Híbrido de imagem μCT-FMT e análise de imagem

A tomografia mediada por fluorescência é uma técnica de imagem altamente sensível para avaliar quantitativamente a distribuição da fluorescência. Em camundongos anestesiados, muitas sondas fluorescentes direcionadas estão disponíveis, permitindo a visualização de angiogênese, apoptose, inflamação e outros processos. Neste vídeo, mostraremos como a imagem híbrida com FMT e Micro City é realizada em nosso instituto.

No capítulo um, os dispositivos, este é o nosso F-M-T-F-M-T, que significa tomografia molecular por fluorescência. Tomografia significa que são geradas imagens tridimensionais. A TMO é altamente sensível para a obtenção de imagens de fluorescência intrínseca em camundongos.

Agora, o painel frontal está aberto para mostrar o interior do FMT. Na parte inferior, há um laser montado em um servo 2D. O laser emite luz para dentro do camundongo, que é mantido em uma caminha parcialmente transparente para camundongos.

Acima da cama do camundongo, há um arranjo de LEDs como fonte de luz alternativa, o que permite que a TFM opere como um dispositivo de imagem de reflexão comum. A roda de filtros é montada abaixo da lente, que capta a luz para o detector na parte superior do dispositivo. Este é o nosso micro TC.

O micro-TC é equipado com dois tubos de raios X e dois detectores de painel plano, o que permite a aquisição de varreduras de dupla energia. Capítulo dois, protocolo de varredura de micro-TC com FMT. Tanto a FMT quanto o micro-TC são projetados para imagear camundongos; antes da imagem, os camundongos são anestesiados com isoflurano.

Para a varredura por FMT, os pelos do camundongo precisam ser removidos, o que funciona bem com o creme de depilação. Algumas linhagens de camundongos podem desenvolver erupções cutâneas devido ao creme depilatório. Portanto, recomenda-se monitorar os camundongos quanto a alterações na pele e entrar em contato com a equipe veterinária para cuidados, se necessário.

Além disso, teste a tolerância em um pequeno lote de qualquer nova linhagem de camundongos no início. Para evitar hipotermia, o camundongo é colocado sobre uma placa aquecida. Para injetar o agente de contraste, um cateter é inserido na veia da cauda devido ao seu pequeno tamanho.

Isso é bastante difícil e requer alguma experiência. Se o sangue retornar ao cateter, significa que ele está corretamente posicionado através do cateter. Agentes de contraste fluorescentes e agentes de contraste para tomografia computadorizada podem ser injetados para evitar sobrecarga de volume.

No máximo, deve-se injetar cinco mililitros por quilograma de peso corporal, o que equivale a 150 microlitros para um camundongo de 30 gramas. Para a varredura, o camundongo é colocado dentro de uma maca multimodal para camundongos.

O rato pode ter alguns símbolos desenhados na cauda para identificação. É importante evitar tais elementos no tronco, pois podem afetar a varredura óptica. A cama do rato é fechada e a profundidade é ajustada para segurar firmemente o animal em uma posição fixa.

Seja cuidadoso e monitore a respiração, pois apertar muito a cama pode sufocar o camundongo. Camundongos nus são comumente usados em pesquisas oncológicas devido à sua imunossupressão. O fato de serem nus é um efeito colateral favorável da mutação genética.

Portanto, o trabalhoso procedimento de remoção de pelos pode ser omitido. Deve-se verificar se o camundongo está respirando adequadamente, e, se necessário, o leito do camundongo deve ser ajustado conforme necessário. Em seguida, o leito do camundongo é colocado dentro do micro-CT.

Os tubos que transportam o gás de flúor ISO são comutados para manter o fluxo de gás no interior do dispositivo. Em seguida, o micro C é fechado para ativar o blindagem de raios X. O micro C só iniciará a varredura se a tampa estiver fechada.

Usando os botões do micro-TC, o rato pode ser movido para dentro do micro-TC. No computador de controle do micro-TC, é adquirido um topograma e exibido, sendo os ajustes de janela ajustados para visualizar melhor o rato. Um ou mais cortes ZUP podem ser posicionados. Suas posições são indicadas pelas regiões em azul claro.

Normalmente, um a três varreduras ZUP são suficientes. Após iniciar a varredura, o progresso é indicado por barras de progresso azul-escuras. Nosso microtomógrafo de painel plano realiza as varreduras ZUP sequencialmente, o que difere de um CT espiral clínico.

Usando os botões, a cama do camundongo é movida para a frente. Novamente, a tampa de proteção é aberta e os tubos anestésicos são trocados. O suporte é cuidadosamente removido da cama do camundongo e o tubo anestésico é puxado para fora.

Isso é necessário porque o AN e o FMT não dependem deste pequeno tubo. Em vez disso, a pequena câmara interna do FMT é inundada com gás anestésico. Agora, a plataforma para camundongo com o animal é levada até o FMT e inserida no computador de controle do FMT.

O campo de visão da varredura é ajustado, assim como a densidade de amostragem. Geralmente, são utilizados cerca de 120 pontos. A varredura inicia após pressionar um botão.

A primeira passagem da TFM adquire uma imagem de transiluminação ou excitação para cada ponto fonte do laser. Neste vídeo, ela é mostrada em modo de avanço rápido. Normalmente, leva cerca de cinco minutos.

Pode-se observar que muito menos luz atravessa a parte superior do corpo em comparação com a parte inferior. Isso ocorre porque os órgãos com maior volume sanguíneo relativo, como coração, fígado e rins, estão mais concentrados na parte superior do corpo. O sangue é o principal absorvedor da luz infravermelha próxima.

As segundas execuções do mesmo conjunto de pontos-fonte utilizam um filtro diferente, que permite apenas a passagem da luz fluorescente, Capítulo três, óleo interativo e segmentação. Para fundir os dados provenientes de ambos os dispositivos, são utilizados marcadores, que estão integrados na camada do rato.

Os marcadores também são visíveis em uma imagem de reflexão adquirida pelo FMT. Os marcadores são na verdade orifícios simples e não precisam ser preenchidos com nenhum agente fluorescente ou de contraste para tomografia computadorizada. Em nosso instituto, desenvolvemos um programa de software que realiza a detecção dos marcadores e a fusão de forma automática.

A forma do camundongo, bem como os mapas heterogêneos de absorção e espalhamento, são estimadas automaticamente utilizando os dados de micro-TC conforme descrito em nossa publicação recente na Theranostics. Esses parâmetros são importantes para a reconstrução quantitativa da fluorescência. Para medir a biodistribuição da fluorescência, é necessária uma segmentação dos órgãos.

Nós geramos tal segmentação de forma interativa usando um software chamado imulitic preclinical desenvolvido em nosso instituto a seguir. Uma segmentação desse tipo é mostrada em avanço rápido e uma pessoa experiente pode realizá-la em cerca de 10 a 20 minutos. Primeiro, o conjunto de dados de TC é carregado.

Pode ser inspecionado em 3D utilizando uma renderização de superfície ISO. Ao alterar as configurações de janela, o valor ISO pode ser modificado. Por exemplo, para visualizar os ossos de todo o corpo do camundongo com a caminha do camundongo, então a sobreposição é carregada.

O sinal deste exemplo aparece na bexiga. Agora a visualização sobreposta está desativada. Para concentrar-se na segmentação anatômica.

Nas microtomografias nativas, o pulmão é facilmente identificado devido ao forte contraste negativo em relação aos outros tecidos moles. A grande estrutura no interior do pulmão é o coração. Vamos segmentar o pulmão primeiro.

Todos os vóxeis abaixo de um determinado valor são segmentados usando limiarização. Isso aparece em verde. O pulmão é uma região conectada, que pode ser separada usando uma operação de preenchimento.

Semelhante ao balde de tinta em um programa de pintura, pode-se separar o órgão pulmonar recortando e preenchendo. Órgãos convexos, como a bexiga, podem ser segmentados desenhando rabiscos para delimitar as bordas do órgão.

Mais rabiscos são adicionados até que uma precisão suficiente seja alcançada. Órgãos não convexos, como o intestino, podem ser segmentados pedaço por pedaço. O fígado aparece como uma região homogênea e possui uma estrutura mais complexa.

Como é composto por múltiplos lobos, a segmentação pode ser salva em disco e carregada no programa. Utilizando essa segmentação, o sinal fluorescente pode ser atribuído aos órgãos. O programa calcula essas quantidades e as salva como uma planilha adicional. Para exames longitudinais, a segmentação precisa ser realizada novamente para cada ponto temporal, pois os intervalos geralmente são muito longos para manter o camundongo anestesiado em uma posição fixa.

Portanto, a segmentação é uma tarefa trabalhosa se muitos camundongos e muitos pontos temporais estiverem envolvidos. Para quantificar os resultados, carregue uma sobreposição e uma segmentação. Clique em Definir configurações de lote para permitir que o programa lembre as configurações atuais.

Agora, clique em estatísticas por lote para instruir o programa a calcular os valores para todas as regiões em todos os escaneamentos micro-TC FMT. Isso levará alguns segundos. Em seguida, as estatísticas são salvas em um único arquivo de planilha.

Isso é conveniente porque o usuário não precisa mesclar dezenas de arquivos por conta própria. Com base neste arquivo, as curvas do órgão podem ser calculadas. Capítulo quatro, resultados representativos.

Para testar se a fusão funciona corretamente, utilizamos um fantasma de aros. Algum pó de óxido de titânio foi adicionado para causar espalhamento. Para obter uma forma irregular, removemos algumas partes.

Várias pequenas inclusões preenchidas com agente fluorescente e agente de contraste de TC foram incorporadas ao fantoma. Como a TFM não conhece a forma real do objeto e assume uma forma simplificada, a reconstrução não é precisa para objetos com formas irregulares. Por isso, implementamos outra reconstrução que utiliza a forma derivada dos dados de micro tomografia.

Como você pode ver, a localização do sinal no fantoma é muito melhor. Para inspecionar os dados in vivo, vamos analisar os pontos temporais de aquisição. Esta é a pré-aquisição.

O que vemos é basicamente apenas ruído e artefatos. Se avançarmos para o próximo ponto temporal, aquele após a injeção, observamos um sinal muito maior, mas as configurações de janelamento estão muito inadequadas. Usando a caixa de diálogo de janelamento, você pode ajustar as configurações de janelamento.

Observamos a maior parte do sinal na bexiga. Se avançarmos para o próximo momento, 0,2 horas após a injeção, vemos algum sinal fora do camundongo. Isso ocorre porque o camundongo urinou a fluorescência sobre a cama do animal.

Ao ajustar ainda mais o janelamento, podemos observar um sinal na coluna vertebral e nos joelhos. Agora, vamos para o tempo de 0,4 horas após a injeção, quando o sinal proveniente da urina já desapareceu e observamos fluorescência na coluna vertebral e nos joelhos nos próximos pontos temporais, seis horas e 24 horas após a injeção. Observamos o mesmo padrão.

Agora vamos passar para o próximo nariz. A pré-varredura não mostra nada usando essas configurações de janela. A varredura 15 minutos após a injeção mostra um sinal intenso na bexiga e assim por diante.

Neste estudo, observamos altas concentrações na bexiga urinária logo após a injeção, em decorrência da rápida excreção renal desta sonda. Além disso, o sinal na coluna vertebral aumenta rapidamente e permanece relativamente estável ao longo dos pontos de tempo subsequentes de aquisição de imagens. Capítulo cinco, conclusão.

Em conclusão, apresentamos um protocolo de imagem multimodal que combina as vantagens da tomografia por fluorescência, tomografia molecular e microtomografia computadorizada. Os dados anatômicos de micro-TC permitem uma reconstrução melhorada da fluorescência ao utilizar a forma do camundongo. Além disso, é útil para gerar segmentações de órgãos, necessárias para extrair medidas quantitativas dos dados de imagem.