Name: Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de Streptococcus iniae Infection (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprenda a microinjetar bactérias Streptococcus iniae na vesícula ótica de larvas de peixe-zebra para imagem não invasiva da resposta imune inata. Este método permite visualizar interações hospedeiro-patógeno em tempo real.

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Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório para os cuidados de peixe-zebra e manutenção. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 a EA Harvie e NIH R01GM074827 para Anna Huttenlocher.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método usado aqui infecção é útil para o estudo da resposta imune do hospedeiro a uma infecção inicialmente localizada em 2-3 embriões dpf e larvas. O foco de um estímulo inflamatório, tal como a infecção, numa cavidade fechada, tal como a vesícula ótica permite o estudo de neutrófilos e macrófagos quimiotaxia e da fagocitose. Uma ressalva de injecção de bactérias para dentro da vesícula ótica é que a capacidade dos neutrófilos de forma eficiente em bactérias fagocitam cavidades cheias de líquido, pode ser dependente ...

Streptococcus iniae é um importante agente patogénico aquático que é capaz de causar doença sistémica, tanto nos animais e seres humanos uma. Enquanto S. iniae é responsável por grandes perdas na indústria da aquicultura, é também um potencial patógeno zoonótico capaz de causar doença em hospedeiros humanos imunocomprometidos com patologias clínicas semelhantes às causadas por outros patógenos humanos estreptococos. Dadas as suas semelhanças com patógenos humanos, é importante estudar S. iniae patogênese da doença no contexto de um hospedeiro natural. Um modelo adulto zebrafish de S. infecção iniae revelaram infiltração de leucócitos robusto hospedeiras para o local da infecção localizada, bem como um tempo rápido para acolher a morte, um tempo muito curto para envolver o sistema imunitário adaptativo 7. A fim de obter um profundo olhar para a resposta imune inata de S. iniae infecção in vivo, é necessário utilizar um modelo que se torna mais fácil para nem invasivo imagens ao vivo. O peixe-zebra larval tem uma série de vantagens que o tornam um modelo vertebrado cada vez mais atraente para o estudo de interações patógeno-hospedeiro. Peixe-zebra são relativamente baratos e fáceis de usar e manter em relação aos modelos de mamíferos. A imunidade adaptativa não é funcionalmente maduros até 4-6 semanas após a fertilização, mas larvas têm um sistema imunológico inato vertebrado altamente conservada com complemento, Toll-like receptors, citocinas e neutrófilos e macrófagos com capacidades de antimicrobianos, incluindo a fagocitose e explosão respiratória 2-6, 8-11. Além disso, a tratabilidade genética e transparência óptica dos estádios de desenvolvimento embrionário e larval de desenvolvimento permitir a geração de linhas transgénicas estáveis ​​com células imunes marcadas por fluorescência que permitam examinar interacções hospedeiro-agente patogénico em tempo real in vivo. A geração destas linhas transgénicas usando uma proteína photoconvertible como Dendra2 permite o seguimento da célula hospedeira origem e destino indivíduo ao longo do curso da infecção 12. Ao desenvolver um modelo de infecção de larvas de peixe-zebra, o local escolhido de microinjeção vai determinar se uma infecção é inicialmente localizada ou sistêmica. Infecções arterial sistêmica na veia caudal ou duto de Cuvier são mais comumente usados ​​para estudar patógenos microbianos em peixes-zebra e são úteis para o estudo de interações entre hospedeiro e células microbianas, respostas de citocinas, e as diferenças na virulência entre isolados do patógeno. Para os microrganismos que crescem mais lento, no início de injecção dentro do saco vitelino de um embrião em fase de 16-1,000 célula pode ser usado para gerar uma infecção sistémica 13,14, com o estágio de desenvolvimento ideal para microinjecção de um microrganismo com crescimento lento, verificou-se que entre a fase 16-128 célula 15. No entanto, gema de injeções sac de muitos micróbios em fases posteriores do desenvolvimento de acolhimento tendem a ser letal para tele hospedar devido ao ambiente rico em nutrientes para o micróbio e falta de leucócitos de infiltração 16-18. Uma infecção localizada geralmente resulta na migração dirigida de leucócitos para o sítio da infecção que pode ser facilmente quantificado com imagem não invasiva. Este tipo de infecção pode permitir a dissecção dos mecanismos que medeiam a migração de leucócitos, bem como de investigação diferentes capacidades fagocíticas e migratórias de várias populações de leucócitos. Infecções localizadas também são úteis quando se examina as diferenças de virulência entre cepas bacterianas, bem como o estudo dos mecanismos de invasão de micróbios desde barreiras host físicos devem ser cruzados para uma infecção localizada para se tornar sistêmica. Peixe-zebra são normalmente levantada, a temperaturas de 25-31 ° C, 19, mas que também pode ser mantida a temperaturas tão elevadas como 34-35 ° C para os estudos da capacidade de invasão de agentes patogénicos humanos com determinados requisitos rigorosos de temperaturapara a virulência 20, 21. Muitos locais diferentes foram usados ​​para gerar uma infecção bacteriana localizada inicialmente incluindo o ventrículo rombencéfalo 22, músculo dorsal da cauda 18, 23 cavidade pericárdica e vesícula ótica (do ouvido), 5, 16, 24. No entanto, verificou-se que a injecção de bactérias no músculo da cauda pode causar danos nos tecidos e inflamação independente das bactérias, o que pode distorcer os resultados quando se investiga a resposta dos leucócitos 13. Embora menos danos está associada a injeção na parte posterior do cérebro e, embora seja inicialmente desprovido de leucócitos em embriões jovens, o ventrículo hindbrain constantemente ganha mais células imunes ao longo do tempo como microglia fixar residência. O ventrículo hindbrain também é um local mais difícil de imagem. A vesícula ótica é uma cavidade oca fechado, sem acesso directo à vasculatura 25, 26. É normalmente desprovido de Leukocytes leucócitos, mas podem ser recrutadas para a vesícula ótica, em resposta a estímulos inflamatórios, tais como a infecção. É também um local preferido para a microinjecção de bactérias na idade de 2-3 dias após a fertilização do peixe-zebra (dpf) por causa da facilidade de imagem e a visualização da injecção. Por isso, escolhemos a vesícula ótica como o nosso local de infecção bacteriana localizada.

<table><tbody><tr><td>Eppendorfs MidSci de 1,7 ml</td><td></td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>tubo Falcon de 14 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>agulha de 27 G x &frac12; pol.</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA ágar</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>Escopo de dissecação</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D2650</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 prova</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>Pinças finas</td><td>finas Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Pente de gel</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4,2 mm de largura, 1,5 mm de espessura</td></tr><tr><td>Pratos</td><td></td><td></td> com fundo de vidro <td>Feito à medida, perfurando um orifício de 16 - 18 mm no centro de um fundo de prato de cultura de tecidos de 35 mm e colocando uma lamínula redonda #1 de 22 mm no orifício e selando com uma fina camada de Adesivo Óptico Norland 68 curado por luz UV.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de alta fusão</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Olympus</td><td>com sistema</td><td></td>FV-1000</tr><tr><td>Baixo derretimento agarose</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Tritech (Narishige)</td> <td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microinjeção</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Espectromedidor de nanogota</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-feniltioureia (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr>Ciências de <td>Microscopia Eletrônica</td> <td>Paraformaldheyde</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Vermelho</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>Protease peptona</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células pequenas</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de injeção capilar de vidro de parede fina</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína (3-aminobenzoato de etila)</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Fluka Biochemika</td><td>Rolamento 92144</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem não invasivo do imunitário inatas response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; streptococcus iniae</em&gt; infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

O patógeno aquático, Streptococcus iniae, é responsável por mais de 100 milhões de dólares em perdas anuais para a indústria da aquicultura e é capaz de causar doença sistêmica em ambos os peixes e seres humanos. Uma melhor compreensão da S. iniae patogênese da doença requer um sistema modelo adequado. A docilidade genética e a transparência óptica dos primeiros estágios de desenvolvimento de peixe-zebra para permitir a geração de imagem e não-invasivo de linhas transgénicas com fluorescente etiquetado células imunitárias. O sistema imunológico adaptativo não é totalmente funcional até várias semanas após a fertilização, mas larvas do peixe têm um sistema imunológico inato vertebrado conservada com ambos os neutrófilos e macrófagos. Assim, a geração de um modelo de infecção de larvas permite o estudo da contribuição específica da imunidade inata no controle de S. infecção iniae. O local de microinjecção determinará se é uma infecçãosistémica ou localizada inicialmente. Aqui, apresentamos nossos protocolos para injecção vesícula ótica de peixe-zebra idade 2-3 dias após a fertilização, bem como as nossas técnicas de imagiologia confocal fluorescente de infecção. Um site infecção localizada permite a observação de invasão microbiana inicial, o recrutamento de células hospedeiras e disseminação da infecção. Nossos resultados, utilizando o modelo de larvas de peixe-zebra de S. infecção iniae indicam que peixe-zebra pode ser usado para examinar as diferentes contribuições de neutrófilos e macrófagos do hospedeiro em infecções bacterianas localizadas. Além disso, descreve-se como photolabeling de células imunes pode ser usado para rastrear o destino da célula hospedeira indivíduo durante o curso da infecção.

Microinjeção de S. iniae na vesícula ótica (Figura 1 e Figura 2) resulta em uma resposta do hospedeiro inicialmente localizadas. Quando injectado correctamente, as bactérias devem ser vistas apenas na vesícula ótica e não no tecido circundante ou sangue. Isto pode ser visualizado durante a microinjecção usando corante vermelho de fenol (Figura 1A). Alternativamente, se bactérias marcadas são injetados, uma varredura rápida de larvas infectadas imediatamente apó...

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração e imagem de uma infecção bacteriana localizada na vesícula ótica do peixe-zebra.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

O objetivo geral deste procedimento é microinjetar larvas de peixe-zebra com um patógeno bacteriano, Streptococcus IEA, para a obtenção de imagens em tempo real e não invasivas da resposta imune do hospedeiro. Isso é realizado primeiramente carregando a agulha de microinjeção com uma suspensão bacteriana e alinhando larvas de peixe-zebra anestesiadas no molde de agarose para injeção. Em seguida, a suspensão bacteriana é microinjetada na vesícula otólica das larvas.Em seguida, as larvas injetadas são montadas em agarose de baixo ponto de fusão. Por fim, as células imunes do hospedeiro são marcadas com fotoetiqueta para facilitar o rastreamento e a infecção é analisada por microscopia confocal. Em última instância, a microinjeção de Streptococcus iniae na vesícula otica e a subsequente fotoetiqueta e microscopia confocal são utilizadas para estudar a resposta imune do hospedeiro em larvas de peixe-zebra.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a injeção na veia caudal, é que a injeção na vesícula otológica produz uma infecção bacteriana localizada, permitindo a imagem não invasiva das interações entre o hospedeiro e o patógeno na larva de peixe-zebra transparente. Para começar, prepare uma solução de agarose de alto ponto de fusão a 1,5-2% em meio E3 e aqueça-a no micro-ondas até que a solução fique límpida. Após o resfriamento, despeje parte da agarose em uma placa de Petri, adicionando apenas o suficiente para cobrir o fundo da placa, e gire suavemente.Uma vez que o aros tenha solidificado, coloque um pente para gel lavado e seco em cima, de modo que a extremidade sólida esteja apenas apoiada na parte superior da placa de Petri e a extremidade entalhada esteja tocando o aros. Certifique-se de que o pente esteja o mais horizontal possível, formando um ângulo de 30 graus em relação à camada inferior de aros. Despeje uma quantidade adicional pequena de aros na interface entre o pente e a camada inferior de aros, de modo que a nova camada de aros cubra os poços do pente.Deixe esfriar completamente antes de remover o pente. Em seguida, utilizando a ponta de uma pipeta, remova quaisquer partes salientes de aros dos poços. Despeje o meio E três sobre a fôrma de injeção e armazene a quatro graus Celsius.Após preparar o inóculo de SNEA e as larvas de peixe-zebra para as injeções de acordo com o protocolo descrito no texto, ligue o microinjetor e defina o intervalo de tempo em milissegundos. Abra a válvula do tanque de dióxido de carbono para permitir a entrada do gás na linha. A pressão do microinjetor deve indicar aproximadamente 20 PSI. Vortexe a cultura de SNEA preparada em fenol vermelho e PBS e use uma ponta de microloader para carregar dois a três microlitros da cultura em uma agulha de injeção de capilar esticada. Monte a agulha carregada em um micromanipulador conectado a um suporte magnético e posicione-a sob um microscópio estereoscópico, de modo que a agulha fique em um ângulo de aproximadamente 45 a 65 graus em relação à base do microscópio.Primeiro, quebre a ponta da agulha usando uma pinça fina, pressione o pedal do microinjetor para dispensar uma gota do inóculo na ponta da agulha. Use a escala do ocular do microscópio para medir o diâmetro da gota. O diâmetro da gota deve ser aproximadamente 0,10 milímetro, o que equivale a cerca de um nanolitro de volume.Para ajustar o tamanho da gota, regule a configuração de duração no microinjetor ou use pinças finas para cortar mais da ponta da agulha. O tempo de injeção deve estar entre 20 e 35 milissegundos para evitar danos excessivos aos tecidos. Em seguida, utilizando uma pipeta de transferência de plástico, transfira um peixe por poço para cada um dos 12 poços do molde de injeção.Em seguida, com uma haste de vidro, alça de cabelo ou ponteira plástica, posicione suavemente as larvas de modo que as cabeças estejam voltadas para a parte traseira do microscópio e as bolsas de vitelo contra a lateral esquerda do poço. Oriente a orelha esquerda das larvas para cima, em direção ao teto. Quando as larvas estiverem prontas para a injeção, use os botões do micromanipulador para alinhar a agulha carregada com a vesícula ótica, de forma que ambas estejam no mesmo campo de visão.Com a ponta da agulha, perfure a camada epitelial externa da vesícula otica de modo que a ponta fique logo no interior da vesícula. Agora, usando uma pressão baixa o suficiente para não romper a cavidade, pressione o pedal do pé para injetar um nanolitro da dose desejada de SNEA. Se a injeção for bem-sucedida, a vesícula otica, mas não o tecido circundante, deverá preencher-se com um inóculo de vermelho de fenol.Retire cuidadosamente a agulha das larvas e, sob ampliação de cinco vezes, mova manualmente a placa de injeção para que a larva fique visível. Se estiver injetando bactérias marcadas com fluorescência sob um microscópio fluorescente, examine visualmente as larvas injetadas e mantenha apenas aquelas em que a deposição de bactérias ocorreu exclusivamente dentro da vesícula otica, para garantir que o volume de injeção permaneça constante ao longo do experimento. Após injetar cada 48º embrião, injete uma gota de suspensão bacteriana em um tubo de centrífuga de 1,7 mililitro contendo 100 microlitros de PBS estéril.Em seguida, plaque os 100 microlitros em placas de THY mais P auger e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Para determinar a UFC no volume de injeção, quando um grupo inteiro de 12 larvas na rampa de injeção tiver sido injetado, use cuidadosamente uma pipeta plástica de transferência para remover as larvas dos poços e colocá-las em uma nova placa de Petri. Remova a solução trica e substitua por aproximadamente dois mililitros de meio E três fresco para permitir que as larvas se recuperem.Incube os embriões de acordo com o protocolo descrito no texto. Após preparar os aros com trica, de acordo com o protocolo descrito no texto, na platina do microscópio estereoscópico, utilize uma pipeta de transferência para colocar quatro a cinco larvas anestesiadas em um recipiente de vidro com fundo de vidro. Remova a solução de trica e aro do banho-maria a 55 graus Celsius e deixe esfriar à temperatura ambiente por um a dois minutos.Enquanto isso, remova o máximo possível de líquido das larvas anestesiadas. Em seguida, despeje o agros resfriado na placa até que cerca da metade da superfície esteja coberta. Em seguida, agite suavemente a placa para espalhar o aros.Pegue as larvas que flutuaram para as laterais da placa e pipete-as de volta para o centro. Em seguida, sob o microscópio estereoscópico, use uma ponteira de pipeta longa para posicionar suavemente as larvas conforme desejado para a aquisição de imagens. Para a vesícula otica, posicione as larvas de modo que a vesícula otica direita fique voltada para cima e a vesícula otica esquerda fique plana contra o fundo da placa.Deixe os aros esfriarem por cerca de 10 minutos antes de mover o recipiente. Em seguida, pipete suavemente um pouco da solução trica e E três sobre a camada de aros para mantê-la úmida. Para visualizar as amostras, utilize um scanner Zack com os lasers de 488 nanômetros e 543 nanômetros.Utilize a varredura contínua de linha para ajustar a potência do laser e o ganho do detector. Verifique se não há fluorescência vermelha acidentalmente fotoconvertida na janela de controle de aquisição de imagem. Nas configurações de estímulo, selecione a ferramenta usar scanner e escolha principal, selecione o laser de 405 nanômetros e defina-o em 70% da potência.Em seguida, utilizando a opção de círculo, defina a região de interesse na vesícula odic; na configuração de início do estímulo, selecione a ativação em série com uma pré-ativação de um quadro e um tempo de ativação de 60.000 milissegundos na janela de configurações de aquisição. No menu Varredura Temporal, escolha dois intervalos de um minuto cada, um para pré e outro para pós-fotoconversão. Inicie a série de imagens em intervalos para iniciar a fotoconversão da região de interesse definida.Finalmente, escaneie a amostra utilizando um Zack e os lasers de 488 e 543 nanômetros. Para visualizar a fluorescência vermelha fotoconvertida, bem como qualquer fluorescência verde remanescente, a microinjeção de SNEA com fenol vermelho na vesícula otica resulta em uma resposta localizada inicialmente no hospedeiro, que, quando injetada corretamente, deve ser observada apenas na vesícula otica e não nos tecidos circundantes ou no sangue. Alternativamente, se bactérias marcadas forem injetadas, uma rápida análise dos larvas infectados imediatamente após a injeção pode confirmar que as bactérias estão somente na vesícula otica e não no tecido circundante.Os locais de microinjeção de infecção inicialmente localizada são úteis para o estudo da quimiotaxia de leucócitos, conforme mostrado aqui. O recrutamento de leucócitos pode ser quantificado por meio da coloração com Sudan Black dos grânulos de neutrófilos ou da fixação com formaldeído de linhagens transgênicas fluorescentes, utilizando linhagens transgênicas de peixe-zebra que expressam a proteína verde fluorescente Dendra dois, especificamente em macrófagos ou neutrófilos. Observou-se que a injeção de NEA na vesícula otica desencadeou o recrutamento de neutrófilos e macrófagos e a fagocitose de bactérias dentro de 60 minutos após a infecção.Nesta figura, dois macrófagos marcados com DRA que foram recrutados para a vesícula otica cinco horas após a infecção foram fotoconvertidos e rastreados nas 24 horas seguintes. Embora algumas células fotoconvertidas permaneçam na vesícula otica ou na região da cabeça, outras também foram encontradas disseminadas por todo o corpo das larvas, como visto aqui. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como realizar a microinjeção de streptococcus n EEA na vesícula otica de peixes-zebra com três dias de idade após a fertilização.Isso inclui: um, alinhar larvas anestesiadas no molde de injeção e carregar a agulha com o inóculo bacteriano; dois, microinjetar bactérias na vesícula otica; três, montar larvas infectadas em ágarose de baixo ponto de fusão; e quatro, utilizar um microscópio confocal para fotomarcar leucócitos do hospedeiro e imagens das interações entre leucócitos e patógenos in vivo.

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Research

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