sonda de ligação hidroxiapatita acumula em ossos e articulações. É notável que esta rápida ocorre, por exemplo, o sinal já é claramente visível na coluna 15 minutos após a injecção. Isto é provavelmente causado pela baixa peso molecular da sonda, o que permite o extravasamento rápido e difusão para as regiões alvo. A sonda se liga covalentemente a sua hidroxiapatita alvo e a sonda não ligada é excretado. Para os pontos de tempo posteriores, entre 6 h e 24 h após a injecção, a intensidade do sinal na coluna vertebral permanece relativamente estável, provavelmente, porque praticamente nenhuma luz redói profundamente o mouse para branquear a fluorescência. Para nosso estudo, usamos o canal 750 nm, o que resulta em baixa fluorescência de fundo, como é evidente para os exames adquiridos antes da injeção. Em comprimentos de onda mais baixos, mais sinal de fundo pode ser esperado 28. Em resumo, nós descrevemos um protocolo de imagem multimodal para comercialmente disponíveis dispositivos FMT e μCT. Mostra-se que a combinação proporciona benefícios para a reconstrução de fluorescência. Nós ilustrar como as curvas de biodistribuição são extraídos a partir da grande quantidade de dados de imagem por meio de segmentação órgão interactivo, e o processamento em lote. Acreditamos que este fluxo de trabalho padronizado pode ser útil para o desenvolvimento de medicamentos e de outros estudos de imagem utilizando sondas com marcação fluorescente.

Tomografia mediada por fluorescência, tomografia molecular também chamado de fluorescência (FMT), é uma técnica promissora para avaliar quantitativamente a distribuição nos tecidos de fluorescência difusa, tais como ratinhos anestesiados ou mesmo tecidos do corpo humano, por exemplo, seios ou articulações dos dedos. Em contraste com técnicas de microscopia não-invasivos, que permitem imagens de metas superficiais no subcelular resolução 1, FMT permite a reconstrução tridimensional das fontes fluorescentes em profundidades de vários centímetros, embora em menor resolução 2. Muitas sondas fluorescentes estão disponíveis para segmentados angiogénese imagem, apoptose, inflamação, e outros 2-5. Algumas sondas são activável, por exemplo., Por clivagem enzimática específico levando a unquenching de fluorocromos. Além disso, os genes repórter que expressam proteínas fluorescentes pode ser trabalhada, por exemplo, para controlar a migração de células tumorais 6. FMT beneficia fortemente a partir da combinação com uma modalidade anatômica, por exemplo, μCT 2,7 ou ressonância magnética 8. Embora os dispositivos FMT autônomos estão disponíveis comercialmente 9, as imagens de fluorescência são difíceis de interpretar sem informações de referência anatômica. Recentemente fomos capazes de mostrar que os dados de imagem anatômica fundido permite uma análise mais robusta 10. Os dados anatómicas também pode ser utilizado para proporcionar conhecimento anterior, tais como a forma exterior do rato, o que é importante para a modelação exacta óptica e fluorescência reconstrução 11. Além disso, os mapas de dispersão e de absorção óptica pode ser estimada utilizando a segmentação dos tipos de tecido e através da atribuição de coeficientes específicos de classe 12,13. Para luz infravermelha, a hemoglobina é o principal absorvedor em camundongos, além de melanina e pele 14. Uma vez que o volume de sangue relativa varia regionalmente por ordens de magnitude, um mapa de absorção é particularmente importante para quanquan- fluorescência reconstrução 13. Uma vantagem da utilização de dispositivos de imagem não invasivas é que os ratinhos podem ser visualizados longitudinalmente, isto é, em vários pontos de tempo. Isso é importante para avaliar o comportamento dinâmico de sondas, ou seja, a sua acumulação alvo, biodistribuição e excreção 10,15, ou para avaliar a progressão da doença 16. Quando imagiologia de vários ratinhos em vários pontos de tempo, uma grande quantidade de conjuntos de dados de imagem se levanta. Para ativar a comparabilidade, estes devem ser adquiridos de forma sistemática, ou seja, com um protocolo bem definido e documentado. O grande número de verificações, representa um desafio para a análise de imagem, que é necessária para extrair as medições quantitativas a partir dos dados da imagem. O objetivo do nosso estudo é fornecer uma descrição detalhada de um protocolo de imagem μCT-FMT que foi usado e aperfeiçoado ao longo de vários estudos 10,13,15,17,18. Nós descrevemoscomo os conjuntos de dados são gerados, processada, visualizada e analisada. Isto é demonstrado usando uma sonda molecular estabelecido, OsteoSense, que se liga a hidroxiapatita 19, e pode ser usada para doenças do osso e remodelação imagem 2. Todos os procedimentos que envolvem animais foram aprovados pelo comitê de revisão governamental sobre cuidados com animais.

<table><tbody><tr><td>FMT (Tomografia molecular de fluorescência) FMT2500 LX</td><td>PerkinElmer</td><td>FMT2000</td><td>Dispositivo para tomografia molecular de fluorescência</td></tr><tr><td>&micro; Tomoscópio (microtomografia computadorizada) Tomoscópio Duo</td><td>CT Imaging GmbH</td><td>Tomoscópio Duo</td><td>Dispositivo para microtomografia computadorizada</td></tr><tr><td>Cama multimodal para camundongos</td><td>CT Imaging GmbH</td><td>Construtor experimental</td><td>Suporte para animais parcialmente transparente</td></tr><tr><td>IsoFlo (isoflurano, USP)</td><td>Abbott</td><td>05260-05</td><td>Isoflurano Anestesia por inalação</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia para pequenos animais</td><td>Aparelho Harvard</td><td>726419</td><td>Sistema completo de mesa de isoflurano</td></tr><tr><td>Alimento para camundongos sem clorofila</td><td>Ssniff</td><td>E15051</td><td>alimento com baixa clorofila / baixa fluorescência</td></tr><tr><td>OsteoSense 750EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10053EX</td><td>Animal Agente de contraste FMT</td></tr><tr><td>Portex Tubo de polietileno de furo fino</td><td>Smith medical</td><td>800/100/120</td><td>para cateter de injeção</td></tr><tr><td>Sterican 30g</td><td>BBraun</td><td>4656300</td><td>Agulha hipodérmica para cateter</td></tr><tr><td>Imeron</td><td>Altana pharma</td><td>INLA F.1/0203/3.5337.69</td><td>Agente de contraste CT para as inclusões fantasmas</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>90-12-36-6</td><td>Agarose para produção fantasma</td></tr><tr><td>TiO2</td><td>Applichem</td><td>A1900,1000</td><td>Óxido de titânio como agente dispersor fantasma</td></tr><tr><td>Azul de tripano Azul de tripano</td><td>Fluka</td><td>93595</td><td>Azul de tripano para ajustar a luz fantasma propagação</td></tr><tr><td>Cy7</td><td>Lumiprobe</td><td>15020</td><td>Fluorocromo para as inclusões fantasmas</td></tr><tr><td>Lipovenoes 20%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3094740</td><td>Emulsão lipídica, agente dispersante para agentes de contraste FMT</td></tr><tr><td>Definiens Developer XD Server</td><td>Definiens AG</td><td>Server XD</td><td>Plataforma de software para segmentação automatizada</td></tr><tr><td>Imalytics Preclinical</td><td>ExMI/Gremse-IT</td><td>Versão 2.0.1</td><td>Software para fusão, reconstrução e análise</td></tr><tr><td>de imagens NVIDIA Geforce Titan</td><td>Asus</td><td>GTXTITAN6GD5</td><td>Placa gráfica de computador de última geração, 6 GB de memória</td></tr></tbody></table>

híbrido de imagem μct-fmt e análise de imagem

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Tomografia mediada por fluorescência (FMT) permite a determinação quantitativa longitudinal e da distribuição de fluorescência in vivo e pode ser utilizado para avaliar a biodistribuição de novas sondas e para avaliar a progressão da doença, utilizando sondas moleculares estabelecidas ou genes repórter. A combinação com uma modalidade anatómica, por exemplo, tomografia computadorizada micro (μCT), é benéfico para a análise de imagens e de reconstrução de fluorescência. Nós descrevemos um protocolo para multimodal imagem μCT-FMT incluindo as etapas de processamento de imagem necessários para extrair medidas quantitativas. Depois de preparar os ratos e executar a imagem latente, os conjuntos de dados multimodais são registrados. Subsequentemente, uma melhor reconstrução de fluorescência é realizada, o que leva em conta a forma do rato. Para a análise quantitativa, segmentações de órgãos são geradas com base nos dados anatómicas utilizando a ferramenta de segmentação interactivo. Finalmente, o Cu biodistribuiçãorves são gerados usando um recurso de processamento em lote. Mostramos a aplicabilidade do método de avaliar a biodistribuição de uma sonda bem conhecida que se liga aos ossos e articulações.

Aplicou-se o protocolo descrito para avaliar a biodistribuição de uma sonda, OsteoSense alvo, que se liga a hidroxiapatita. 3 ratinhos (C57BL / 6 ApoE - / - Ahsg - / - ratos knockout duplas, 10 semanas de idade) foram fotografadas antes e 15 minutos, 2 h, 4 h, 6 h e 24 h após injecção intravenosa de 2 nmol OsteoSense. O nosso software detectado automaticamente os marcadores construídas no leito rato multimodal (Figura 1, Figura 2A, B), o que permitiu a fusão dos dados μCT anatómicas com a reconstrução da fluorescência realizada pela FMT (Figura 2C, D). Desde OsteoSense é uma sonda com um baixo peso molecular, uma rápida excreção renal e, por conseguinte, o sinal de alta na bexiga urinária é esperado. Fusão de fluorescência a reconstrução da FMT revelaram problemas tais como sinal deslocado fora da bexiga (Figura 2C, D). Esses problemas ocorrem porque a FMT não sabe a verdadeira forma do mouse e assume uma forma de bloco. Our reconstrução determina a forma exacta dos dados e gera μCT dispersão e absorção mapeia 13, a fim de permitir uma reconstrução de fluorescência mais precisa com uma melhor localização do sinal, que é particularmente evidente para a bexiga (Figura 2E, F). Para atribuir a fluorescência reconstruída para regiões apropriadas, nós interativamente segmentado vários órgãos que utilizam nosso software (Figura 3). Para cada um dos 18 varreduras, 7 regiões foram segmentadas com base nos dados μCT, isto é., Coração, pulmão, fígado, rins, da coluna, do intestino e da bexiga. Subsequentemente, o software foi utilizado para calcular a concentração de fluorescência média para cada uma das regiões 126. Felizmente, o software fornece um modo de lote, que calcula todos os valores e os salva em uma única planilha. Para visualizar a distribuição de fluorescência, de desenhos em 3D foram gerados para cada ponto de tempo,usando a configuração de janelas comparável (Figura 4A-F). Utilizando os valores quantificados de órgãos, a biodistribuição foi calculado pela média dos valores durante os três órgãos ratinhos (Figura 4G). Os exames pré, adquiridos antes da injeção, mostrou sinal de fundo insignificante. 15 min após a injecção, o sinal mais forte apareceu na bexiga urinária, devido à rápida excreção renal. Nos pontos de tempo subsequentes, a sonda restante tinha acumulado em ossos e articulações. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig1.jpg" /> Figura 1. Multimodal Rato Bed. (A) A cama multimodal rato contém duas placas de vidro acrílico que firmemente segurar o mouse. O aperto é ajustado através de dois parafusos. A cama do mouse contém marcadores (buracos vazios) para a fusão de imagens. Gás anestésico é fornecido através de um tubo flexível que é fixado com tmacaco. (B) A cama do rato está ligado a um suporte de metal e mantido no centro do pórtico μCT rotativa. (C) evitar um hiato entre a cama do mouse, o titular do metal, porque, caso contrário, os marcadores podem ser incorretamente atribuído levando a fusão incorreta. O tubo do gás anestésico deve ser ligado ao conector do tubo. (D) A cama do rato deverá ser inserido na parte da frente com FMT primeiro para permitir uma fusão automatizado correcta. (E) Os marcadores são visíveis para a câmera FMT, que é usado para a detecção do marcador automatizado e de fusão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem de fusão e reconstrução. (A, B) Marcadores e a forma exterior do mouse é determinado pelo algoritmo de segmentação automatizado. (C, D) 15 min após a injecção de OsteoSense, uma quantidade considerável de a sonda já foi excretado para dentro da bexiga urinária. Após a fusão da reconstrução fornecido pelo fabricante com os dados μCT, os problemas tornam-se visíveis. A maior parte do sinal aparece em torno da bexiga, mas não dentro da bexiga e alguns mesmo sinal aparece no ar. Isso acontece porque a FMT assume um mouse em forma de bloco. (E, F) Nossa melhorada reconstrução de fluorescência, usando a forma do rato derivada dos dados μCT, resulta em melhor localização da fluorescência dentro da bexiga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig3.jpg" /> Figura 3. Órgão interactivo Segmentat. ion (A) Para quantificar a distribuição de fluorescência, vários órgãos são segmentadas: coração (vermelho), pulmão (rosa), fígado (marrom), estômago (bege), coluna vertebral (roxo), rins (amarelo), intestino (verde) e bexiga urinária (ouro). (B) O pulmão, o que é fortemente contrastada em comparação com o tecido circundante, é segmentada com limite de enchimento e região. (C) Adesivo órgãos, tal como a bexiga, rins, coração e são segmentados usando &quot;rabiscos&quot;. (D) Os órgãos com uma forma mais complexa, por exemplo, fígado e estômago são segmentadas incrementalmente utilizando rabiscos. Para segmento da coluna vertebral, um limiar alto é aplicado ao segmento de todos os ossos. Em seguida, alguns ossos, por exemplo., As costelas, são cortados, até a coluna vertebral permanece. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 4. A biodistribuição. Para avaliar a biodistribuição, os ratinhos são verificados em vários pontos temporais (AF). (A) O exame de pré, antes da injecção, mostra pouco sinal de fundo no canal de 750 nm. (B) 15 min após a injecção, uma quantidade considerável de a sonda já está na bexiga urinária. (C) No ponto de tempo de 2 h, o rato tinha urinou, o que resulta em alguma fluorescência fora do rato. Em pontos de tempo posteriores (DF), o sinal aparece predominantemente nos ossos e articulações, isto é., A coluna vertebral e os joelhos. (G) A concentração de fluorescência quantificado é mostrado para órgãos seleccionados.

Descrevemos um protocolo para imagem híbrida, combinando tomografia mediada por fluorescência (FMT) com microtomografia computadorizada (μCT). Após a fusão e reconstrução, realizamos segmentação interativa de órgãos para extrair medições quantitativas da distribuição de fluorescência.

Híbrido de imagem μCT-FMT e análise de imagem

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

A tomografia mediada por fluorescência é uma técnica de imagem altamente sensível para avaliar quantitativamente a distribuição da fluorescência. Em camundongos anestesiados, muitas sondas fluorescentes direcionadas estão disponíveis, permitindo a visualização de angiogênese, apoptose, inflamação e outros processos. Neste vídeo, mostraremos como a imagem híbrida com FMT e Micro City é realizada em nosso instituto.No capítulo um, os dispositivos, este é o nosso F-M-T-F-M-T, que significa tomografia molecular por fluorescência. Tomografia significa que são geradas imagens tridimensionais. A TMO é altamente sensível para a obtenção de imagens de fluorescência intrínseca em camundongos.Agora, o painel frontal está aberto para mostrar o interior do FMT. Na parte inferior, há um laser montado em um servo 2D. O laser emite luz para dentro do camundongo, que é mantido em uma caminha parcialmente transparente para camundongos.Acima da cama do camundongo, há um arranjo de LEDs como fonte de luz alternativa, o que permite que a TFM opere como um dispositivo de imagem de reflexão comum. A roda de filtros é montada abaixo da lente, que capta a luz para o detector na parte superior do dispositivo. Este é o nosso micro TC.O micro-TC é equipado com dois tubos de raios X e dois detectores de painel plano, o que permite a aquisição de varreduras de dupla energia. Capítulo dois, protocolo de varredura de micro-TC com FMT. Tanto a FMT quanto o micro-TC são projetados para imagear camundongos; antes da imagem, os camundongos são anestesiados com isoflurano.Para a varredura por FMT, os pelos do camundongo precisam ser removidos, o que funciona bem com o creme de depilação. Algumas linhagens de camundongos podem desenvolver erupções cutâneas devido ao creme depilatório. Portanto, recomenda-se monitorar os camundongos quanto a alterações na pele e entrar em contato com a equipe veterinária para cuidados, se necessário.Além disso, teste a tolerância em um pequeno lote de qualquer nova linhagem de camundongos no início. Para evitar hipotermia, o camundongo é colocado sobre uma placa aquecida. Para injetar o agente de contraste, um cateter é inserido na veia da cauda devido ao seu pequeno tamanho.Isso é bastante difícil e requer alguma experiência. Se o sangue retornar ao cateter, significa que ele está corretamente posicionado através do cateter. Agentes de contraste fluorescentes e agentes de contraste para tomografia computadorizada podem ser injetados para evitar sobrecarga de volume.No máximo, deve-se injetar cinco mililitros por quilograma de peso corporal, o que equivale a 150 microlitros para um camundongo de 30 gramas. Para a varredura, o camundongo é colocado dentro de uma maca multimodal para camundongos.O rato pode ter alguns símbolos desenhados na cauda para identificação. É importante evitar tais elementos no tronco, pois podem afetar a varredura óptica. A cama do rato é fechada e a profundidade é ajustada para segurar firmemente o animal em uma posição fixa.Seja cuidadoso e monitore a respiração, pois apertar muito a cama pode sufocar o camundongo. Camundongos nus são comumente usados em pesquisas oncológicas devido à sua imunossupressão. O fato de serem nus é um efeito colateral favorável da mutação genética.Portanto, o trabalhoso procedimento de remoção de pelos pode ser omitido. Deve-se verificar se o camundongo está respirando adequadamente, e, se necessário, o leito do camundongo deve ser ajustado conforme necessário. Em seguida, o leito do camundongo é colocado dentro do micro-CT.Os tubos que transportam o gás de flúor ISO são comutados para manter o fluxo de gás no interior do dispositivo. Em seguida, o micro C é fechado para ativar o blindagem de raios X. O micro C só iniciará a varredura se a tampa estiver fechada.Usando os botões do micro-TC, o rato pode ser movido para dentro do micro-TC. No computador de controle do micro-TC, é adquirido um topograma e exibido, sendo os ajustes de janela ajustados para visualizar melhor o rato. Um ou mais cortes ZUP podem ser posicionados. Suas posições são indicadas pelas regiões em azul claro.Normalmente, um a três varreduras ZUP são suficientes. Após iniciar a varredura, o progresso é indicado por barras de progresso azul-escuras. Nosso microtomógrafo de painel plano realiza as varreduras ZUP sequencialmente, o que difere de um CT espiral clínico.Usando os botões, a cama do camundongo é movida para a frente. Novamente, a tampa de proteção é aberta e os tubos anestésicos são trocados. O suporte é cuidadosamente removido da cama do camundongo e o tubo anestésico é puxado para fora.Isso é necessário porque o AN e o FMT não dependem deste pequeno tubo. Em vez disso, a pequena câmara interna do FMT é inundada com gás anestésico. Agora, a plataforma para camundongo com o animal é levada até o FMT e inserida no computador de controle do FMT.O campo de visão da varredura é ajustado, assim como a densidade de amostragem. Geralmente, são utilizados cerca de 120 pontos. A varredura inicia após pressionar um botão.A primeira passagem da TFM adquire uma imagem de transiluminação ou excitação para cada ponto fonte do laser. Neste vídeo, ela é mostrada em modo de avanço rápido. Normalmente, leva cerca de cinco minutos.Pode-se observar que muito menos luz atravessa a parte superior do corpo em comparação com a parte inferior. Isso ocorre porque os órgãos com maior volume sanguíneo relativo, como coração, fígado e rins, estão mais concentrados na parte superior do corpo. O sangue é o principal absorvedor da luz infravermelha próxima.As segundas execuções do mesmo conjunto de pontos-fonte utilizam um filtro diferente, que permite apenas a passagem da luz fluorescente, Capítulo três, óleo interativo e segmentação. Para fundir os dados provenientes de ambos os dispositivos, são utilizados marcadores, que estão integrados na camada do rato.Os marcadores também são visíveis em uma imagem de reflexão adquirida pelo FMT. Os marcadores são na verdade orifícios simples e não precisam ser preenchidos com nenhum agente fluorescente ou de contraste para tomografia computadorizada. Em nosso instituto, desenvolvemos um programa de software que realiza a detecção dos marcadores e a fusão de forma automática.A forma do camundongo, bem como os mapas heterogêneos de absorção e espalhamento, são estimadas automaticamente utilizando os dados de micro-TC conforme descrito em nossa publicação recente na Theranostics. Esses parâmetros são importantes para a reconstrução quantitativa da fluorescência. Para medir a biodistribuição da fluorescência, é necessária uma segmentação dos órgãos.Nós geramos tal segmentação de forma interativa usando um software chamado imulitic preclinical desenvolvido em nosso instituto a seguir. Uma segmentação desse tipo é mostrada em avanço rápido e uma pessoa experiente pode realizá-la em cerca de 10 a 20 minutos. Primeiro, o conjunto de dados de TC é carregado.Pode ser inspecionado em 3D utilizando uma renderização de superfície ISO. Ao alterar as configurações de janela, o valor ISO pode ser modificado. Por exemplo, para visualizar os ossos de todo o corpo do camundongo com a caminha do camundongo, então a sobreposição é carregada.O sinal deste exemplo aparece na bexiga. Agora a visualização sobreposta está desativada. Para concentrar-se na segmentação anatômica.Nas microtomografias nativas, o pulmão é facilmente identificado devido ao forte contraste negativo em relação aos outros tecidos moles. A grande estrutura no interior do pulmão é o coração. Vamos segmentar o pulmão primeiro.Todos os vóxeis abaixo de um determinado valor são segmentados usando limiarização. Isso aparece em verde. O pulmão é uma região conectada, que pode ser separada usando uma operação de preenchimento.Semelhante ao balde de tinta em um programa de pintura, pode-se separar o órgão pulmonar recortando e preenchendo. Órgãos convexos, como a bexiga, podem ser segmentados desenhando rabiscos para delimitar as bordas do órgão.Mais rabiscos são adicionados até que uma precisão suficiente seja alcançada. Órgãos não convexos, como o intestino, podem ser segmentados pedaço por pedaço. O fígado aparece como uma região homogênea e possui uma estrutura mais complexa.Como é composto por múltiplos lobos, a segmentação pode ser salva em disco e carregada no programa. Utilizando essa segmentação, o sinal fluorescente pode ser atribuído aos órgãos. O programa calcula essas quantidades e as salva como uma planilha adicional. Para exames longitudinais, a segmentação precisa ser realizada novamente para cada ponto temporal, pois os intervalos geralmente são muito longos para manter o camundongo anestesiado em uma posição fixa.Portanto, a segmentação é uma tarefa trabalhosa se muitos camundongos e muitos pontos temporais estiverem envolvidos. Para quantificar os resultados, carregue uma sobreposição e uma segmentação. Clique em Definir configurações de lote para permitir que o programa lembre as configurações atuais.Agora, clique em estatísticas por lote para instruir o programa a calcular os valores para todas as regiões em todos os escaneamentos micro-TC FMT. Isso levará alguns segundos. Em seguida, as estatísticas são salvas em um único arquivo de planilha.Isso é conveniente porque o usuário não precisa mesclar dezenas de arquivos por conta própria. Com base neste arquivo, as curvas do órgão podem ser calculadas. Capítulo quatro, resultados representativos.Para testar se a fusão funciona corretamente, utilizamos um fantasma de aros. Algum pó de óxido de titânio foi adicionado para causar espalhamento. Para obter uma forma irregular, removemos algumas partes.Várias pequenas inclusões preenchidas com agente fluorescente e agente de contraste de TC foram incorporadas ao fantoma. Como a TFM não conhece a forma real do objeto e assume uma forma simplificada, a reconstrução não é precisa para objetos com formas irregulares. Por isso, implementamos outra reconstrução que utiliza a forma derivada dos dados de micro tomografia.Como você pode ver, a localização do sinal no fantoma é muito melhor. Para inspecionar os dados in vivo, vamos analisar os pontos temporais de aquisição. Esta é a pré-aquisição.O que vemos é basicamente apenas ruído e artefatos. Se avançarmos para o próximo ponto temporal, aquele após a injeção, observamos um sinal muito maior, mas as configurações de janelamento estão muito inadequadas. Usando a caixa de diálogo de janelamento, você pode ajustar as configurações de janelamento.Observamos a maior parte do sinal na bexiga. Se avançarmos para o próximo momento, 0,2 horas após a injeção, vemos algum sinal fora do camundongo. Isso ocorre porque o camundongo urinou a fluorescência sobre a cama do animal.Ao ajustar ainda mais o janelamento, podemos observar um sinal na coluna vertebral e nos joelhos. Agora, vamos para o tempo de 0,4 horas após a injeção, quando o sinal proveniente da urina já desapareceu e observamos fluorescência na coluna vertebral e nos joelhos nos próximos pontos temporais, seis horas e 24 horas após a injeção. Observamos o mesmo padrão.Agora vamos passar para o próximo nariz. A pré-varredura não mostra nada usando essas configurações de janela. A varredura 15 minutos após a injeção mostra um sinal intenso na bexiga e assim por diante.Neste estudo, observamos altas concentrações na bexiga urinária logo após a injeção, em decorrência da rápida excreção renal desta sonda. Além disso, o sinal na coluna vertebral aumenta rapidamente e permanece relativamente estável ao longo dos pontos de tempo subsequentes de aquisição de imagens. Capítulo cinco, conclusão.Em conclusão, apresentamos um protocolo de imagem multimodal que combina as vantagens da tomografia por fluorescência, tomografia molecular e microtomografia computadorizada. Os dados anatômicos de micro-TC permitem uma reconstrução melhorada da fluorescência ao utilizar a forma do camundongo. Além disso, é útil para gerar segmentações de órgãos, necessárias para extrair medidas quantitativas dos dados de imagem.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

De contraste de imagem melhorada navio pequeno animal por microCT é uma resposta rápida, técnica de baixo custo e alto rendimento para a...

Contraste de imagem aprimorada navio usando MicroCT

Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia micro computadorizada (TC).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Alta resolução de raios-X de tomografia computadorizada (PCA), é um não-destrutiva técnica de imagiologia de diagnóstico que pode ser utilizada para estudar a estrutura e função dos vasos de plantas em 3D. Demonstramos como TCAR facilita a exploração de redes de xilema através de uma ampla variedade de tecidos e espécies vegetais.

Usando tomografia de tórax para visualizar a estrutura tridimensional e Função da Usina Vasculatura

Combinado imagiologia óptica e μCT num modelo de rato com infecção de implante ortopédico, utilizando uma estirpe bioluminescente engenharia de Staphylococcus aureus, desde a capacidade de forma não invasiva e longitudinalmente controlar a dinâmica da infecção bacteriana, assim como a resposta inflamatória correspondente e alterações anatómicas na osso.

Combinado<em&gt; In vivo</em&gt; Optical e μCT imagem para monitorar infecções, inflamações, and Bone Anatomy em uma infecção Orthopaedic Implant em Ratos

Este método descreve o uso da Microtomografia Computadorizada Quântica (MicroCT) para avaliar a morfologia, função, perfusão, metabolismo e viabilidade cardíaca com contraste iodado em camundongos com isquemia miocárdica induzida experimentalmente. A técnica pode ser aplicada para imagens longitudinais in vivo não destrutivas de alto rendimento de vários modelos animais de doenças cardíacas humanas.

In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

O objetivo deste estudo foi melhorar o registo co para fusão de imagem (IF) de pre-intervencionistas dados de CT com fluoroscopia de raio-x em tempo real (XR) durante a implantação de válvula aórtica percutânea transfemoral (TAVI).

Melhorou o registo de 3D CT angiografia com fluoroscopia de raio-x para fusão de imagem durante a implantação de válvula aórtica percutânea

Analisamos a cinemática articular a partir de dados de tomografia computadorizada quadridimensional. O método sequencial de registro 3D-3D fornece semiautomaticamente a cinemática do osso em movimento com relação ao osso sujeito a partir de dados de tomografia computadorizada quadridimensionais.

Análise de TC quadridimensional usando registro 3D-3D sequencial

O programa de resposta ao encalhe de cetáceos de Hong Kong incorporou a tomografia computadorizada pós-morte, que fornece informações valiosas sobre a saúde biológica e o perfil dos animais falecidos. Este estudo descreve 8 técnicas de renderização de imagens essenciais para a identificação e visualização de achados pós-morte em cetáceos encalhados, o que ajudará médicos, veterinários e pessoas de resposta encalhadas em todo o mundo a utilizar plenamente a modalidade radiológica.

Técnicas de Renderização de Imagens em Tomografia Computadorizada Pós-Morte: Avaliação da Saúde Biológica e Perfil em Cetáceos Encalhados

Este protocolo apresenta uma coleção de dados geométricos sarcomere, cálcio e macroscópico de uma trabecula cardíaca ex vivo. Essas medidas simultâneas são possíveis pela integração de três modalidades de imagem.

Brightfield simultâneo, Fluorescência e Imagem Tomográfica de Coerência Óptica de Contrair Trabeculae Cardíaca Ex Vivo

A angiografia dinâmica computada (CTA) fornece valor diagnóstico adicional na caracterização do endoleaks aórtico. Este protocolo descreve uma abordagem qualitativa e quantitativa usando a análise da curva de atenuação do tempo para caracterizar o endoleaks. A técnica de integração de imagens CTA dinâmicas com fluoroscopia usando fusão de imagem 2D-3D é ilustrada para melhor orientação de imagem durante o tratamento.

Angiografia de tomografia computadorizada dinâmica e resolvida por tempo para caracterização de endoleaks aórticos e orientação de tratamento via 2D-3D Fusion-Imaging

Aprenda a realizar imagem híbrida μCT-FMT em camundongos anestesiados para quantificar distribuição de fluorescência. Este protocolo integra tomografia por fluorescência e micro CT para análise de processos biológicos em neurociência.

Híbrido de imagem μCT-FMT e análise de imagem

Explorar mais vídeos