High Throughput medição de Extracelular DNA lançamento e Formação NET quantitativa em neutrófilos humanos In Vitro

O objetivo geral deste procedimento é quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos, ou NETs, liberadas de neutrófilos humanos em uma escala de alto rendimento. Os métodos apresentados aqui podem ajudar a responder a questões-chave nos campos da inflamação e alteração de doenças inflamatórias por meio do estudo do mecanismo e regulação da formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos in vitro em neutrófilos humanos. As implicações desta técnica envolvem a identificação de uma via central de sinalização mediadora de NET e moléculas inibitórias ou estimuladoras de NET.

Para isolar neutrófilos do sangue, alicote 20 mililitros de sangue humano em tubos cônicos de 250 mililitros. Adicione 10 mililitros de 6% de dextrana, misture delicadamente e deixe as soluções descansar em temperatura ambiente por 20 minutos. Transfira cuidadosamente a fase superior rica em leucócitos para tubos cônicos limpos de 50 mililitros e use PBS estéril para encher o tubo até o topo.

Em seguida, centrifugue a amostra a 400 vezes G por dez minutos e use 15 mililitros de PBS estéril para ressuspender o pellet. Repita esta etapa de lavagem mais uma vez. Em seguida, prepare gradientes de cinco etapas de 85, 80, 75, 70 e 65 por cento em tubos cônicos de 215 mililitros e coloque dois mililitros da suspensão leucocitária no topo de cada gradiente.

Em seguida, centrifugue os gradientes a 800 vezes G durante 30 minutos com a interrupção. Após a centrifugação, colete as células nas camadas nas interfaces de 75-80% e 70-75%. Use PBS para lavar as células duas vezes e, em seguida, use um hemocitômetro para contar as células.

Para medir a cinética de liberação de DNA extracelular, prepare uma suspensão de neutrófilos em meio de ensaio a uma concentração de duas vezes dez elevado a seis células por mililitro. Adicione cinco micromoles por litro de laranja SYTOX, que é um corante de ligação ao DNA impermeável à membrana e misture suavemente. Alíquota de neutrófilos humanos em microplacas de fundo transparente preto de 96 poços estéreis, garantindo que o meio de ensaio cubra todo o fundo do poço.

Caso contrário, bata suavemente na placa lateral. Aqueça o prato a 37 graus Celsius por 10 minutos. Enquanto isso, use o meio de ensaio de 37 graus Celsius para preparar soluções contendo estímulos com o dobro de suas concentrações finais a serem usadas.

Como controle positivo do NET, prepare 100 acetato de miristato de forbol nanomolar, ou PMA, para tratar neutrófilos humanos por quatro horas para desencadear a liberação máxima de NET. Em seguida, prepare o fluorômetro de microplaca para medição. Estimule os neutrófilos adicionando 50 microlitros de solução de estímulo a 50 microlitros de suspensões de neutrófilos.

Adicione uma concentração final de 0,5 miligramas por mililitro de saponina a um poço, para medir o sinal máximo de liberação de DNA. Colocar a placa no leitor e medir as alterações da fluorescência em intervalos de dois minutos durante quatro horas sem agitar. Para analisar os dados, calcule os aumentos normalizados na fluorescência ao longo do tempo, subtraindo a fluorescência da linha de base dos valores finais para todos os poços, incluindo a saponina.

O aumento da fluorescência da saponina deve ser o sinal mais alto e é referido como a liberação máxima de DNA. Calcule a média dos resultados das réplicas e apresente-os como porcentagem da liberação máxima de DNA. Para quantificar a formação de NET usando ensaios MPO-DNA e HNE-DNA ELISA, adicione anticorpos de captura anti-MPO ou anti-HNE a placas ELISA de alta capacidade de ligação de 96 poços e incube-as durante a noite para revestir.

Na manhã seguinte, use 200 microlitros por poço de PBS para lavar as placas ELISA três vezes. Em seguida, use 200 microlitros de albumina de soro bovino a 5%, ou BSA, e albumina de soro humano a 0,1%, ou HSA, para bloquear os poços em temperatura ambiente por duas horas. Nesse meio tempo, semeie neutrófilos em 100 microlitros de meio de ensaio em uma placa de 96 poços a uma densidade de 100.000 células por poço e induza a formação de NET após a adição de estímulos incubando a 37 graus Celsius por quatro horas.

Em seguida, execute uma digestão limitada de DNase adicionando duas unidades por mililitro de DNAse aos sobrenadantes de neutrófilos, misture bem e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, pare a reação adicionando 15 microlitros de EGTA 25 milimolares e misture bem. Colete os sobrenadantes e limpe os tubos de microcentrífugas e gire as amostras para se livrar dos detritos celulares a 300 vezes G e temperatura ambiente por cinco minutos.

A coleta de TNEs sem digestão limitada resulta em dados inconsistentes. A etapa limitada de digestão do DNA é fundamental para obter resultados reprodutíveis. Portanto, a concentração da enzima DNase I e o tempo de digestão foram otimizados.

Transfira o sobrenadante para tubos de microcentrífugas limpos e mantenha no gelo. Em seguida, usando uma alíquota do padrão NET previamente preparado, prepare uma diluição de um a dois em PBS e EGTA. Agora, use PBS com EGTA para diluir as amostras digeridas pela DNase I vinte vezes e alíquota em placas ELISA revestidas com anticorpos de captura.

Incube as placas durante a noite a quatro graus Celsius. Antes de usar PBS para lavar as placas três vezes, aplique 100 microlitros por poço de uma solução de anticorpo de detecção, como anticorpo anti-DNA conjugado com peroxidase de rábano, e incube no escuro por uma hora. Após quatro lavagens com PBS, adicione 100 microlitros por poço de substrato de peroxidase TMB e incube por 30 minutos.

A coloração azul indica atividade da peroxidase e a presença de NETs. Para interromper a reação, adicione 100 microlitros de um molar HCL. As soluções azuis ficarão amarelas.

Usando um fotômetro de microplaca, leia a absorbância em 450 nanômetros. Para comparar a quantidade de complexos MPO-DNA ou HNE-DNA medidos em comparação com o padrão NET, subtraia a densidade ideal de fundo de todas as amostras e represente graficamente os valores de absorbância das amostras padrão diluídas em relação ao seu conteúdo relativo de NET. Usando a faixa não saturada dessa curva padrão, estabeleça uma linha de tendência usando o melhor ajuste exponencial do software usado.

Insira os valores de OD medidos das incógnitas na equação da linha de tendência que fornecerá a quantidade de NETs na amostra desconhecida como porcentagem do padrão NET. Finalmente, calcule as médias das réplicas e apresente os dados finais como a quantidade de complexos MPO-DNA ou HNE-DNA. Aqui são mostrados dados representativos de um ensaio de liberação de DNA baseado em fluorescência de neutrófilos humanos deixados sem estimulação ou ativados com PMA ou P-aeruginosa.

A P-aeruginosa desencadeia a formação de NET em PMNs humanos. Este gráfico ilustra que as médias de aumento na fluorescência dos poços replicados são calculadas, normalizadas na fluorescência máxima e são expressas como liberação de DNA. Essas imagens de fluorescência representam neutrófilos não tratados ou estimulados com PMA.

Aqui são mostradas imagens de imunofluorescência de neutrófilos humanos não estimulados, ativados por PMA e PA01 de um ensaio MPO-DNA e HNE-DNA Elisa. O DNA extracelular mostra morfologia típica de NET e colocaliza com MPO e histona citrulinada H4, um marcador de formação de NET. Este experimento mostra a liberação de MPO-DNA e HNE-DNA em neutrófilos humanos usando o mesmo ensaio.

O padrão NET contém, em média, 19,5 microgramas por mililitro de DNA extracelular, 399 nanogramas por mililitro de MPO e 103,4 nanogramas por mililitro de HNE. Com base nos pesos moleculares de MPO e HNE, e que um micrograma de DNA contém 9,91 vezes 10 elevado a 14 nucleotídeos, o padrão NET contém 109 moléculas de HNE e 147 moléculas de MPO por 1.000 nucleotídeos. Finalmente, experimentos de diluição em série de duas vezes do padrão NET revelam que as faixas dinâmicas dos ensaios MPO-DNA e HNE-DNA ELISA estão entre 19 e 609 nanogramas por mililitro de DNA.

Uma vez dominado, o ácido à base de laranja SYTOX pode ser montado de forma fácil e rápida em uma hora, levando a resultados no dia seguinte. O ensaio de quantificação NET também é fácil de executar e resultará em dados no dia seguinte, se realizado corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a naturalase em neutrófilos humanos de maneira de alto rendimento.