Método para medir a actividade de enzimas deubiquitinating em linhas celulares e amostras de tecidos

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar a atividade de enzimas ubiquitinadas nas células. Isso é conseguido cultivando células para alta cofluência e colhendo A lise mecânica suave é usada para produzir um lisado que mantém uma imagem metabólica do citoplasma da célula.

Em seguida, as enzimas são incubadas com sondas derivadas de hemaglutinina para marcar as enzimas de ubiquitina reagindo com o resíduo de cisteína do sítio ativo, os resultados mostram os perfis de atividade de muitas enzimas de ubiquitina com base em Western blotting e subsequente detecção quimioluminescente. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o western blotting regular, é que ela permite ao usuário visualizar as atividades de várias enzimas. Em um experimento, prepare meios de cultura de células por Ali, citando 30 mililitros de dobe docos, meio de águias modificado ou DMEM mais 10% de soro bovino fetal em um tubo cônico de 50 mililitros para cultura.

As células para o experimento transferem células M 17 ou A congeladas do armazenamento de nitrogênio líquido para um pequeno béquer com água morna. Em seguida, transfira as células para o tubo cônico de 50 mililitros contendo 30 mililitros de meio. Em seguida, adicione um pouco de mídia ao frasco de células e transfira as células ressuspensas dentro de cinco segundos após o descongelamento.

Centrifugar a suspensão celular a 450 Gs durante cinco minutos para obter um sedimento celular. Em seguida, adicionar 20 mililitros de meios num balão T 75. Remova a mídia das células usando sucção.

Adicione cinco mililitros de meio fresco ao pellet celular e resuse Suspend. Transferir os cinco mililitros de suspensão celular para os 20 mililitros de meio no balão T 75 e incubar 37 graus Celsius. Trocando o meio a cada três dias para colher as células.

Remova a mídia por sucção, tomando cuidado para não tocar nas células. Lave as células com cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Remova o PBS usando sucção.

Em seguida, adicione três mililitros de tripsin EDTA ao frasco T 75 e incube a 37 graus Celsius por três minutos. Após a incubação, adicione seis mililitros de meio fresco ao frasco e resus. Suspenda as células.

Transferir a suspensão para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 290 Gs durante cinco minutos, retirar o sobrenadante e adicionar cinco mililitros de PBS. Bata suavemente no fundo do tubo para quebrar o pellet antes da centrifusão a 290 Gs por cinco minutos. Depois de repetir a lavagem do PBS três vezes, remova o PBS antigo e ressuspenda as células em um mililitro de PBS fresco.

Em seguida, transfira as células para um tubo einor e gire a 290 GS por cinco minutos. Para realizar a lise celular, meça o volume aproximado do pellet usando uma pipeta e pese esferas de vidro e uma relação massa/volume de um para um. Adicione tampão de lise ao pellet com o dobro do volume do pellet.

Em seguida, adicione as contas de vidro ao pellet e à lise. Buffer ly as células no tubo einor em agitação máxima por 30 minutos a quatro graus Celsius por vórtice em uma câmara fria. Centrifugue brevemente a 200 GS por 30 segundos.

Para resolver as contas e coletar o sobrenadante. Adicione o mesmo volume de contas de vidro de antes ao vórtice sobrenadante, mais uma vez em agitação máxima por 30 minutos a quatro graus Celsius após a centrifusão brevemente a 200 Gs por 30 segundos. Para assentar as contas de vidro, colete o sobrenadante.

Por fim, centrifugar a 5 030 GS durante cinco minutos. Para remover os núcleos, membranas e células intactas, coletar o sobrenadante, que é o lisado celular para derivitização tecidual, realizado por análise de ácido Cinco nímico, ou BCA. Em uma placa de 96 poços para determinar a concentração de proteína do lisado usando um leitor de placa de 96 poços chole metric, conforme especificado pelo protocolo do kit de ensaio de proteína BCA.

Depois de determinar a concentração de proteína, traga uma alíquota correspondente a 20 microgramas de proteína total para 50 microlitros usando água deionizada. Em seguida, adicione dois microlitros de 1,35 micromolar de celular de vinil HAUB à solução. O resultado é 20 microgramas de lisado para 50 nano molar de sonda na mistura de reação final.

Isso está em grande excesso molar. Para garantir a marcação de enzimas de ubiquitina funcionais ou dubs, deixe a solução incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione o buffer de amostra laly à solução.

Para um volume de reação de 52 microlitros, use 26 microlitros de tampão de amostra dois, 13 microlitros de tampão de amostra quatro ou 8,87 microlitros de tampão de amostra de seis. Incubar a amostra durante cinco minutos a 95 graus Celsius. Deixe esfriar no gelo.

Antes de carregar o gel para realizar o western blot, primeiro carregue um gel de glicina de 12, bem quatro a 20% tris com 40 microlitros da amostra preparada. Execute o gel a 95 volts até que a frente do íon atinja o fundo. Em seguida, faça uma transferência noturna do gel para uma membrana de polifluoreto DI de videira ou PVDF.

Transferir Primeiro, incube a membrana na mancha preta AMDO e escaneie a membrana para obter uma imagem mostrando a quantidade de proteína em cada pista. Em seguida, detenha a membrana e incube em 5% de leite em PBS por uma hora para bloquear. Em seguida, incube a membrana no anticorpo anti-HA primário a uma concentração de um a 10.000 em 5% de leite em PBS, durante a noite a quatro graus Celsius ou por quatro horas em temperatura ambiente.

Após a incubação, realizar três lavagens por cinco minutos cada em PBS com 0,1% entre 20 detergentes. Em seguida, incube a membrana em peroxidase de raiz-forte de camundongo a uma concentração de um a 10.000 em 5% de leite em PBS por pelo menos duas horas. Faça três lavagens como antes, seguidas de uma lavagem por cinco minutos em PBS.

Por fim, incubar a membrana num reagente de detecção quimioluminescente durante 10 minutos e detectar com um detector luminescente. Use a configuração de exposição automática no detector. A carga proteica foi verificada por meio da coloração mito black AM.

Esta etapa de controle garante que as diferenças na atividade sejam devidas a processos celulares reais e não à carga desigual de proteínas. As pistas mostradas aqui indicam que quantidades iguais de proteína foram usadas no primeiro experimento. No segundo experimento, quantidades desiguais de proteína foram carregadas devido às diferenças esperadas nos perfis de atividade das linhagens celulares diferentes.

Isso foi feito para garantir a detecção de um perfil de atividade para a célula M 17. Lisados incubados com etil maide, que é um inibidor de cistina e deve levar a um sinal reduzido no Western blot. As membranas foram incubadas em anticorpo primário anti-AH.

Uma peroxidase de rabanete cavalo de camundongo e, em seguida, detectada por meio de imagens quimioluminescentes. A marcação bem-sucedida das dublagens usando as sondas resulta em um perfil em cada faixa da membrana. A intensidade das bandas em diferentes pesos moleculares corresponde ao nível de atividade da enzima dub.

As diferenças nos níveis de atividade de vários dubs entre as linhagens celulares tornam-se evidentes quando proteínas semelhantes, como U CHL one, são comparadas nas células he a e M 17. Após este procedimento. Outros métodos, como o fracionamento subcelular, podem ser realizados para responder a perguntas como: como os processos patológicos afetam a atividade da enzima ubiquitina em organelas ligadas à membrana?

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a atividade enzimática ubiquitinada usando sondas direcionadas ao local ativo.