Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de Streptococcus iniae Infection

O objetivo geral deste procedimento é microinjetar larva de peixe-zebra com um patógeno bacteriano estreptococo IEA para imagens não invasivas ao vivo da resposta imune do hospedeiro. Isso é feito carregando primeiro a agulha de microinjeção com uma suspensão bacteriana e alinhando as larvas de peixe-zebra anestesiadas no molde de injeção de agarose. Em seguida, a suspensão bacteriana é microinjetada na vesícula ótica das larvas.

Em seguida, as larvas injetadas são montadas em agarose de baixo ponto de fusão. Gus finalmente hospeda células imunes são rotuladas com foto para facilitar o rastreamento e a infecção é fotografada usando um microscópio confocal. Em última análise, a microinjeção de estreptococos IEA na vesícula ótica e a subsequente marcação fotográfica e microscopia confocal são usadas para estudar a resposta imune do hospedeiro das larvas de peixe-zebra.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a injeção de veias de mimo, é que a injeção de vesículas óticas gera uma infecção bacteriana localizada para permitir imagens não invasivas das interações do patógeno hospedeiro na larva transparente do peixe-zebra. Para começar, prepare uma solução de aro de 1,5 a 2% de alto ponto de fusão em meio E três e leve ao microondas até que a solução esteja límpida. Depois de resfriado, despeje um pouco do aros em uma placa de Petri, adicionando apenas o suficiente para cobrir o fundo do prato e agitar.

Assim que o aros solidificar, coloque um pente de gel enxaguado e seco por cima, de modo que a extremidade sólida fique apenas apoiada no topo da placa de Petri e a extremidade entalhada toque o aros. Certifique-se de que o pente esteja o mais horizontal possível, criando um ângulo de 30 graus em relação à camada inferior de aros. Despeje uma pequena quantidade adicional de aros na interface entre o pente e a camada inferior de aros para que a camada de aros fresca cubra os poços do favo.

Deixe esfriar completamente antes de remover o pente. Em seguida, usando uma ponta de pipeta, remova todos os pedaços pendentes de aros dos poços. Despeje E três médios em cima do molde de injeção e armazene a quatro graus Celsius.

Depois de preparar o inóculo SNEA e as larvas de peixe-zebra para injeções de acordo com o protocolo de texto, ligue o microinjetor e defina o intervalo de tempo para milissegundos. Abra a válvula no tanque de dióxido de carbono para deixar o gás entrar na linha. A pressão do microinjetor deve ler aproximadamente 20 PSI vórtice a cultura SNEA preparada em vermelho de fenol e PBS e usar uma ponta de micro carregador para carregar dois a três microlitros da cultura em uma agulha de injeção capilar puxada, montar a agulha carregada em um micromanipulador conectado a um suporte magnético e posicioná-lo sob um microscópio estéreo de modo que a agulha fique em um ângulo de aproximadamente 45 a 65 graus em relação à base do microscópio.

Primeiro quebre a ponta da agulha usando uma pinça fina, pressione o pedal do microinjetor para dispensar uma gota do inóculo na ponta da agulha. Use a barra de escala na lente ocular do microscópio para medir o diâmetro da gota. O diâmetro da gota deve ser de aproximadamente 0,10 milímetro, o que equivale a cerca de um nanolitro de volume.

Para ajustar o tamanho da gota, ajuste a configuração de duração no microinjetor ou use uma pinça fina para prender mais a ponta da agulha. O tempo de injeção deve estar entre 20 e 35 milissegundos para evitar muitos danos aos tecidos. Em seguida, usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira um peixe por poço para cada um dos 12 poços do molde de injeção.

Em seguida, com uma haste de vidro, laço de cabelo ou ponta de plástico, posicione suavemente as larvas de modo que as cabeças fiquem apontadas para a parte de trás do microscópio e os sacos vitelinos. Aponte a orelha esquerda das larvas para o teto. Quando as larvas estiverem prontas para a injeção, use os botões do micromanipulador para alinhar a agulha carregada com a vesícula ótica para que ambas fiquem no mesmo campo de visão.

Com a ponta da agulha, perfure a camada epitelial externa da vesícula ótica de modo que a ponta fique dentro da vesícula. Agora, usando uma pressão baixa o suficiente para não romper a cavidade, pressione o pedal para injetar um nanolitro da dose desejada de SNEA. Se a injeção for bem-sucedida, a vesícula ótica, mas não o tecido circundante, deve ser preenchida com um inóculo vermelho de fenol.

Retraia cuidadosamente a agulha para fora das larvas e, com uma ampliação de cinco vezes, mova a placa de injeção manualmente para que as larvas fiquem à vista. Se injetar bactérias marcadas com fluorescência sob um microscópio fluorescente, escaneie visualmente as larvas injetadas e mantenha apenas aquelas onde a deposição de bactérias ocorreu apenas dentro da vesícula ótica para garantir que o volume de injeção permaneça o mesmo ao longo do experimento. Depois de injetar a cada 48º embrião, injete uma gota de suspensão bacteriana em um tubo de centrífuga de 1,7 mililitro contendo 100 microlitros de PBS estéril.

Em seguida, coloque os 100 microlitros em placas de trado THY mais P e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Para determinar o UFC no volume de injeção, quando um grupo inteiro de 12 larvas na rampa de injeção tiver sido injetado, use cuidadosamente uma pipeta de transferência de plástico para remover as larvas dos poços e coloque-as em uma nova placa de Petri. Remova a solução trica e substitua por aproximadamente dois mililitros de meio E três fresco para permitir que as larvas se recuperem.

Incubar os embriões de acordo com o protocolo de texto. Depois de preparar aros com trica, de acordo com o protocolo de texto no estágio do microscópio estereoscópico, use uma pipeta de transferência para colocar quatro a cinco larvas anestesiadas em um prato com fundo de vidro. Remova a solução trica e aro do banho-maria a 55 graus Celsius e deixe esfriar em temperatura ambiente por um a dois minutos.

Enquanto isso, remova o máximo possível de líquido das larvas anestesiadas. Em seguida, despeje os agros resfriados no prato até que cerca de metade da superfície esteja coberta. Em seguida, gire o prato para espalhar o aros.

Pegue as larvas que flutuaram para os lados do prato e pipete-as de volta para o centro. Em seguida, sob o microscópio estéreo, use uma ponta de pipeta longa para posicionar suavemente as larvas conforme desejado para a imagem. A vesícula ótica posiciona as larvas de modo que a vesícula ótica direita fique voltada para cima e a vesícula ótica esquerda fique plana contra o fundo do prato.

Deixe o aros esfriar por cerca de 10 minutos antes de mover o prato. Em seguida, pipete suavemente um pouco de trica e E três solução em cima da camada de aros para mantê-la úmida. Para visualizar as amostras, use uma varredura Zack com os lasers de 488 nanômetros e 543 nanômetros.

Use a varredura de linha contínua para ajustar a potência do laser e o ganho do detector. Verifique se não há fluorescência vermelha convertida acidentalmente na janela de controle de aquisição de imagem. Na configuração de estímulo, selecione a ferramenta de uso do scanner e escolha principal, selecione o laser de 405 nanômetros e defina-o para 70% de potência.

Em seguida, usando a opção círculo, defina a região de interesse na vesícula ódica sob a configuração de início do estímulo, selecione a ativação em série com uma pré-ativação de um quadro e um tempo de ativação de 60.000 milissegundos na janela de configuração de aquisição. Sob o título de verificação de tempo, escolha dois intervalos de um minuto cada, um para pré e outro para pós-conversão de foto. Inicie a série de lapso de tempo para iniciar a conversão de fotos da região de interesse definida.

Finalmente, escaneie a amostra usando um Zack e os lasers de 488 e 543 nanômetros. Para visualizar a fluorescência vermelha convertida na foto, bem como qualquer fluorescência verde remanescente, a microinjeção de SNEA em vermelho de fenol na vesícula ótica resulta em uma resposta inicialmente localizada do hospedeiro que, quando injetada corretamente, deve ser vista apenas na vesícula ótica e não no tecido circundante ou no sangue. Alternativamente, se bactérias marcadas forem injetadas, uma varredura rápida das larvas infectadas imediatamente após a injeção pode confirmar que as bactérias estão apenas no tecido ótico e não no tecido circundante.

Os locais de microinjeção de infecção inicialmente localizada são úteis para estudar a quimiotaxia leucocitária, conforme mostrado aqui. O recrutamento de leucócitos pode ser quantificado por Sudan, coloração preta de grânulos de neutrófilos ou fixação de formaldeído de linhas transgênicas fluorescentes usando linhagens transgênicas de peixe-zebra que expressam a proteína fluorescente verde. O dendro dois, especificamente em macrófagos ou neutrófilos, revelou que a injeção de NEA na vesícula ótica desencadeou o recrutamento de neutrófilos e macrófagos e a fagocitose de bactérias dentro de 60 minutos após a infecção.

Nesta figura, DRA dois macrófagos marcados que foram recrutados para a vesícula ótica cinco horas após a infecção foram fotoconvertidos e rastreados nas 24 horas seguintes. Embora algumas células fotoconvertidas permaneçam na vesícula ótica ou na região da cabeça, algumas também foram encontradas disseminadas por todo o corpo das larvas, como visto aqui. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como microinjetar estreptococos n EEA na vesícula ótica do peixe-zebra envelhecido três dias após a fertilização.

Isso inclui alinhar as larvas anestesiadas no molde de injeção e carregar a agulha com o inóculo bacteriano. Duas micro bactérias injetoras na vesícula ótica. Três, montando larvas infectadas em aeros de baixo derretimento e quatro, usando um microscópio confocal para marcar os leucócitos do hospedeiro e visualizar as interações do patógeno leucocitário in vivo.