Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de

O objetivo geral deste procedimento é microinjetar larvas de peixe-zebra com um patógeno bacteriano, Streptococcus IEA, para a obtenção de imagens em tempo real e não invasivas da resposta imune do hospedeiro. Isso é realizado primeiramente carregando a agulha de microinjeção com uma suspensão bacteriana e alinhando larvas de peixe-zebra anestesiadas no molde de agarose para injeção. Em seguida, a suspensão bacteriana é microinjetada na vesícula otólica das larvas.

Em seguida, as larvas injetadas são montadas em agarose de baixo ponto de fusão. Por fim, as células imunes do hospedeiro são marcadas com fotoetiqueta para facilitar o rastreamento e a infecção é analisada por microscopia confocal. Em última instância, a microinjeção de Streptococcus iniae na vesícula otica e a subsequente fotoetiqueta e microscopia confocal são utilizadas para estudar a resposta imune do hospedeiro em larvas de peixe-zebra.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a injeção na veia caudal, é que a injeção na vesícula otológica produz uma infecção bacteriana localizada, permitindo a imagem não invasiva das interações entre o hospedeiro e o patógeno na larva de peixe-zebra transparente. Para começar, prepare uma solução de agarose de alto ponto de fusão a 1,5-2% em meio E3 e aqueça-a no micro-ondas até que a solução fique límpida. Após o resfriamento, despeje parte da agarose em uma placa de Petri, adicionando apenas o suficiente para cobrir o fundo da placa, e gire suavemente.

Uma vez que o aros tenha solidificado, coloque um pente para gel lavado e seco em cima, de modo que a extremidade sólida esteja apenas apoiada na parte superior da placa de Petri e a extremidade entalhada esteja tocando o aros. Certifique-se de que o pente esteja o mais horizontal possível, formando um ângulo de 30 graus em relação à camada inferior de aros. Despeje uma quantidade adicional pequena de aros na interface entre o pente e a camada inferior de aros, de modo que a nova camada de aros cubra os poços do pente.

Deixe esfriar completamente antes de remover o pente. Em seguida, utilizando a ponta de uma pipeta, remova quaisquer partes salientes de aros dos poços. Despeje o meio E três sobre a fôrma de injeção e armazene a quatro graus Celsius.

Após preparar o inóculo de SNEA e as larvas de peixe-zebra para as injeções de acordo com o protocolo descrito no texto, ligue o microinjetor e defina o intervalo de tempo em milissegundos. Abra a válvula do tanque de dióxido de carbono para permitir a entrada do gás na linha. A pressão do microinjetor deve indicar aproximadamente 20 PSI. Vortexe a cultura de SNEA preparada em fenol vermelho e PBS e use uma ponta de microloader para carregar dois a três microlitros da cultura em uma agulha de injeção de capilar esticada. Monte a agulha carregada em um micromanipulador conectado a um suporte magnético e posicione-a sob um microscópio estereoscópico, de modo que a agulha fique em um ângulo de aproximadamente 45 a 65 graus em relação à base do microscópio.

Primeiro, quebre a ponta da agulha usando uma pinça fina, pressione o pedal do microinjetor para dispensar uma gota do inóculo na ponta da agulha. Use a escala do ocular do microscópio para medir o diâmetro da gota. O diâmetro da gota deve ser aproximadamente 0,10 milímetro, o que equivale a cerca de um nanolitro de volume.

Para ajustar o tamanho da gota, regule a configuração de duração no microinjetor ou use pinças finas para cortar mais da ponta da agulha. O tempo de injeção deve estar entre 20 e 35 milissegundos para evitar danos excessivos aos tecidos. Em seguida, utilizando uma pipeta de transferência de plástico, transfira um peixe por poço para cada um dos 12 poços do molde de injeção.

Em seguida, com uma haste de vidro, alça de cabelo ou ponteira plástica, posicione suavemente as larvas de modo que as cabeças estejam voltadas para a parte traseira do microscópio e as bolsas de vitelo contra a lateral esquerda do poço. Oriente a orelha esquerda das larvas para cima, em direção ao teto. Quando as larvas estiverem prontas para a injeção, use os botões do micromanipulador para alinhar a agulha carregada com a vesícula ótica, de forma que ambas estejam no mesmo campo de visão.

Com a ponta da agulha, perfure a camada epitelial externa da vesícula otica de modo que a ponta fique logo no interior da vesícula. Agora, usando uma pressão baixa o suficiente para não romper a cavidade, pressione o pedal do pé para injetar um nanolitro da dose desejada de SNEA. Se a injeção for bem-sucedida, a vesícula otica, mas não o tecido circundante, deverá preencher-se com um inóculo de vermelho de fenol.

Retire cuidadosamente a agulha das larvas e, sob ampliação de cinco vezes, mova manualmente a placa de injeção para que a larva fique visível. Se estiver injetando bactérias marcadas com fluorescência sob um microscópio fluorescente, examine visualmente as larvas injetadas e mantenha apenas aquelas em que a deposição de bactérias ocorreu exclusivamente dentro da vesícula otica, para garantir que o volume de injeção permaneça constante ao longo do experimento. Após injetar cada 48º embrião, injete uma gota de suspensão bacteriana em um tubo de centrífuga de 1,7 mililitro contendo 100 microlitros de PBS estéril.

Em seguida, plaque os 100 microlitros em placas de THY mais P auger e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Para determinar a UFC no volume de injeção, quando um grupo inteiro de 12 larvas na rampa de injeção tiver sido injetado, use cuidadosamente uma pipeta plástica de transferência para remover as larvas dos poços e colocá-las em uma nova placa de Petri. Remova a solução trica e substitua por aproximadamente dois mililitros de meio E três fresco para permitir que as larvas se recuperem.

Incube os embriões de acordo com o protocolo descrito no texto. Após preparar os aros com trica, de acordo com o protocolo descrito no texto, na platina do microscópio estereoscópico, utilize uma pipeta de transferência para colocar quatro a cinco larvas anestesiadas em um recipiente de vidro com fundo de vidro. Remova a solução de trica e aro do banho-maria a 55 graus Celsius e deixe esfriar à temperatura ambiente por um a dois minutos.

Enquanto isso, remova o máximo possível de líquido das larvas anestesiadas. Em seguida, despeje o agros resfriado na placa até que cerca da metade da superfície esteja coberta. Em seguida, agite suavemente a placa para espalhar o aros.

Pegue as larvas que flutuaram para as laterais da placa e pipete-as de volta para o centro. Em seguida, sob o microscópio estereoscópico, use uma ponteira de pipeta longa para posicionar suavemente as larvas conforme desejado para a aquisição de imagens. Para a vesícula otica, posicione as larvas de modo que a vesícula otica direita fique voltada para cima e a vesícula otica esquerda fique plana contra o fundo da placa.

Deixe os aros esfriarem por cerca de 10 minutos antes de mover o recipiente. Em seguida, pipete suavemente um pouco da solução trica e E três sobre a camada de aros para mantê-la úmida. Para visualizar as amostras, utilize um scanner Zack com os lasers de 488 nanômetros e 543 nanômetros.

Utilize a varredura contínua de linha para ajustar a potência do laser e o ganho do detector. Verifique se não há fluorescência vermelha acidentalmente fotoconvertida na janela de controle de aquisição de imagem. Nas configurações de estímulo, selecione a ferramenta usar scanner e escolha principal, selecione o laser de 405 nanômetros e defina-o em 70% da potência.

Em seguida, utilizando a opção de círculo, defina a região de interesse na vesícula odic; na configuração de início do estímulo, selecione a ativação em série com uma pré-ativação de um quadro e um tempo de ativação de 60.000 milissegundos na janela de configurações de aquisição. No menu Varredura Temporal, escolha dois intervalos de um minuto cada, um para pré e outro para pós-fotoconversão. Inicie a série de imagens em intervalos para iniciar a fotoconversão da região de interesse definida.

Finalmente, escaneie a amostra utilizando um Zack e os lasers de 488 e 543 nanômetros. Para visualizar a fluorescência vermelha fotoconvertida, bem como qualquer fluorescência verde remanescente, a microinjeção de SNEA com fenol vermelho na vesícula otica resulta em uma resposta localizada inicialmente no hospedeiro, que, quando injetada corretamente, deve ser observada apenas na vesícula otica e não nos tecidos circundantes ou no sangue. Alternativamente, se bactérias marcadas forem injetadas, uma rápida análise dos larvas infectados imediatamente após a injeção pode confirmar que as bactérias estão somente na vesícula otica e não no tecido circundante.

Os locais de microinjeção de infecção inicialmente localizada são úteis para o estudo da quimiotaxia de leucócitos, conforme mostrado aqui. O recrutamento de leucócitos pode ser quantificado por meio da coloração com Sudan Black dos grânulos de neutrófilos ou da fixação com formaldeído de linhagens transgênicas fluorescentes, utilizando linhagens transgênicas de peixe-zebra que expressam a proteína verde fluorescente Dendra dois, especificamente em macrófagos ou neutrófilos. Observou-se que a injeção de NEA na vesícula otica desencadeou o recrutamento de neutrófilos e macrófagos e a fagocitose de bactérias dentro de 60 minutos após a infecção.

Nesta figura, dois macrófagos marcados com DRA que foram recrutados para a vesícula otica cinco horas após a infecção foram fotoconvertidos e rastreados nas 24 horas seguintes. Embora algumas células fotoconvertidas permaneçam na vesícula otica ou na região da cabeça, outras também foram encontradas disseminadas por todo o corpo das larvas, como visto aqui. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como realizar a microinjeção de streptococcus n EEA na vesícula otica de peixes-zebra com três dias de idade após a fertilização.

Isso inclui: um, alinhar larvas anestesiadas no molde de injeção e carregar a agulha com o inóculo bacteriano; dois, microinjetar bactérias na vesícula otica; três, montar larvas infectadas em ágarose de baixo ponto de fusão; e quatro, utilizar um microscópio confocal para fotomarcar leucócitos do hospedeiro e imagens das interações entre leucócitos e patógenos in vivo.