Name: High Throughput medição de Extracelular DNA lançamento e Formação NET quantitativa em neutrófilos humanos In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprenda a quantificar NETs liberados por neutrófilos humanos usando ensaios de alta vazão. Este método permite estudar inflamação e identificar vias de sinalização e moléculas reguladoras da formação de NETs in vitro.

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Agradecimentos especiais ao pessoal do laboratório do Centro de Saúde da Universidade da Geórgia por seu apoio contínuo ao nosso trabalho de isolamento de neutrófilos humanos. Este trabalho foi apoiado pelo fundo inicial do Dr. Rada fornecido pelo Escritório do Vice-Presidente de Pesquisa da UGA.

O Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Geórgia aprovou o estudo humano sujeitos a recolha de sangue periférico de voluntários saudáveis ​​(UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 Os voluntários assinaram o termo de consentimento necessária antes de tirar sangue. A pesquisa realizada neste artigo está em conformidade com as diretrizes éticas para pesquisas médicas envolvendo seres humanos da Declaração de Helsinki. 1. Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano (Figura 1) Nota: Existem várias maneiras para isolar os neutrófilos a partir de sangue periférico. O protocolo a seguir fornece uma possibilidade. Este protocolo resulta um grande número de neutrófilos não activados humanos capazes de libertar rede sobre a estimulação externa. Use 40 ml de sangue total obtido a partir de voluntários saudáveis ​​por punção venosa. 7,9 <ol><li> Alíquota de 20 ml de sangue em dois tubos de 50 ml cônico. Adicionar 10 ml de dextrano a 6%. Misture delicadamente. </li><li> Após 20 min de transferência do leucócito-rich fase superior sem tomar quaisquer glóbulos vermelhos peletizadas para limpar 50 ml tubos cônicos, e preenchê-lo com PBS estéril. </li><li> Centrifugar a 400 xg, 10 min. Ressuspender o sedimento em 4 ml de PBS estéril. </li><li> Preparar um gradiente de Percoll de 5 passos de 85% -80% -75% -70% -65% em dois tubos de 15 mL cónicos e camada 2 ml de suspensão de leucócitos no topo de cada gradiente. </li><li> Centrífuga 800 xg por 30 min com freios fora. </li><li> Recolha todas as células (neutrófilos) nas camadas do 75% / 80% e interface de 70% / 75%. </li><li> Lavar as células duas vezes em PBS (350 xg, 10 min, RT) e contagem de células utilizando um hemocitómetro. </li></ol> 2. Medição da cinética de ADN extracelular de lançamento Usando uma microplaca de Fluorímetro Nota: Este método permite a medição das alterações na fluorescência de um corante indicador de libertação de ADN em um formato de microplacas de 96 poços de ligação do ADN de membrana impermeável (Figura 2). <ol><li> Prepara-se uma suspensão de neutrófilos em meio de ensaio (HBSS +1% (v / v) + glucose no soro autólogo a 5 mM) a uma concentração de 2 X 10 6 células / ml. </li><li> Adicionar 5 umol / L de corante a membrana impermeável de ligação de ADN. Misture delicadamente. </li><li> neutrófilos humanos alíquota (50 pL / cavidade) em 96 cavidades, de fundo transparente preto microplacas. Certifique-se o meio de ensaio cobre a totalidade do fundo do poço. Se não, toque ligeiramente a placa do lado. </li><li> Aquecer a placa contendo neutrófilos durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Nesse meio tempo preparar soluções de estímulos com o dobro de suas concentrações finais a ser utilizado (em C meio de ensaio quente 37 °). Como um controlo positivo NET usar neutrófilos humanos com 100 nM de forbol-miristato-acetato (PMA), durante 4 horas para desencadear liberação líquida máxima. 5,8 PMA estimulação durante 4 horas garante a liberação NET máxima enquanto a formação NET espontânea permanece baixa 5,8. </li><li> Prepara-se o fluorímetro de microplacas durante a medição (4 h, 37 ° C, 530 nm para excitação e 590 nm para emissão). &lt;/ Li&gt; <li> Estimulam os neutrófilos através da adição de solução de 50 ul de estímulo para 50 ul de suspensões de neutrófilos. Use 0,5 ug / ml de saponina em um poço para medir sinal de liberação DNA máxima. </li><li> Coloque placa no leitor e medir as mudanças na fluorescência durante 4 horas a cada 2 min sem agitação. </li><li> Para análise de dados, calcular o aumento normalizado na fluorescência ao longo do tempo. <ol><li> Linha de base de fluorescência Subtrair os valores de ponto final para todos os poços incluindo saponina (Figura 2A, B). Aumento na fluorescência saponina deve ser o sinal mais alto. Ele é referido como &quot;libertação máxima de ADN&quot; (Figura 2A). </li><li> Calcular as percentagens de libertação de ADN em amostras desconhecidas dividindo aumentos na fluorescência de amostras desconhecidas por libertação máxima de ADN. </li><li> Média de resultados de repetições e apresentá-los como &quot;% de libertação de DNA máxima&quot; (Figura 2C). </li></ol></li></ol> 3. Quantificação do Formulário NETção por MPO-ADN e ADN-HNE ensaios ELISA Nota: Estes ensaios (MPO-DNA) modificado ou estabelecida (HNE-DNA) em nosso laboratório quantificar formação NET medindo os níveis de MPO-DNA e complexos de DNA-HNE 5. <ol><li> Revestimento de 96 poços de alta capacidade de ligação de placas de ELISA durante a noite com anticorpos de captura (50 uL / ​​poço): anti-MPO (1: 2000 de diluição) ou anti-HNE (1: 2000). </li><li> Lavagem ELISA placas três vezes com PBS (200 ul / poço) e bloqueá-los com 5% de BSA e 0,1% de albumina de soro humano durante 2 horas à temperatura ambiente (200 ul / poço). Lavar três vezes com PBS. </li><li> neutrófilos das sementes sobre microplacas de 96 poços a uma densidade de 100.000 células / poço em 100 ul de meio de ensaio, e estimular a formação de rede. Incubar as células: 4 horas para 37 ° C. </li><li> Realizar uma digestão DNase limitada por adição de 2 U / ml DNase para sobrenadantes de neutrófilos, misture bem. Mantê-los à temperatura ambiente. </li><li> Pare a ADNase após 15 min por adição de 11 uL de EGTA 25 mM (concentração final 2,5 mM). Misture bem. Recolha supernatants em tubos de microcentrífuga limpo. amostras de rotação para se livrar de detritos de células a 300 xg por 5 min a RT. Transferir os seus sobrenadantes para tubos de microcentrífuga limpo. Mantê-los em gelo até estar pronta. </li><li> Use uma alíquota de uma previamente preparado &quot;padrão NET&quot;. Nota: O NET-padrão é uma mistura de sobrenadante digerido-DNase de neutrófilos PMA-estimuladas obtidas a partir de pelo menos 5 diferentes doadores humanos, independentes. <ol><li> Para usar o mesmo padrão para um longo período de tempo, recolher e aliquotar um grande volume de sobrenadantes de neutrófilos a partir de cada um dos doadores. Recolha de, por exemplo, 2 ml de sobrenadantes digeridos DNase de neutrófilos estimulados com PMA-resultará em alíquotas de 200 (10 ul cada) suficiente para 200 placas de ELISA. Os dados que caracterizam o padrão NET são encontrados na Figura 5. </li><li> Estimular a neutrófilos humanos com 100 nM PMA durante 4 horas e aplicar DNase digerir a seus sobrenadantes de acordo passos 3,4-3,5. </li><li> Recolha, piscina, alíquota (10 ul) e livreze sobrenadantes (-20 ° C) de neutrófilos. </li><li> Para preparar o &quot;NET-padrão&quot;, descongelar uma alíquota / doador obtido a partir de pelo menos cinco doadores diferentes, misturá-los e mantê-los no gelo. </li><li> Descarte amostras descongeladas e usar os frescos para o próximo experimento. </li><li> Prepare uma diluição 1: serial 2 do NET-padrão em PBS + EGTA. </li></ol></li><li> Diluir as amostras digeridas (DNase1-padrão e desconhecidos) sobrenadantes de 20 vezes em PBS + EGTA e aliquotar-los em placas de ELISA revestidas com anticorpos de captura. </li><li> Incubar as placas de ELISA durante a noite a 4 ° C e lava-se três vezes com PBS. </li><li> Aplicar a solução anticorpo de detecção (100 ul / poço): peroxidase de rabanete anticorpo anti-ADN cavalo conjugado (1: 500, de ratinho). Incubar durante 1 hora no escuro. </li><li> Depois de quatro lavagens com PBS, adicionar substrato de peroxidase TMB: 100 ul / poço, 30 min. coloração azul é uma indicação de atividade da peroxidase (redes presentes). </li><li> Parar a reacção pela adição de 100 ul / poço de HCl 1 M. osoluções azuis ficará amarela (Figura 5A). </li><li> Ler a absorvância a 450 nm usando um fotómetro de microplacas. </li><li> Para análise dos dados, calcular a quantidade de MPO-DNA ou complexos de DNA-HNE comparação com o padrão NET. <ol><li> Subtrair o valor de densidade óptica de fundo do meio de ensaio de todas as amostras. </li><li> Traçar os valores de absorvância (eixo X) de amostras-padrão diluído contra o seu conteúdo líquido relativa (eixo Y) (Figura 5A). </li><li> Utilizando a gama nonsaturated desta curva padrão estabelecer uma linha de tendência (usar melhor ajuste exponencial a partir do software utilizada) (Figura 5A). A equação desta linha de tendência determina a conversão dos valores de DO para quantitativos quantidades de redes. </li><li> Insira os valores de DO medidos das incógnitas na equação da linha de tendência de 3.13.3 que vai dar a quantidade de redes na amostra desconhecida em percentagem do NET-padrão (Figura 5A). </li><li> Calcularmédias de repetições (triplicado) e apresentar os dados finais como &quot;quantidade de MPO-DNA ou complexos de DNA-HNE (% do normal)&quot; (Figura 5c). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li>
<li>Leffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+neutrophil+extracellular+traps+co-varies+with+disease+activity+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li>
<li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Rada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyocyanin-enhanced+neutrophil+extracellular+trap+formation+requires+the+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase.</a> PLoS One. 8, e54205(2013).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+facilitates+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Biochem J. 464, 3-11 (2014).</li>
<li>Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li>
<li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li>
<li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

NET representar um novo mecanismo fascinante pelo qual neutrófilos matar agentes patogênicos. 1 Embora a literatura de redes tem sido continuamente expandindo ao longo dos últimos dez anos desde a sua descoberta, várias questões importantes relacionadas com o seu papel na biologia, mecanismo e regulação permanecem obscuras. metodologia adequada tem de ser desenvolvido para medir a NET, esse mecanismo antimicrobiano muito original. Este artigo descreve métodos que podem ser utilizados para quantificar de uma f...

A formação de NET é um novo mecanismo pelo qual os neutrófilos combatem patógenos. 1 O núcleo dos TNEs é o DNA nuclear. 1 Essa rede de DNA está associada a proteínas granulares de neutrófilos e histonas. 1 A principal forma de formação de NET requer a morte de neutrófilos caracterizada por descondensação da cromatina, desaparecimento de membranas granulares e nucleares, translocação de elastase de neutrófilos para o núcleo, citrulinação de histonas e, finalmente, o derramamento de TNEs baseados em DNA. algarismo Os NETs prendem e matam uma grande variedade de micróbios e são uma parte essencial do repertório de armas imunes inatas. A formação descontrolada de TNEs, no entanto, tem sido associada a inúmeras doenças autoinflamatórias. 3,4 Apesar de sua relevância cada vez mais estabelecida, pouco se sabe sobre o mecanismo e a regulação da liberação de NET. 
Os neutrófilos que morrem liberando NETs são diferentes dos neutrófilos apoptóticos ou necróticos. 3,5 Os neutrófilos liberadores de NET mostram várias características que são características da formação de NET. Os componentes granulares estão associados ao DNA em TNEs. 1 A mieloperoxidase (MPO) e a elastase de neutrófilos humanos (HNE) são encontradas em grânulos primários em células em repouso, mas são translocadas para o núcleo para se ligarem ao DNA em NETs. 1 Os complexos MPO-DNA e HNE-DNA são específicos para TNEs, não ocorrem em neutrófilos apoptóticos ou necróticos. 1,3,5 A descondensação da cromatina é outra característica típica da NETosis. algarismo A liberação de NET também requer citrulinação de histonas pela peptidil aminidase 4 (PAD4). 6 As histonas citrulinadas são características de neutrófilos que sofreram liberação de NET. 6
Aqui são introduzidos três métodos que, em combinação, fornecem excelentes ferramentas para quantificar NETs em uma escala de alto rendimento. O primeiro ensaio foi utilizado em campo com diferentes alterações e quantifica a liberação de DNA extracelular em formato de microplaca. O segundo e o terceiro ensaios fornecem confirmação de NETs medindo complexos MPO-DNA e HNE-DNA específicos para NET.

<table><tbody><tr><td>Elastase Anti-Neutrófilos Humanos Abdominais de Coelho</td><td>Calbiochem</td><td>481001</td><td>1:2.000x revestido</td></tr><tr><td>Anti-Mieloperoxidase Ab (Coelho)</td><td>Millipore</td><td>07-496</td><td>1:2.000x revestido</td></tr><tr><td>DNase-1</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>1 &#181; g/ml usado para digestão</td></tr><tr><td>20 mM EGTA/ PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mM EGTA/PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Detecção de morte celular ELISA Anti-DNA POD</td><td>Roche</td><td>11544675001</td><td>1:500x&nbsp;</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de microplacas Eon</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Software de microplacas tudo-em-um</td><td>Ferramenta analítica Biotek</td><td></td><td>(ELISA)</td></tr><tr><td>Sytox orange</td><td>Life Technology</td><td>S11368</td><td>0,2% concentração/volume</td></tr><tr><td>final 1 M Hepes</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>Use 10 mM de concentração final.</td></tr><tr><td>1 M glicose</td><td>Sigma</td><td></td><td>Use 5 mM de concentração final.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023-CM</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma P</td><td>8139</td><td>100 nM final usado</td></tr><tr><td>Placa ELISA</td><td>Greiner bio-one</td><td>655061</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos 15 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos 50 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (pH 8,5-9,5)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P 1644</td><td>Cloreto de Sódio, Sigma, S7653-250G</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Spectrum</td><td>D1004</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mídia</td><td>Corning Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 placa de ensaio placa preta fundo transparente</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr></tbody></table>

high throughput medição de extracelular dna lançamento e formação net quantitativa em neutrófilos humanos<em&gt; in vitro</em

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Os granulócitos neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue humano. Os neutrófilos são os primeiros a chegar ao local da infecção. Os neutrófilos desenvolveram vários mecanismos antimicrobianos, incluindo fagocitose, degranulação e formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Os TNEs consistem em um andaime de DNA decorado com histonas e vários marcadores de grânulos, incluindo mieloperoxidase (MPO) e elastase de neutrófilos humanos (HNE). A liberação de NET é um processo ativo que envolve alterações morfológicas características dos neutrófilos que levam à expulsão de seu DNA para o espaço extracelular. Os TNEs são essenciais para combater os micróbios, mas a liberação descontrolada de TNEs tem sido associada a vários distúrbios. Para aprender mais sobre a relevância clínica e o mecanismo de formação de NET, é necessário ter ferramentas confiáveis capazes de quantificação de NET. 
Aqui são apresentados três métodos que podem avaliar a liberação de NET de neutrófilos humanos in vitro. O primeiro é um ensaio de alto rendimento para medir a liberação de DNA extracelular de neutrófilos humanos usando um corante de ligação ao DNA impermeável à membrana. Além disso, são descritos dois outros métodos capazes de quantificar a formação de NET medindo os níveis de complexos MPO-DNA e HNE-DNA específicos para NET. Esses métodos baseados em microplacas, em combinação, fornecem ótimas ferramentas para estudar com eficiência o mecanismo e a regulação da formação de NET de neutrófilos humanos.

Os números desta manuscrito descrever o método de isolamento de neutrófilos, procedimentos experimentais e apresentar resultados representativos com explicação da análise dos dados. A Figura 1 mostra as etapas sequenciais de preparação de neutrófilos humanos. Este protocolo representa apenas uma forma possível de isolamento de neutrófilos. Ela produz grandes quantidades de neutrófilos que descansa capazes de libertar rede sobre a estimulação. A Figura 2 ...

São apresentados ensaios de alto rendimento que, em combinação, fornecem excelentes ferramentas para quantificar a liberação de NET de neutrófilos humanos.

High Throughput medição de Extracelular DNA lançamento e Formação NET quantitativa em neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as armadilhas extracelulares de neutrófilos, ou NETs, liberadas por neutrófilos humanos em larga escala. Os métodos apresentados aqui podem ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de inflamação e doenças inflamatórias alteradas por meio do estudo do mecanismo e da regulação da formação in vitro de armadilhas extracelulares de neutrófilos em neutrófilos humanos. As implicações desta técnica envolvem a identificação de vias de sinalização centrais mediadoras de NETs e moléculas inibidoras ou estimuladoras de NETs.Para isolar neutrófilos do sangue, alíquotas de 20 mililitros de sangue humano em tubos cónicos de 250 mililitros. Adicione 10 mililitros de dextran 6%, misture suavemente e deixe as soluções repousarem à temperatura ambiente durante 20 minutos. Transfira cuidadosamente a fase superior rica em leucócitos para tubos cónicos limpos de 50 mililitros e use PBS estéril para encher o tubo até o topo.Em seguida, centrifugue a amostra a 400 vezes G durante dez minutos e use 15 mililitros de PBS estéril para ressuspender o pellet. Repita este passo de lavagem mais uma vez. A seguir, prepare cinco gradientes de percoll em etapas de 85, 80, 75, 70 e 65 por cento em tubos cônicos de 215 mililitros e sobreponha dois mililitros da suspensão de leucócitos sobre cada gradiente.Em seguida, centrifugue os gradientes a 800 vezes G durante 30 minutos com a frenagem desativada. Após a centrifugação, colete as células nas camadas nas interfaces de 75-80% e 70-75%. Use PBS para lavar as células duas vezes e, em seguida, use um hemocitômetro para contar as células.Para medir a cinética da liberação de DNA extracelular, prepare uma suspensão de neutrófilos em meio de ensaio na concentração de dois vezes dez à sexta potência de células por mililitro. Adicione cinco micromols por litro de laranja SYTOX, que é um corante impermeável à membrana e ligante ao DNA, e misture suavemente. Aliquote neutrófilos humanos em microplacas estéreis de 96 poços, com fundo preto e transparente, garantindo que o meio de ensaio cubra completamente o fundo de cada poço.Se não, toque suavemente na placa lateralmente. Incube a placa a 37 graus celsius por 10 minutos. Enquanto isso, use o meio de ensaio a 37 graus celsius para preparar soluções contendo os estímulos em concentrações duplas das concentrações finais a serem utilizadas.Como controle positivo de NET, prepare 100 nanomolar de acetato de forbol miristato, ou PMA, para tratar neutrófilos humanos durante quatro horas a fim de induzir a liberação máxima de NET. Em seguida, prepare o fluorímetro de microplaca para a medição. Estimule os neutrófilos adicionando 50 microlitros da solução estimuladora a 50 microlitros das suspensões de neutrófilos.Adicione uma concentração final de 0,5 miligramas por mililitro de saponina a um poço, para medir o sinal máximo de liberação de DNA. Coloque a placa no leitor e meça as alterações na fluorescência em intervalos de dois minutos durante quatro horas sem agitação. Para analisar os dados, calcule os aumentos normalizados na fluorescência ao longo do tempo subtraindo a fluorescência de linha de base dos valores finais para todos os poços, incluindo saponina.O aumento na fluorescência dos saponinos deve ser o sinal mais alto e é denominado liberação máxima de DNA. Faça a média dos resultados das réplicas e apresente-os como porcentagem da liberação máxima de DNA. Para quantificar a formação de NETs utilizando ensaios ELISA de MPO-DNA e HNE-DNA, adicione anticorpos capturadores anti-MPO ou anti-HNE a placas ELISA de 96 poços com alta capacidade de ligação e incube-as durante a noite para revestimento.Na manhã seguinte, utilize 200 microlitros por poço de PBS para lavar as placas de ELISA três vezes. Em seguida, utilize 200 microlitros de albúmina sérica bovina a 5%, ou BSA, e albúmina sérica humana a 0,1%, ou HSA, para bloquear os poços à temperatura ambiente por duas horas. Enquanto isso, semeie neutrófilos em 100 microlitros de meio de ensaio em uma placa de 96 poços com uma densidade de 100.000 células por poço e induza a formação de NETs após a adição dos estímulos, incubando a 37 graus Celsius por quatro horas.Em seguida, realize uma digestão limitada com DNase adicionando duas unidades por mililitro de DNAse aos sobrenadantes de neutrófilos, misture bem e incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, interrompa a reação adicionando 15 microlitros de EGTA 25 milimolar e misture bem. Colete os sobrenadantes em tubos microcêntrifugos limpos e centrifugue as amostras para remover os detritos celulares a 300 × g e temperatura ambiente por cinco minutos.A coleta de NETs sem digestão limitada resulta em dados inconsistentes. A etapa de digestão limitada do DNA é essencial para obter resultados reprodutíveis. Por isso, a concentração da enzima DNase I e a duração da digestão foram otimizadas.Transfira o sobrenatante para tubos microcêntrifugos limpos e mantenha em gelo. Em seguida, usando uma alíquota do padrão NET previamente preparado, prepare uma diluição de um para dois em PBS e EGTA. Agora, use PBS com EGTA para diluir vinte vezes as amostras digeridas com DNase I e distribua-as em placas de ELISA revestidas com anticorpos de captura.Incube as placas durante a noite a quatro graus Celsius. Antes de lavar as placas três vezes com PBS, adicione 100 microlitros por poço de uma solução de anticorpo de detecção, como anticorpo anti-DNA conjugado à peroxidase do rabanete, e incube no escuro por uma hora. Após quatro lavagens com PBS, adicione 100 microlitros por poço do substrato de peroxidase TMB e incube por 30 minutos.A coloração azul indica atividade de peroxidase e a presença de NETs. Para interromper a reação, adicione 100 microlitros de HCl um molar. As soluções azuis ficarão amarelas.Usando um fotômetro de microplaca, leia a absorbância em 450 nanômetros. Para comparar a quantidade de complexos MPO-DNA ou HNE-DNA medidos em relação ao padrão de NET, subtraia a densidade óptica de fundo de todas as amostras e plote os valores de absorbância das amostras padrão diluídas em função do seu conteúdo relativo de NET. Utilizando a faixa não saturada dessa curva padrão, estabeleça uma linha de tendência usando o melhor ajuste exponencial fornecido pelo software utilizado.Insira os valores de OD medidos das amostras desconhecidas na equação da linha de tendência, o que fornecerá a quantidade de NETs na amostra desconhecida como porcentagem do padrão de NETs. Por fim, calcule as médias das réplicas e apresente os dados finais como a quantidade de complexos MPO-DNA ou HNE-DNA. Aqui são mostrados dados representativos de um ensaio de liberação de DNA baseado em fluorescência com neutrófilos humanos mantidos não estimulados ou ativados com PMA ou P-aeruginosa.P-aeruginosa induz a formação de NETs em PMNs humanos. Este gráfico ilustra que as médias do aumento na fluorescência de poços replicados são calculadas, normalizadas em relação à fluorescência máxima e expressas como liberação de DNA. Essas imagens de fluorescência representam neutrófilos mantidos sem tratamento ou estimulados com PMA.Mostram-se aqui imagens de imunofluorescência de neutrófilos humanos não estimulados e ativados por PMA e PA01, provenientes de um ensaio Elisa para DNA-MPO e DNA-HNE. O DNA extracelular apresenta morfologia típica de NETs e colocaliza com MPO e histona H4 citrulinada, um marcador da formação de NETs. Este experimento demonstra a liberação de DNA-MPO e DNA-HNE em neutrófilos humanos utilizando o mesmo ensaio.O padrão de NET contém em média 19,5 microgramas por mililitro de DNA extracelular, 399 nanogramas por mililitro de MPO e 103,4 nanogramas por mililitro de HNE. Com base nos pesos moleculares do MPO e do HNE, e considerando que um micrograma de DNA contém 9,91 vezes 10 à 14ª potência de nucleotídeos, o padrão de NET contém 109 moléculas de HNE e 147 moléculas de MPO por 1.000 nucleotídeos. Por fim, experimentos de diluição seriada em duas dobras do padrão de NET revelam que as faixas dinâmicas dos ensaios ELISA de MPO-DNA e HNE-DNA estão entre 19 e 609 nanogramas por mililitro de DNA.Uma vez dominada, a técnica baseada no SYTOX laranja pode ser facilmente e rapidamente montada em uma hora, gerando resultados no dia seguinte. O ensaio de quantificação de NETs também é fácil de realizar e fornecerá dados no dia seguinte, se realizado corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar a neutrofilina em neutrófilos humanos de maneira de alto rendimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para gerar e isolar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs). Os neutrófilos são isolados do sangue periférico e estimulados com acetato de miristato de forbol (PMA) para produzir TNEs. Durante a incubação, os neutrófilos passam por um processo de morte celular (NETosis) para liberar NETs compreendendo cromatina descondensada misturada com proteínas citoplasmáticas granulares.

Uma técnica in vitro para gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos

A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite...

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são redes de ADN, histonas e proteínas de neutrófilos. Embora um componente da resposta imunitária inata, redes estão implicados na autoimunidade e trombose. Este protocolo descreve um método simples para o isolamento dos neutrófilos canino e quantificação de redes que utilizam um ensaio de microplaca de fluorescência.

A fluorescência ensaio simples para a quantificação de Canine neutrófilos Extracelular Armadilha lançamento

Podemos descrever métodos para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro e visualizar a formação líquida em neutrófilos ao vivo usando microscopia de fluorescência. Também descritos são protocolos para quantificar a formação líquida e citrulinado histona H3 (citH3) expressão usando microscopia de imunofluorescência.

In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a operação NETQUANT, uma opção de software totalmente automática para quantificação de NETs em imagens de imunofluorescência.

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Este protocolo descreve um ensaio de neutrófilos armadilha extracelular (NET) altamente sensível e alta taxa de transferência para a quantificação semi-automático de ex vivo NET formação pela microscopia confocal tridimensional de imunofluorescência. Este protocolo pode ser usado para avaliar a formação de líquido e degradação após estímulos diferentes e pode ser usado para estudar terapias NET-alvo potenciais.

Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

Apresentamos um protocolo para uma técnica modificada de ensaio imunoenzimático em sanduíche para medir quantitativamente dois componentes de remanescentes de armadilhas extracelulares de neutrófilos, complexos de DNA conjugado à mieloperoxidase e DNA conjugado à elastase neutrofílica, derivados de neutrófilos ativados.

Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Nós mostramos, como usar dois fótons de microscopia para a observação da dinâmica de granulócitos neutrófilos nos pulmões infectados, enquanto eles fagocitam patógenos ou produzir neutrófilos armadilhas extracelular (NET).

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

Aprenda a quantificar NETs liberados por neutrófilos humanos usando ensaios de alta vazão. Este método permite estudar inflamação e identificar vias de sinalização e moléculas reguladoras da formação de NETs in vitro.

High Throughput medição de Extracelular DNA lançamento e Formação NET quantitativa em neutrófilos humanos

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