Híbrido de imagem μCT-FMT e análise de imagem

Descrevemos um protocolo para imagem híbrida, combinando tomografia mediada por fluorescência (FMT) com microtomografia computadorizada (μCT). Após a fusão e reconstrução, realizamos segmentação interativa de órgãos para extrair medições quantitativas da distribuição de fluorescência.

A tomografia mediada por fluorescência é uma técnica de imagem altamente sensível para avaliar quantitativamente a distribuição de fluorescência. Em camundongos anestesiados, muitas sondas fluorescentes direcionadas estão disponíveis, o que permite imagens de angiogênese, apoptose, inflamação e outros. Neste filme, mostraremos como a imagem híbrida com FMT e Micro City é realizada em nosso instituto.

No capítulo um, os dispositivos, este é o nosso F-M-T-F-M-T significa tomografia molecular de fluorescência. Tomografia significa que imagens 3D são geradas. O FMT é altamente sensível para imagens de fluorescência quase inata em camundongos.

Agora o painel frontal é aberto para mostrar o interior do FMT. Na parte inferior está um laser montado em um servidor 2D. O laser emite luz para o mouse, que é mantido em uma cama de mouse parcialmente transparente.

Acima da cama do mouse há uma série de LEDs como fonte de luz alternativa, o que permite que o FMT opere como um dispositivo de imagem de refletância regular. A roda do filtro é montada abaixo da lente, que captura a luz para o detector na parte superior do dispositivo. Este é o nosso micro ct.

O micro CT é equipado com dois tubos de raios-x e dois detectores de tela plana, que permitem a aquisição de varreduras de energia dupla. Capítulo dois, protocolo de varredura micro CT FMT. Tanto o FMT quanto a micro CT são construídos para obter imagens de camundongos antes que os camundongos sejam anestesiados com flúor isof.

Para a varredura FMT, o cabelo do rato precisa ser removido, o que funciona bem com o creme de arenque. Algumas cepas de camundongos podem desenvolver erupções cutâneas com o creme deha. Portanto, é recomendável monitorar os camundongos quanto a alterações na pele e entrar em contato com a equipe veterinária para cuidados, se necessário.

Além disso, teste a tolerância em um pequeno lote de novas cepas de camundongos para começar. Para evitar hipotermia, o mouse é colocado em uma almofada de aquecimento. Para injetar agente de contraste, um cateter é colocado na veia da cauda devido ao tamanho pequeno.

Isso é bastante difícil e requer alguma experiência. Se o sangue fluir de volta para o cateter, ele será colocado corretamente através do cateter. Agentes de contraste fluorescentes e agentes de contraste de TC podem ser injetados para evitar sobrecarga de volume.

no máximo. Cinco mililitros por quilograma de peso corporal devem ser injetados, o que significa 150 microlitros para um camundongo de 30 gramas. Para digitalização, o mouse é colocado dentro de uma cama de mouse multimodal.

O rato pode ter alguns símbolos desenhados na cauda para identificação. É importante evitar essas coisas no tronco, pois isso pode afetar a varredura óptica. A cama do mouse é fechada e a profundidade ajustada para segurar firmemente o mouse em uma posição fixa.

Tenha cuidado e monitore a respiração, pois apertar demais a cama pode sufocar o mouse. Camundongos nus são comumente usados para pesquisas oncológicas devido à sua imunossupressão. O fato de estarem nus é um efeito colateral feliz da mutação genética.

Portanto, o trabalhoso procedimento de depilação pode ser omitido. Deve-se verificar se o mouse respira corretamente e, se necessário, a cama do mouse deve ser ajustada de acordo. Em seguida, a cama do rato é colocada dentro do micro ct.

Os tubos que transportam o gás flúor ISO são comutados para manter o fluxo de gás dentro do dispositivo. Em seguida, o micro C é fechado para permitir a blindagem de raios-X. O micro C só iniciará a digitalização se a tampa estiver fechada.

Usando os botões do micro ct, o mouse pode ser conduzido para o micro CT.At computador de controle da micro cidade, um topo Uma ou mais varreduras ZUP podem ser colocadas. Sua posição é indicada pelas regiões azuis claras.

Normalmente, uma a três varreduras ZUP são suficientes. Depois de iniciar a verificação, o progresso é mostrado com barras de progresso azuis escuras. Nossa microtomografia computadorizada de tela plana faz varreduras ZUP posteriormente, o que é diferente de uma tomografia computadorizada espiral clínica.

Usando os botões, a cama do mouse é movida para a frente. Novamente, a tampa de blindagem é aberta e os tubos anestésicos são trocados. O suporte é cuidadosamente removido da cama do mouse e o tubo anestésico é puxado para fora.

Isso é necessário porque o AN e o FMT não dependem desse pequeno tubo. Em vez disso, a pequena câmara dentro do FMT é inundada com gás anestésico. Agora a cama do mouse com o mouse é trazida para o FMT e inserida no computador de controle do FMT.

O campo de visão de varredura é ajustado, bem como a densidade de amostragem. Normalmente, cerca de 120 pontos são usados. A varredura começa depois de pressionar um botão.

A primeira passagem do FMT adquire uma imagem de iluminação trans ou excitação para cada ponto da fonte de laser. Neste filme, ele é mostrado no modo de avanço rápido. Geralmente leva cerca de cinco minutos.

Você pode ver que muito menos luz passa pela parte superior do corpo em comparação com a parte inferior do corpo. Isso ocorre porque os órgãos com maior volume relativo de sangue, como coração, fígado e rins, estão mais na parte superior do corpo. O sangue é o principal absorvedor da luz infravermelha próxima.

A segunda passagem é executada dos mesmos pontos de origem com um filtro diferente, que só permite que a luz fluorescente passe pelo Capítulo três, óleo interativo e segmentação. Para fundir os dados de ambos os dispositivos. Marcadores são usados, que são embutidos na cama do rato.

Os marcadores também são visíveis em uma imagem de reflexão adquirida pelo FMT. Os marcadores são, na verdade, orifícios simples e não precisam ser preenchidos com nenhum agente de contraste de fluorescência ou TC. Em nosso instituto, desenvolvemos um programa de software que realiza a detecção e fusão de marcadores automaticamente.

A forma do camundongo, bem como os mapas heterogêneos de absorção e espalhamento, são estimados automaticamente usando os dados de micro CT, conforme descrito em nossa recente publicação Theranostics. Esses parâmetros são importantes para a reconstrução quantitativa por fluorescência. Para medir a biodistribuição da fluorescência, é necessária uma segmentação de órgãos.

Geramos essa segmentação de forma interativa usando um software chamado imulitic preclinical desenvolvido em nosso instituto a seguir. Essa segmentação é mostrada em avanço rápido e uma pessoa experiente pode realizá-la em cerca de 10 a 20 minutos. Primeiro, o conjunto de dados CT é carregado.

Ele pode ser inspecionado em 3D usando uma renderização de superfície ISO. Ao alterar as configurações de janelas, o valor ISO pode ser alterado. Por exemplo, para visualizar ossos de todo o corpo do mouse com a cama do mouse, a sobreposição é carregada.

O sinal para este exemplo aparece na bexiga. Agora a visualização de sobreposição está desativada. Concentrar-se na segmentação anatômica.

Em exames de micrómetros nativos, o pulmão é facilmente encontrado devido ao forte contraste negativo com os outros tecidos moles. A grande estrutura dentro do pulmão é o coração. Vamos segmentar o pulmão primeiro.

Todos os voxels abaixo de um determinado valor são segmentados usando limites. Isso aparece como verde. O pulmão é uma região conectada, que pode ser separada usando uma operação de preenchimento.

Semelhante ao balde de tinta. Em um programa de pintura, eles podem ser separados do pulmão por corte e enchimento. Órgãos convexos, como a bexiga, podem ser segmentados desenhando rabiscos para delinear as bordas do órgão.

Mais rabiscos são adicionados até que uma precisão suficiente seja alcançada. Órgãos não convexos, como o intestino, podem ser segmentados peça por peça. O fígado aparece como uma região homogênea e tem uma estrutura mais complexa.

Como consiste em vários lóbulos, a segmentação pode ser salva no disco e carregada no programa. Usando essa segmentação, o sinal fluorescente pode ser atribuído aos órgãos. O programa calcula esses valores e os salva como uma folha extra para varreduras longitudinais, a segmentação precisa ser realizada para cada ponto de tempo novamente, porque os intervalos geralmente são muito longos para manter o mouse anestesiado em uma posição fixa.

Portanto, a segmentação é uma tarefa trabalhosa se muitos mouses e muitos pontos de tempo estiverem envolvidos. Para quantificar os resultados, carregue uma sobreposição e uma segmentação. Clique em definir configurações de lote para permitir que o programa se lembre das configurações atuais.

Agora, clique em estatísticas de lote para dizer ao programa para calcular os valores de todas as regiões em todas as varreduras de micro CT FMT. Isso levará alguns segundos. Em seguida, as estatísticas são salvas em um arquivo de planilha.

Isso é conveniente porque o usuário não precisa mesclar dezenas de arquivos sozinho. Com base neste arquivo, as curvas dos órgãos podem ser calculadas. Capítulo quatro, resultados representativos.

Para testar se a fusão funciona corretamente, usamos um fantasma de aros. Um pouco de pó de exídeo de titânio foi adicionado para dispersão. Para realizar uma forma irregular, cortamos algumas partes.

Várias pequenas inclusões preenchidas com fluorescência e agente de contraste de TC foram incorporadas ao simulador. Como o FMT não conhece a verdadeira forma do objeto e assume uma forma simplificada, a reconstrução não é precisa para objetos com formas irregulares. Portanto, implementamos outra reconstrução que usa a forma derivada dos dados da microcidade.

Como você pode ver, a localização do sinal no fantasma é muito melhor. Para inspecionar os dados in vivo, vamos examinar os pontos de tempo da imagem. Esta é a pré-verificação.

O que vemos é basicamente apenas ruído e artefatos. Se formos para o próximo ponto de tempo, aquele após a injeção, vemos muito mais sinal, mas as configurações de janela são muito difíceis. Usando a caixa de diálogo de janelas, você pode ajustar as configurações de janelas.

Vemos a maior parte do sinal na bexiga. Se formos para a próxima vez, 0,2 horas após a injeção, vemos algum sinal fora do mouse. Isso ocorre porque o rato urinou a fluorescência na cama do rato.

Ajustando ainda mais a janela, podemos ver algum sinal na coluna e nos joelhos. Agora vamos ao tempo 0,4 horas após a injeção, o sinal da urina desapareceu agora e vemos fluorescência na coluna e nos joelhos para os próximos pontos de tempo seis horas e 24 horas após a injeção. Nós vemos o mesmo.

Agora vamos para o próximo nariz. A pré-verificação não mostra nada usando essas configurações de janela. A varredura 15 minutos após a injeção mostra um forte sinal da bexiga e assim por diante.

Neste estudo, encontramos altas concentrações na bexiga urinária logo após a injeção, como consequência da rápida excreção renal dessa sonda. Além disso, o sinal na coluna aumenta rapidamente e permanece relativamente estável ao longo dos pontos de tempo de imagem posteriores. Capítulo cinco, conclusão.

Em conclusão, mostramos um protocolo de imagem multimodal para combinar os pontos fortes da fluorescência, tomografia molecular e tomografia microcomputadorizada. Os dados anatômicos da micro TC permitem uma reconstrução de fluorescência aprimorada usando a forma do camundongo. Além disso, é útil gerar segmentações de órgãos, que são necessárias para extrair medições quantitativas dos dados da imagem.