Name: Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de Streptococcus iniae Infection (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprenda a microinjetar bactérias Streptococcus iniae na vesícula ótica de larvas de peixe-zebra para imagem não invasiva da resposta imune inata. Este método permite visualizar interações hospedeiro-patógeno em tempo real.

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Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório para os cuidados de peixe-zebra e manutenção. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 a EA Harvie e NIH R01GM074827 para Anna Huttenlocher.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método usado aqui infecção é útil para o estudo da resposta imune do hospedeiro a uma infecção inicialmente localizada em 2-3 embriões dpf e larvas. O foco de um estímulo inflamatório, tal como a infecção, numa cavidade fechada, tal como a vesícula ótica permite o estudo de neutrófilos e macrófagos quimiotaxia e da fagocitose. Uma ressalva de injecção de bactérias para dentro da vesícula ótica é que a capacidade dos neutrófilos de forma eficiente em bactérias fagocitam cavidades cheias de líquido, pode ser dependente ...

Streptococcus iniae é um importante agente patogénico aquático que é capaz de causar doença sistémica, tanto nos animais e seres humanos uma. Enquanto S. iniae é responsável por grandes perdas na indústria da aquicultura, é também um potencial patógeno zoonótico capaz de causar doença em hospedeiros humanos imunocomprometidos com patologias clínicas semelhantes às causadas por outros patógenos humanos estreptococos. Dadas as suas semelhanças com patógenos humanos, é importante estudar S. iniae patogênese da doença no contexto de um hospedeiro natural. Um modelo adulto zebrafish de S. infecção iniae revelaram infiltração de leucócitos robusto hospedeiras para o local da infecção localizada, bem como um tempo rápido para acolher a morte, um tempo muito curto para envolver o sistema imunitário adaptativo 7. A fim de obter um profundo olhar para a resposta imune inata de S. iniae infecção in vivo, é necessário utilizar um modelo que se torna mais fácil para nem invasivo imagens ao vivo. O peixe-zebra larval tem uma série de vantagens que o tornam um modelo vertebrado cada vez mais atraente para o estudo de interações patógeno-hospedeiro. Peixe-zebra são relativamente baratos e fáceis de usar e manter em relação aos modelos de mamíferos. A imunidade adaptativa não é funcionalmente maduros até 4-6 semanas após a fertilização, mas larvas têm um sistema imunológico inato vertebrado altamente conservada com complemento, Toll-like receptors, citocinas e neutrófilos e macrófagos com capacidades de antimicrobianos, incluindo a fagocitose e explosão respiratória 2-6, 8-11. Além disso, a tratabilidade genética e transparência óptica dos estádios de desenvolvimento embrionário e larval de desenvolvimento permitir a geração de linhas transgénicas estáveis ​​com células imunes marcadas por fluorescência que permitam examinar interacções hospedeiro-agente patogénico em tempo real in vivo. A geração destas linhas transgénicas usando uma proteína photoconvertible como Dendra2 permite o seguimento da célula hospedeira origem e destino indivíduo ao longo do curso da infecção 12. Ao desenvolver um modelo de infecção de larvas de peixe-zebra, o local escolhido de microinjeção vai determinar se uma infecção é inicialmente localizada ou sistêmica. Infecções arterial sistêmica na veia caudal ou duto de Cuvier são mais comumente usados ​​para estudar patógenos microbianos em peixes-zebra e são úteis para o estudo de interações entre hospedeiro e células microbianas, respostas de citocinas, e as diferenças na virulência entre isolados do patógeno. Para os microrganismos que crescem mais lento, no início de injecção dentro do saco vitelino de um embrião em fase de 16-1,000 célula pode ser usado para gerar uma infecção sistémica 13,14, com o estágio de desenvolvimento ideal para microinjecção de um microrganismo com crescimento lento, verificou-se que entre a fase 16-128 célula 15. No entanto, gema de injeções sac de muitos micróbios em fases posteriores do desenvolvimento de acolhimento tendem a ser letal para tele hospedar devido ao ambiente rico em nutrientes para o micróbio e falta de leucócitos de infiltração 16-18. Uma infecção localizada geralmente resulta na migração dirigida de leucócitos para o sítio da infecção que pode ser facilmente quantificado com imagem não invasiva. Este tipo de infecção pode permitir a dissecção dos mecanismos que medeiam a migração de leucócitos, bem como de investigação diferentes capacidades fagocíticas e migratórias de várias populações de leucócitos. Infecções localizadas também são úteis quando se examina as diferenças de virulência entre cepas bacterianas, bem como o estudo dos mecanismos de invasão de micróbios desde barreiras host físicos devem ser cruzados para uma infecção localizada para se tornar sistêmica. Peixe-zebra são normalmente levantada, a temperaturas de 25-31 ° C, 19, mas que também pode ser mantida a temperaturas tão elevadas como 34-35 ° C para os estudos da capacidade de invasão de agentes patogénicos humanos com determinados requisitos rigorosos de temperaturapara a virulência 20, 21. Muitos locais diferentes foram usados ​​para gerar uma infecção bacteriana localizada inicialmente incluindo o ventrículo rombencéfalo 22, músculo dorsal da cauda 18, 23 cavidade pericárdica e vesícula ótica (do ouvido), 5, 16, 24. No entanto, verificou-se que a injecção de bactérias no músculo da cauda pode causar danos nos tecidos e inflamação independente das bactérias, o que pode distorcer os resultados quando se investiga a resposta dos leucócitos 13. Embora menos danos está associada a injeção na parte posterior do cérebro e, embora seja inicialmente desprovido de leucócitos em embriões jovens, o ventrículo hindbrain constantemente ganha mais células imunes ao longo do tempo como microglia fixar residência. O ventrículo hindbrain também é um local mais difícil de imagem. A vesícula ótica é uma cavidade oca fechado, sem acesso directo à vasculatura 25, 26. É normalmente desprovido de Leukocytes leucócitos, mas podem ser recrutadas para a vesícula ótica, em resposta a estímulos inflamatórios, tais como a infecção. É também um local preferido para a microinjecção de bactérias na idade de 2-3 dias após a fertilização do peixe-zebra (dpf) por causa da facilidade de imagem e a visualização da injecção. Por isso, escolhemos a vesícula ótica como o nosso local de infecção bacteriana localizada.

<table><tbody><tr><td>Eppendorfs MidSci de 1,7 ml</td><td></td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>tubo Falcon de 14 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>agulha de 27 G x &frac12; pol.</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA ágar</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>Escopo de dissecação</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D2650</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 prova</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>Pinças finas</td><td>finas Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Pente de gel</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4,2 mm de largura, 1,5 mm de espessura</td></tr><tr><td>Pratos</td><td></td><td></td> com fundo de vidro <td>Feito à medida, perfurando um orifício de 16 - 18 mm no centro de um fundo de prato de cultura de tecidos de 35 mm e colocando uma lamínula redonda #1 de 22 mm no orifício e selando com uma fina camada de Adesivo Óptico Norland 68 curado por luz UV.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de alta fusão</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Olympus</td><td>com sistema</td><td></td>FV-1000</tr><tr><td>Baixo derretimento agarose</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Tritech (Narishige)</td> <td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microinjeção</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Espectromedidor de nanogota</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-feniltioureia (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr>Ciências de <td>Microscopia Eletrônica</td> <td>Paraformaldheyde</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Vermelho</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>Protease peptona</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células pequenas</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de injeção capilar de vidro de parede fina</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína (3-aminobenzoato de etila)</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Fluka Biochemika</td><td>Rolamento 92144</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem não invasivo do imunitário inatas response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; streptococcus iniae</em&gt; infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

O patógeno aquático, Streptococcus iniae, é responsável por mais de 100 milhões de dólares em perdas anuais para a indústria da aquicultura e é capaz de causar doença sistêmica em ambos os peixes e seres humanos. Uma melhor compreensão da S. iniae patogênese da doença requer um sistema modelo adequado. A docilidade genética e a transparência óptica dos primeiros estágios de desenvolvimento de peixe-zebra para permitir a geração de imagem e não-invasivo de linhas transgénicas com fluorescente etiquetado células imunitárias. O sistema imunológico adaptativo não é totalmente funcional até várias semanas após a fertilização, mas larvas do peixe têm um sistema imunológico inato vertebrado conservada com ambos os neutrófilos e macrófagos. Assim, a geração de um modelo de infecção de larvas permite o estudo da contribuição específica da imunidade inata no controle de S. infecção iniae. O local de microinjecção determinará se é uma infecçãosistémica ou localizada inicialmente. Aqui, apresentamos nossos protocolos para injecção vesícula ótica de peixe-zebra idade 2-3 dias após a fertilização, bem como as nossas técnicas de imagiologia confocal fluorescente de infecção. Um site infecção localizada permite a observação de invasão microbiana inicial, o recrutamento de células hospedeiras e disseminação da infecção. Nossos resultados, utilizando o modelo de larvas de peixe-zebra de S. infecção iniae indicam que peixe-zebra pode ser usado para examinar as diferentes contribuições de neutrófilos e macrófagos do hospedeiro em infecções bacterianas localizadas. Além disso, descreve-se como photolabeling de células imunes pode ser usado para rastrear o destino da célula hospedeira indivíduo durante o curso da infecção.

Microinjeção de S. iniae na vesícula ótica (Figura 1 e Figura 2) resulta em uma resposta do hospedeiro inicialmente localizadas. Quando injectado correctamente, as bactérias devem ser vistas apenas na vesícula ótica e não no tecido circundante ou sangue. Isto pode ser visualizado durante a microinjecção usando corante vermelho de fenol (Figura 1A). Alternativamente, se bactérias marcadas são injetados, uma varredura rápida de larvas infectadas imediatamente apó...

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração e imagem de uma infecção bacteriana localizada na vesícula ótica do peixe-zebra.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

O objetivo geral deste procedimento é microinjetar larvas de peixe-zebra com um patógeno bacteriano, Streptococcus IEA, para a obtenção de imagens em tempo real e não invasivas da resposta imune do hospedeiro. Isso é realizado primeiramente carregando a agulha de microinjeção com uma suspensão bacteriana e alinhando larvas de peixe-zebra anestesiadas no molde de agarose para injeção. Em seguida, a suspensão bacteriana é microinjetada na vesícula otólica das larvas.Em seguida, as larvas injetadas são montadas em agarose de baixo ponto de fusão. Por fim, as células imunes do hospedeiro são marcadas com fotoetiqueta para facilitar o rastreamento e a infecção é analisada por microscopia confocal. Em última instância, a microinjeção de Streptococcus iniae na vesícula otica e a subsequente fotoetiqueta e microscopia confocal são utilizadas para estudar a resposta imune do hospedeiro em larvas de peixe-zebra.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a injeção na veia caudal, é que a injeção na vesícula otológica produz uma infecção bacteriana localizada, permitindo a imagem não invasiva das interações entre o hospedeiro e o patógeno na larva de peixe-zebra t

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Embriões do zebrafish transparente provaram anfitriões modelo útil para visualizar e interações de estudo funcional entre as células imunes inatas e patógenos bacterianos intracelulares, tais...

A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

O desenvolvimento rápido, tamanho pequeno e transparência de peixes-zebra são enormes vantagens para o estudo do controle imunológico inato de...

Não-invasivos de imagem de candidíase disseminada em larvas do peixe

Fonte: Zhang, X., et al. Um modelo de embrião de peixe-zebra para visualização in vivo e análise intravital da infecção por Staphylococcus aureus associada a biomateriais. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra imagens de fluorescência de embriões de peixe-zebra injetados com Staphylococcus aureus, permitindo a quantificação da progressão da infecção e distribuição bacteriana para avaliar o impacto das microesferas de biomateriais nas interações patógeno-hospedeiro in vivo.

 Imagem de fluorescência de infecção bacteriana associada a biomateriais em embriões de peixe-zebra

Fonte: Zhang, X. et. al., Um modelo de embrião de peixe-zebra para visualização in vivo e análise intravital da infecção por Staphylococcus aureus associada a biomateriais. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um modelo de embrião de peixe-zebra para estudar infecções ligadas a biomateriais implantados. A injeção de Staphylococcus aureus com microesferas de poliestireno aumenta a sobrevivência bacteriana, confirmando o papel promotor de infecção dos materiais implantados.

Análise in vivo de infecções bacterianas associadas a implantes usando embriões de peixe-zebra

Este vídeo demonstra o rastreamento do recrutamento de leucócitos usando larvas de peixe-zebra transgênicas que expressam proteína fluorescente verde fotoconversível. A pré-injeção de bactérias marcadas com corante fluorescente vermelho na vesícula ótica e a indução da fotoconversão permitem a observação da migração, fagocitose e dispersão dos leucócitos por todo o corpo, fornecendo informações valiosas sobre a dinâmica da resposta imune.

Rastreamento de leucócitos baseado em fotoconversão em peixe-zebra transgênico infectado por bactérias

O vídeo demonstra uma técnica de dispositivo de ferimento e aprisionamento de peixe-zebra para observar a infecção por patógenos fúngicos marcados com fluorescência em larvas de peixe-zebra. A infecção inicial atrai macrófagos e, à medida que a infecção persiste, o recrutamento de neutrófilos progride no local da injeção.

Uma técnica zWEDGI para visualizar larvas de peixe-zebra infectadas por patógenos fúngicos

A resposta imune inata protege os organismos contra uma infecção patogénica. Um componente crítico da resposta imune inata, a explosão respiratória de fagócitos, gera espécies reativas de oxigênio, que matam microorganismos invasores. Nós descrevemos um ensaio de explosão respiratória que quantifica as espécies reativas de oxigênio produzidas quando a resposta imune inata é induzida quimicamente.

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

Estudar os primeiros eventos de progressão de células pré-neoplásicas e interação célula imune inato é fundamental para compreender e tratar o câncer. Aqui nós descrevemos um método para induzir condicionalmente transformações de células epiteliais e do subsequente imagens ao vivo de interação célula imune inato com HRAS G12V expressando células da pele em larvas do peixe.

Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

Embriões de peixe-zebra opticamente transparentes são amplamente utilizados para estudar e visualizar em tempo real as interações entre microrganismos patogênicos e as células imunes inatas. A microinjeção de Mycobacterium abscessus, combinada com imagens de fluorescência, é usada para examinar características patogênicas essenciais, como a formação de cordão em embriões de peixe-zebra.

Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish

Modelos de infecção sistêmica e localizada de peixe-zebra para o vírus influenza A humano são demonstrados. Usando um modelo de infecção sistêmica, o peixe-zebra pode ser usado para rastrear medicamentos antivirais. Usando um modelo de infecção localizada, o peixe-zebra pode ser usado para caracterizar as respostas das células imunes do hospedeiro.

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

O presente estudo descreve um modelo de embrião de zebrafish para visualização in vivo e intravital análise de infecção biomaterial associada ao longo do tempo com base em microscopia de fluorescência. Este modelo é um sistema promissor complementando modelos animais mamíferos, tais como modelos de rato para o estudo in vivo de infecções associadas a biomaterial.

Um modelo de embrião de Zebrafish para na visualização de Vivo e Intravital análise de biomateriais-associado Staphylococcus aureus infecção

Aprenda a microinjetar bactérias Streptococcus iniae na vesícula ótica de larvas de peixe-zebra para imagem não invasiva da resposta imune inata. Este método permite visualizar interações hospedeiro-patógeno em tempo real.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de

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