Name: Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda a infusão estereotáxica de beta-amilóide oligomérico no hipocampo de camundongos para estudar efeitos tóxicos neuronais em modelo de doença neurodegenerativa. Este método permite investigar patologias celulares em vivo.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame conceder NS081333 (a CMT), concessão Associação NIRG-10-171721 de Alzheimer e Instituto Nacional de Saúde Mental de concessão MH096702 (a UH), e do Instituto Nacional sobre Envelhecimento financiado pela pesquisa da doença de Alzheimer Centro da Universidade de Columbia concessão piloto AG008702 (para YYJ e JB).

Nota: Para toda a experimentação animal, Institucional e diretrizes nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório foram seguidas. 1. Prepare Instrumentos Cirúrgicos e Soluções para Cirurgia <ol><li> Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável. </li><li> Preparar etanol a 70% por diluição de 200 proof de etanol absoluto com grau molecular de água desionizada destilada estéril. </li><li> Fixe a agulha G 29 para a seringa Hamilton. Limpe o interior do Hamilton seringa e agulha através da elaboração e da água de ejecção nanopura repetidamente durante 1 min. Repita este procedimento com etanol 70%. <ol><li> Retirar o êmbolo e a agulha da seringa de Hamilton. Ar secar as peças em um fluxo laminar vertical S / N. </li><li> Irradiar a agulha e seringa com luz ultravioleta durante 30 minutos antes da utilização. </li></ol></li><li> Preparar a solução salina através da dissolução de NaCl em água de grau molecular para um peso final a concentração em volume de 0,9%. Esterilização emze a solução filtrando-a através dos poros do filtro 0,2 m. </li></ol> 2. Prepare oligomica Ap 1-42 <ol><li> Monomerize e ressuspender recombinante humana Ap 1-42 em DMSO a 5 mM exactamente como descrito na publicação da Fa &quot;e outros 13. </li><li> Diluir 5 mM Ap 1-42 com estéril (1x) PBS 100 mM na véspera da cirurgia. </li><li> Misture bem a solução por trituração. </li><li> Incubar Ap 1-42 solução durante 12 horas a 4 ° C. Nota: As soluções de controle, tais como a diluição de DMSO em PBS ou mexidos / retrocesso Ap 1-42 deve ser preparado da mesma forma que Ap 1-42. </li></ol> 3. determinar as coordenadas de injeção <ol><li> Use os adultos atlas do cérebro do rato para determinar a exacta ântero-posterior (AP), medial-lateral (ML), e dorso-ventral (DV) coordenadas para a região do cérebro de 14 interesse. Nãote: Para ilustrar a técnica, escolhemos o giro denteado do hipocampo como o alvo com as seguintes coordenadas a partir do bregma: AP, -2,00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2,2 mm. O sinal negativo que precede o valor AP indica que ele é de 2,00 mm posterior do bregma. O sinal ± precedendo o valor ML indica a direção esquerda e direita do centro. Por fim, o sinal negativo que precede o DV indica que está em movimento ventral a partir da superfície do cérebro. </li></ol> 4. estereotáxica Setup Moldura <ol><li> Usar uma máscara cirúrgica rosto, jaleco limpo, e luvas cirúrgicas estéreis. </li><li> Limpe instrumento estereotáxico e adaptador de mouse com etanol 70%. </li><li> Deite-campo cirúrgico estéril sobre o balcão. </li><li> Colocar o aparelho estereotáxico com um adaptador do rato no topo da cobertura cirúrgica estéril. </li><li> Limpe a almofada de aquecimento do mouse com etanol 70%. Posicione a almofada de aquecimento sobre a cama quadro estereotáxico. Use labora uso geralfita rotulagem tory a fita para baixo a almofada de aquecimento sobre a cama adaptador de mouse. <ol><li> Fixe a almofada de aquecimento para a bomba de água morna recirculator acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Ligue a bomba recirculator água morna e definir a temperatura a 37 ° C, e depois esperar até que ele atinja a temperatura. </li></ol></li><li> Apor o 50 ul seringa Hamilton com uma agulha G 29 sobre a armação estereotáxica aparafusando-o sobre o eixo vertical, motorizada de injecção de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Ligue o esterilizador talão e esperar até atingir a temperatura programada pelo fabricante. Nota: Este é usado para esterilizar instrumentos de aço inoxidável entre os animais. Leva instrumentos de 20 segundos de contacto com os grânulos de esterilização. </li><li> Ligue placa quente e configurá-lo para 42 ° C e coloque uma gaiola vazia limpo no topo. </li><li> Enquanto a seringa Hamilton está fixada no quadro estereotáxico usar o i motorizado estereotáxiconjector para elaborar o 1-42 solução de Ap. Nota: Elaborar mais de 4 mL da solução para a seringa e, em seguida, usar o injector estereotáxico para definir o volume de injecção. Operar o injector de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 5. Preparação de animais <ol><li> Determinar o peso do rato utilizando a escala de pesagem. </li><li> Anestesiar rato com cetamina / xilazina coquetel a 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina por injecção intraperitoneal (IP). Monitore a profundidade da anestesia com a perda de toe pitada reflexo. </li><li> Após o mouse está sedado tomar a máquina de cortar cabelo e fazer a barba a cabeça para expor a pele ao longo do crânio. </li><li> Colocar o rato no topo da almofada de aquecimento na parte superior do leito estereotáxico. </li><li> Use a espátula para abrir a boca e colocar os dentes incisivos dentro do guarda-dentes. Prenda o porta-objetivas sobre a face do mouse. Apertá-lo com cuidado e não muito apertado. </li><li> Posição as travessas de ouvido bilaterais em conduto auditivo para proteger a cabeça. Mova cada barra transversal até que ela atinge o crânio, e, em seguida, gire o parafuso para prendê-la. <ol><li> Para garantir que a cabeça está garantido usar o dedo indicador para empurrar suavemente para baixo na cabeça. Se a cabeça está devidamente assegurado que não vai dar para fora ou mover quando pressionado. </li></ol></li><li> Aplique uma gota de creme para os olhos ou colírio para os olhos para mantê-los úmidos. Certifique-se de que os olhos são úmido durante todo o procedimento cirúrgico. </li><li> Para desinfectar o local cirúrgico usar cotonetes estéreis para aplicar a solução de betadine para a pele sobre o crânio, seguido de etanol a 70%. Realize o betadine alternada e 70% de etanol limpeza mais 2 vezes. </li></ol> 6. Cirurgia e Infusão <ol><li> Use um bisturi para fazer uma incisão de 2-3 mm na linha média do couro cabeludo, e então usar uma tesoura fina reta para estender a linha de incisão para 1,0-1,5 cm para expor a sutura sagital, bregma e lambda do crânio, marcos as coordenadas estereotáxicas que se baseiam. Use micro grampos para manter a pele separados. Nota: As posições bregma e lambda são explicados no atlas do cérebro do rato &quot;O cérebro do rato em estereotáxica coordenadas&quot; 14. </li><li> Pegue um cotonete, mergulhe-o em solução salina estéril, e usá-lo para limpar o crânio. Em seguida, use um cotonete seco e limpo para secar o crânio. </li><li> Use uma caneta de ponta fina estéril para marcar um ponto no bregma. Utilizar o micromanipulador estereotáxico para posicionar a seringa de Hamilton para que a ponta da agulha apenas toca o ponto no bregma. <ol><li> Grave coordenar a DV. </li><li> Para verificar se o eixo PA do nível do crânio é mover a seringa Hamilton posteriormente de modo a que a ponta da agulha atinge o ponto de lambda. </li><li> Grave a posição DV. Certifique-se coordena o DV para bregma e lambda são de 0,5 mm. Nota: O objectivo é minimizar a diferença entre DV bregma e lambda. </li></ol></li><li> Usa-osicromanipulator para retornar a agulha da seringa Hamilton ponta de volta para o ponto bregma. </li><li> Grave a posição inicial AP. </li><li> Calcular a posição final AP subtraindo 2,00 milímetros a partir da AP a partir de coordenadas. </li><li> Use o micromanipulador para reposicionar a agulha de seringa Hamilton com a AP cota final. </li><li> Grave coordenar o atual ML. </li><li> Calcule a esquerda e direita que termina ML coordena adicionando ou subtraindo 1,3 milímetros a partir da partida ML coordenadas. </li><li> Use o micromanipulador para mover a agulha da seringa Hamilton, quer coordenar a ML terminando. <ol><li> Toque a ponta da agulha para a superfície do crânio em ambos terminam coordenadas ML e gravar as coordenadas DV e certifique-se os valores estão dentro de 0,5 mm. Nota: O objectivo é minimizar a diferença entre os dois DV terminando coordenadas ML. </li><li> Enquanto em um final de coordenadas puxar a agulha para cima 0,5-1 cm sobre o crânio. Pegue uma caneta de ponta fina estéril para marcar um ponto no the a superfície do crânio. Repita este passo para o lado contralateral do crânio. </li></ol></li><li> Balançar a seringa Hamilton clara para fora do caminho. </li><li> Anexar 0,8 milímetros cabeça de perfuração para a broca. Pegue a furadeira com ambas as mãos, defina os cotovelos sobre a superfície da mesa para a estabilidade, e posicionar a cabeça da broca ligeiramente acima do ponto sharpie sobre a esquerda ou direita ML coordenadas. Activa a broca, diminuir a ponta da broca para a superfície do crânio para introduzir um orifício no crânio. Repita este passo para o lado contralateral. Nota: Alguns hemorragia pode ocorrer a partir dos furos recentemente introduzidos. Se houver sangramento, em seguida, use um cotonete limpo e seco para enxugar o sangue. </li><li> Mova a seringa Hamilton de volta para a posição sobre um dos buracos ML recentemente introduzidas. Abaixe a agulha Hamilton apenas após o crânio. Neste ponto, deve ter cuidado para não perfurar o cérebro. Para certificar-se de que a agulha passou o crânio levar o seu dedo indicador e empurre a agulha contra o crânio para fazer sure a agulha não sair do furo. </li><li> Grave coordenar o DV partida. </li><li> Calcule coordenar o DV terminando subtraindo 2,2 milímetros do DV começando coordenadas. </li><li> Abaixe a agulha até o DV terminando coordenadas. </li><li> Activar a bomba injectora estereotáxico para bombear 4 ul de Ap 1-42 no giro dentado, a uma taxa de 0,5 mL / min. </li><li> Quando a conclusão da perfusão deixar a agulha permanecer no lugar durante um 1 minuto adicional de minimizar o refluxo da solução para fora do local de injecção. </li><li> Mover a agulha para o outro lado do cérebro e repetir as etapas de 6,13-6,18. </li></ol> 7. Remoção Animal e Cuidados Pós-Operatórios <ol><li> Soltar os bares de ouvido e proteção para o rosto / nariz. Retirar o mouse do aparelho. </li><li> Use um estudante fórceps padrão normal para puxar fechar o couro cabeludo e, em seguida, selar a ferida com sutura. </li><li> Injectar 1 ml de solução salina estéril para o mouse via IP para a hidratação. </li><li> Emject buprenorfina (0,1 mg / kg) por via subcutânea para aliviar a dor. </li><li> Manter o rato na gaiola vazia limpo situado no topo de 42 ° C chapa quente até que ele acorda, em seguida, devolvê-lo à sua gaiola de habitação com amplo comida e água. </li><li> Administrar buprenorfina, por injecção subcutânea a cada 12 horas durante 3 dias para alívio da dor. </li></ol> Remoção 8. Sutura <ol><li> Anestesiar rato com cetamina / xilazina coquetel a 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg xlyazine por IP. Nota: Isto é feito 7-10 dias após a cirurgia. </li><li> Use um estudante fórceps padrão standard e uma tesoura fina reta para remover a sutura. </li><li> Injectar 1 ml de solução salina estéril para o mouse via IP para a hidratação. </li><li> Manter o rato em uma gaiola vazia limpo situado no topo de 42 ° C chapa quente até que ele acorda, e, em seguida, devolvê-lo à sua gaiola de habitação com amplo comida e água. </li></ol> 9. sacrifício de animais e processamento de tecidos <ol><li> Anestesiar o mouse e perfuse com paraformaldeído a 4% 15, remover o cérebro, e processá-lo para cryosectioning 16. Nota: O tempo de sacrifício de animais depende do experimentador. No entanto, para os nossos estudos, escolheu 7 e 14 dias após a cirurgia. </li></ol>

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<li>Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+the+rat+dentate+gyrus%3A+an+immunocytochemical+and+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study.</a> Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).</li>
<li>Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+mediates+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+memory%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta mediates memory formation.</a> Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Para conseguir um sucesso Ap 1-42 injeção do experimentador ou cirurgião deve: 1) utilizar uma técnica asséptica; 2) identificar corretamente a região do cérebro de interesse com coordenadas precisas; 3) ser capaz de garantir adequadamente o mouse no quadro estereotáxico com o cérebro nivelado no eixo AP e ML; 4) tem a capacidade de operar o micromanipulador com precisão; 5) Garantir cuidados pós-operatórios adequada. Se essas etapas principais são seguidos do mouse deve sobreviver à cirurgia sem infecção obs...

Depósitos de placas amilóides, que são compostos de beta-amilóide (Ap 1-42), são um elemento-chave da patologia da doença de Alzheimer (DA). Numerosos estudos têm demonstrado que níveis elevados ou tóxicos de recombinante oligomeric Ap 1-42 provocar a morte neuronal, sináptica distrofia, perda e disfunção; bem como de aprendizagem e memória défices 1-4. Regiões do cérebro afetadas incluem o hipocampo, no córtex e estruturas subcorticais tais como o cérebro anterior basal ea 5,6 amígdala. Até à data, existem vários modelos de camundongos transgênicos que tentam simular o Aâ 1-42 patologia da AD. Dependendo da estirpe estes animais revelar-se útil para examinar seleccione características patológicas da DA. Infelizmente, com a excepção de duas linhas transgénicas, APP23 e 5XFAD, estes ratinhos não replicar completamente a perda neuronal, um aspecto chave da AD. Mesmo com a perda neuronal observada em APP23 e 5XFAD, a obser morte neuronalved foi sutil, dependente da idade, e isolado para algumas regiões selecione 7,8. A infusão direta de oligomeric Ap 1-42 no cérebro do rato do tipo selvagem é um excelente modelo in vivo que replica o aspecto morte neuronal de amyloidopathy 1,9,10. Ao contrário dos modelos de ratinho transgénicos vulgarmente utilizados o modelo de infusão oligomérico Ap 1-42 é ideal para elevar de forma aguda Ap 1-42 níveis de um modo espacial e temporal. A vantagem da utilização de ratinhos de tipo selvagem para este modelo de compensação ou elimina efeitos colaterais potenciais de mutações introduzidas em linhas de ratos transgénicos. Estudos anteriores têm demonstrado que a infusão de níveis tóxicos de Ap 1-42 no hipocampo provoca a morte neuronal na proximidade do local de injecção dentro de 1 semana 1. Além disso, consistente com a observação de que Ap 1-42 é tóxico para os neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal 11população colinérgicos neurônio (BFCN) que se projecta para o hipocampo diminui 20-50% no prazo de 7-14 dias após a beta-amilóide infusão 1,10 em camundongos, de forma eficaz permitindo que para os exames de circuitos neuronais isolado no cérebro. Desde projecto BFCN ipsilateralmente ao giro dentado do hipocampo 12, para a maior parte de controlo / veículo e oligoméricos Ap 1-42 soluções podem ser injectados em ambos os lados do cérebro, permitindo que sejam feitas comparações entre os hemisférios direito e esquerdo 1. Neste relatório, iremos fornecer uma metodologia cirúrgica ea injeção detalhado para adultos de tipo selvagem camundongos C57BL / 6J. Esta estirpe do mouse é escolhido por causa de sua ampla utilização na pesquisa. Tecnicamente, qualquer região do cérebro podem ser direcionados para perfusão, no entanto aqui, vamos utilizar o giro denteado do hipocampo como o alvo para ilustrar a técnica.

<table><tbody><tr><td>Cetamina HCl (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1049007</td><td>100 mg de cetamina por 1 kg de</td></tr><tr><td>animal Xilazina (20 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>não disponível</td><td>10 mg de xilazina por 1 kg de animal</td></tr><tr><td>Buprenex (0,3 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1217793</td><td>0,1 mg de buprenex por 1 kg de animal</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>David Teplow/UCLA</td><td>não disponível</td><td>100 &mu; M; Este amilóide foi usado no artigo</td></tr><tr><td>A & beta; 1-42</td><td>Bachem</td><td>H-1368</td><td>Pode ser usado no lugar da amilóide do laboratório Teplow</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80B</td><td>Pode ser usado no lugar do amiloide do laboratório Teplow</td></tr><tr><td>Scrambled A&beta; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-46B</td><td>Pode ser usado como o peptide do controle comparando A&beta; 1-42</td></tr><tr><td>Anticorpo NU4 (anticorpo amilóide oligomérico)</td><td>Presente de William Klein/Northwestern U.</td><td>não disponível</td> 1<td>:2.000 diluição</td></tr><tr><td>Anti-Amyloid Oligomeric Antibody&nbsp; (Coelho Policlonal)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB9234</td><td>Pode ser usado no lugar do Nu4; precisa ser testado pelo usuário final</td></tr><tr><td>6E10 Anticorpo (Monoclonal Mouse) (Anticorpo Amilóide)</td><td>Biolegend</td><td>sig-39320</td><td>1:1,000 diluição</td></tr><tr><td>ChAT Antibody (Cabra Policlonal)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td>1:100 diluição</td></tr><tr><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td>Siga as instruções do fabricante para use</td></tr><tr><td>Prolongar o reagente antidesbotamento de ouro com DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Use ao cobrir lâminas de lamínula</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>não disponível</td><td>Solução a 2%</td></tr><tr><td>Etanol Absoluto (200 provas)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Para fazer etanol a 70% para higienização e desinfecção</td></tr><tr><td>Novex 10-20% Tricine gel</td><td>Life Technologies</td><td>EC6625BOX</td><td>Para separar A&beta; 1-42</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC1675</td><td>Para executar 10-20% de géis de tricina</td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC3675</td><td>Para transferir 10-20% de géis de tricine</td></tr><tr><td>SuperSignal Western Blot Enhancer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46640</td><td>Para realçar A&beta; sinal 1-42; siga o protocolo do fabricante</td></tr><tr><td>Protran BA79 Membrana de Nitrocelulose Blotting, 0.1 &mu; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10402088</td><td>Para transferir 10-20% de géis de tricina</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td>Eletroforese aparatus para execução de 10-20% de géis de tricina</td></tr><tr><td>GenTeal Lubricant Eye Gel</td><td>Novartis</td><td>não disponível</td><td>Para manter os olhos do rato úmidos durante a cirurgia; pode ser encontrado em farmácias locais &#160; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Refresh Optive Lubricant Eye Drops</td><td>Allergan</td><td>não disponível</td><td>Para manter os olhos do rato úmidos durante a cirurgia; pode ser encontrado em farmácias locais; Pode ser usado no lugar do Armazenamento GenTeal</td></tr><tr><td>Betadine</td><td></td><td>50998</td><td>Para higienizar e desinfetar</td></tr><tr><td>Espátula Redonda/Cônica&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td>Para abrir a boca de animais</td></tr><tr><td>Grampos de Bulldog Serrefines (Dimensões da Mandíbula 9X1,6 mm; Comprimento 28 milímetros)</td> <td>Ferramentas</td><td>finas 18050-28</td><td>da ciência opcionais; Para manter a pele do couro cabeludo separada durante a injeção</td></tr><tr><td>Tesoura Fina Reta (Ponta 25 mm; Comprimento 11,5 cm)</td> <td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>14060-11</td><td>Para cortar o couro cabeludo</td></tr> <tr><td># 3 Cabo de bisturi</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>10003-12</td><td></td></tr> <tr><td># 11 Lâmina Cirúrgica</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>10011-00</td><td>Para fazer incisão no couro cabeludo</td></tr><tr><td>Fórceps de Padrão Padrão de Estudante (Pontas Dims. 2,5x1,5 mm; Comprimento 11,5 cm)</td> <td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>91100-12</td><td>Para manter o couro cabeludo fechado durante a sutura</td></tr><tr><td>Kit Combo de Aparador</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201</td><td>Para barbear o cabelo</td></tr><tr><td>T/Bomba Recirculador de Água Morna&nbsp;</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>TP-700</td><td>Para aquecer animais durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Almofada de Warmining Reutilizável (5" x 10")</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>TPZ-0510FEA</td><td>Para prendê-lo ao recirculador de água quente T / Pump para aquecer o animal durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Micro furadeira sem fio</td><td>Stoelting</td><td>58610</td><td>Use rebarbas de aço de 0,8 mm para fazer furos no crânio</td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico padrão de laboratório com mouse e Adaptador de Rato Neonatal</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>Just for Mouse Stereotaxic Instrument</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Pode usar isso no lugar do Stoelting Cat. #51615</td></tr><tr><td>Quintessential Stereotaxic Injector</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de Contas de Vidro Seco</td><td>Stoelting</td><td>50287</td><td>Para esterilizar instrumentos de aço inoxidável</td></tr><tr><td>Campo Cirúrgico Estéril (18" x 26")</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton 50 ml, Modelo 705 RN SYR, NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7637-01</td><td>Para injeção cerebral; use seringas diferentes para diferentes soluções</td></tr><tr><td>Agulha de 29 G, Cubo Pequeno RN NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-06</td><td>Para fixação na seringa Hamilton para injeção cerebral</td></tr><tr><td>Seringas de tuberculina BD de 1 ml</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>Para administração de anestesia e soro fisiológico</td></tr><tr><td>30 G Agulha (0,5")</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Para administração de anestesia e soro fisiológico</td></tr><tr><td>Balança Eletrônica Portátil Série CS (Ohaus)</td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Para pesar animais para determinar a dose de anestesia</td></tr><tr><td>Placa quente (Dimensões da Placa Superior 7,25x7,25 pol)</td><td>VWR</td><td>47751-148</td><td>Para aquecer animais pós-cirurgia</td></tr><tr><td>Sutura de Seda Sofsilk C-1 Corte 3/8, 12 mm</td><td>Covidien</td><td>S1173</td><td>Para fechar feridas</td></tr><tr><td>Adesivo de Tecido Vetbond (3M)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361931</td><td>Opcional: para auxiliar no fechamento de feridas; Use com sutura.</td></tr><tr><td>Aplicadores Estéreis de Haste de Madeira com Ponta de Algodão</td><td>Fisher scientific</td><td>22-029-488</td><td>Para limpeza e secagem de feridas cirúrgicas</td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Superfrost Plus da Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-550-15</td><td>Para recolher secções cerebrais</td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393241</td><td>Para montagem de lâminas de microscópio</td></tr><tr><td>Filtro de Seringa Nalgene da Thermo Scientific 0.2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>194-2520</td><td>Para esterilizar solução salina</td></tr><tr><td>Marcadores de pele de ponta dupla estéreis por Viscot Medical</td><td>Medline</td><td>VIS1422SRL91</td><td>Para marcar coordenadas no crânio</td></tr></tbody></table>

infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho hippocampus

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que afecta o envelhecimento da população. Uma característica neuropatológica chave da doença é a sobre-produção de beta-amilóide e a deposição de placas de amilóide-beta em regiões do cérebro dos indivíduos afectados. Ao longo dos anos, os cientistas têm gerado numerosos modelos de rato da doença de Alzheimer que tentam reproduzir a patologia beta-amilóide. Infelizmente, os modelos de ratinho única imitar selectivamente as características da doença. A morte neuronal, um efeito proeminente nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer, é notoriamente ausente nestes ratinhos. Por isso, nós e outros têm utilizado um método de infundir diretamente espécies oligoméricas solúveis de beta-amilóide - Formas de amilóide-beta que têm sido provada a ser mais tóxico para os neurônios - stereotaxically no cérebro. Neste relatório nós utilizamos camundongos C57BL / 6J para documentar esta técnica cirúrgica de aumentar os níveis de beta-amilóide em uma região do cérebro select. Oinfusão alvo é o giro dentado do hipocampo, porque esta estrutura do cérebro, juntamente com o cérebro anterior basal, que é ligado pelo circuito colinérgico, representa uma das áreas de degeneração na doença. Os resultados de elevação beta-amilóide no giro denteado através de infusão estereotáxico revelam aumentos na perda de neurónios no giro dentado no prazo de 1 semana, enquanto existe um aumento concomitante na morte de células e perda de neurónios colinérgicos no membro vertical da banda diagonal de Broca do prosencéfalo basal. Estes efeitos são observados até 2 semanas. Nossos dados sugerem que o atual modelo de infusão de beta-amilóide fornece um modelo alternativo do mouse para abordar a morte dos neurônios específicos região em uma base de curto prazo. A vantagem deste modelo é que a beta-amilóide pode ser elevada de um modo espacial e temporal.

O presente método de preparação de humano recombinante oligomérico Ap 1-42 produz espécies oligoméricas solúveis constituídos por monómeros, dímeros, trímeros e tetrâmeros (Figura 1A). Estes baixo peso molecular de espécies Aâ 1-42, mas não as fibrilas e placas, foram mostrados em várias configurações para ser mais tóxico para os neurônios 1,4,9,17-19. Para determinar se ou não oligomeric Ap 1-42 induz a morte dos neurônios no cérebro do rato Ap 1-42</sub...

Aqui, apresentamos um protocolo para infusão cerebral estereotáxica direta de beta-amilóide. Esta metodologia fornece um modelo alternativo de camundongo in vivo para abordar os efeitos de curto prazo da beta-amilóide nos neurônios cerebrais.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

O objetivo geral deste procedimento é injetar estereotáxico um Liga mérico a beta 1 42, no giro dentado do hipocampo. Isso é feito primeiro preparando uma liga mérica, uma solução beta 1 42. O segundo passo é determinar as coordenadas de injeção.Em seguida, exponha cirurgicamente o crânio do animal e introduza dois orifícios para inserção da agulha. A etapa final é mover a agulha da seringa para sua posição final e infundir um beta 1 42. Em última análise, o método de injeção estereotáxica Abeta 1 42 é usado para examinar os efeitos tóxicos da Abeta 1 42 em um animal vivo.A principal vantagem desta técnica sobre os modelos de camundongos transgênicos Abeta 42 existentes é que o oligomérico ALA 42 pode ser elevado de maneira especial e temporal e reproduzir de forma confiável a patologia de morte celular que está faltando nos modelos de camundongos transgênicos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da doença de Alzheimer, como a forma como os processos patológicos se espalham na doença de Alzheimer. Para iniciar este procedimento, raspe a cabeça de um camundongo anestesiado para expor a pele.Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em um quadro estereotáxico. Em seguida, prenda seus incisivos na proteção dos dentes e uma peça nasal sobre o rosto do mouse. Depois disso, posicione as barras auriculares no mauss auditivo para prender a cabeça para verificar.Se a cabeça estiver presa, pressione-a suavemente e certifique-se de que ela não se mova. Em seguida, aplique pomada em ambos os olhos para manter a umidade. Em seguida, desinfete o local da cirurgia aplicando Betadine na pele sobre o crânio, seguido de etanol a 70% com cotonetes estéreis.Execute a limpeza alternada de Betadine e etanol mais duas vezes. Agora faça uma incisão de dois a três milímetros na linha média do couro cabeludo com um bisturi. Use uma tesoura reta e fina para estender a linha de incisão até cerca de 1,0 centímetros para expor a sutura sagital bgma e lambda do crânio.Depois disso, use uma pinça para separar a pele. Limpe o crânio com um cotonete estéril, embebido em soro fisiológico estéril. Em seguida, use um cotonete limpo e seco para secar o crânio.Em seguida, marque um ponto. Na Bre ma, posicione a seringa Hamilton usando o micro manipulador de forma que a ponta da agulha toque o ponto no bgma. Em seguida, registre a coordenada DV, marque um ponto no ponto Lambda, certifique-se de que o eixo AP do crânio esteja nivelado movendo a seringa posteriormente para o ponto Lambda.A ponta da agulha deve tocar o ponto Lambda como fez com o ponto BGMA. Depois disso, grave a posição DV. As coordenadas DV para Bre, MA e Lambda devem estar dentro de 0,5 milímetros.Agora retorne a ponta da agulha para o ponto BMA. Registre a posição inicial do AP. Em seguida, calcule a posição final do AP subtraindo dois milímetros do ap inicial.Coordene e reposicione a agulha da seringa para a coordenada AP final. Em seguida, registre a coordenada de ML atual. Calcule as coordenadas ml finais esquerda e direita adicionando ou subtraindo 1,3 milímetros do ml inicial.Coordene e mova a agulha da seringa para as coordenadas ML finais. Toque a ponta da agulha na superfície do crânio em ambas as coordenadas ML finais e certifique-se de que as coordenadas DV estejam dentro de 0,5 milímetros. Enquanto estiver na coordenada final ml, puxe a agulha para cima, 0,5 a um centímetro acima do crânio.Marque um ponto no crânio com um marcador de ponta extra fino de cor escura. Repita esta etapa para o lado contralateral do crânio. Em seguida, afaste a seringa.Faça um furo no ml esquerdo ou direito. Coordene no crânio usando uma broca de 0,8 milímetro. Repita esta etapa para o lado contralateral.Depois, mova a seringa para um dos orifícios recém-introduzidos. Abaixe a agulha logo após o crânio e tome cuidado para não perfurar o cérebro para garantir que a agulha tenha passado pelo crânio. Empurre suavemente a agulha contra o crânio para garantir que a agulha não saia do orifício.Em seguida, registre a coordenada DV inicial. Calcule o dv final. Coordene subtraindo 2,2 milímetros do DV.Coordinate inicial e abaixe a agulha até o db final.Coordene e ajuste a bomba injetora estereotáxica para infundir quatro microlitros de um beta 1 42 no giro dentado a uma taxa de 0.5 microlitros por minuto. Após a perfusão, deixe a agulha permanecer no lugar por mais um minuto para minimizar o refluxo da solução para fora do local da injeção. Depois disso, mova a agulha para o outro lado do cérebro e repita o procedimento.Agora, desaparafuse as barras auriculares. Use uma pinça de padrão padrão de estudante para fechar o couro cabeludo e selar a ferida com a sutura. Retire o protetor de nariz e remova o mouse.Injete um mililitro de solução salina estéril no camundongo inicialmente para hidratação e injete buprenorfina a 0,1 miligramas por quilograma por via subcutânea para alívio da dor. Depois, transfira o mouse para uma gaiola vazia limpa colocada em cima de uma placa quente de 42 graus Celsius até que ele acorde. Em seguida, retorne o mouse à gaiola com bastante comida e água.Esta figura mostra a infusão de um beta 1 42 e veículo nos respectivos giros dentados esquerdo e direito de um camundongo de nove meses de idade. Linhas tracejadas retratam a injeção traída e as setas mostram o giro dentado colapsado. Dentro de uma semana após a injeção de Abeta 1 42, o giro dentado exibiu níveis elevados de Abeta 1 42 na camada molecular e na camada de células polimórficas perto do local da injeção aos sete e 14 dias.Abeta 1 42 provocou aumentos na coloração positiva do túnel e diminuições na espessura do giro denteado, confirmando os efeitos neurodegenerativos de Abeta 1 42. Aqui, um traçador retrógrado de ouro fluorado foi co-injetado com Abeta 1 42 no giro denteado. Sete dias após a injeção, o fluorgold foi detectado no prosencéfalo basal, sugerindo o transporte retrógrado do marcador através dos neurônios colinérgicos.Neurônios positivos para fluorouro no prosencéfalo basal foram escolhidos para quantificação. Sete dias após a injeção, Abeta 1 42 provocou aumentos no túnel e diminuições no bate-papo. Neurônios positivos no cérebro basal quatro Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em aproximadamente 30 minutos se executada corretamente.Após este procedimento, outros métodos podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como estudos de mecanismo molecular para abordar o efeito mecanicista da infusão de amilóide no cérebro. Gostaria de agradecer por assistir ao nosso vídeo e espero que o método seja útil em seus experimentos.

stereotaxic-infusion-oligomeric-amyloid-beta-into-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Uma característica da doença de Alzheimer é a elevação da...

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Este vídeo demonstra uma técnica para a infusão contínua de anticorpos específicos do peptídeo beta-amilóide (Aβ) no hipocampo de um rato. O estudo emprega a implantação de um sistema de cânula bilateral para uma infusão controlada de anticorpos específicos do peptídeo Aβ juntamente com a infusão de oligômeros Aβ solúveis (Aβo) no hipocampo de ratos para estudar as interações entre os oligômeros e os anticorpos.

Infusão controlada de anticorpos específicos do peptídeo Aβ e oligômeros Aβ no hipocampo de ratos

Este vídeo demonstra a infusão estereotáxica precisa de beta amilóide no giro dentado para estabelecer um modelo de camundongo da doença de Alzheimer. A determinação precisa de coordenadas e a entrega controlada de proteínas beta amilóides resultam em degradação neuronal, interrompendo o processamento da memória e contribuindo para o desenvolvimento da doença de Alzheimer.

Infusão cerebral estereotáxica direta de proteínas beta-amilóide para um modelo de doença de Alzheimer

Fonte: Arango-Lievano, M. et. al., Imagem longitudinal in vivo da cerebrovasculatura: relevância para doenças do SNC. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens in vivo de dois fótons para visualizar placas amilóides marcadas com fluorescência e vasculatura cerebral. A fluorescência azul marca as placas, enquanto a fluorescência verde destaca os vasos sanguíneos cerebrais. Um mapa 3D da região de interesse e imagens em mosaico de alta resolução revelam interações detalhadas de placas...

Imagens in vivo de vasos cerebrais e placas amilóides em um modelo de camundongo com doença de Alzheimer

Fonte: Slezia, A. et al. A entrega eletroforética de ácido γ-aminobutírico (GABA) no foco epiléptico previne convulsões em camundongos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a entrega eletroforética de ácido gama-aminobutírico (GABA) para inibir a atividade convulsiva em um camundongo anestesiado. Ele descreve as etapas envolvidas na implantação da sonda, registro da atividade neural, indução de convulsões e entrega controlada de GABA por meio de uma bomba de íons microfluídica para avaliar...

Entrega eletroforética de GABA no foco epiléptico de um camundongo anestesiado

MicroRNAs têm papéis importantes na estrutura e função cerebral. Aqui nós descrevemos um método para impor miRNA hipocampo sobre-expressão usando a injeção estereotáxica de um lentivírus miRNA-expressando engenharia. Esta abordagem pode servir como um modo relativamente rápido para avaliar...

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

O amilóide-β (Ap) -injected modelo animal permite a administração de uma quantidade e espécie de fragmentos de Ap definidos e reduz as diferenças individuais dentro de cada grupo de estudo. Este protocolo descreve a injecção intracerebroventricular (ICV) de Ap sem instrumentos estereotáxicas, permitindo a produção de anormalidades comportamentais Alzheimer-like em ratinhos normais.

Injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em ratos normais para induzir Acutely déficits cognitivos Alzheimer-like

Este artigo ilustra como a expressão de receptores de neurotransmissores pode ser quantificada e o padrão analisado em sinapses com elementos pré e pós-sinápticos identificados usando uma combinação de transdução viral de ferramentas optogenéticas e a técnica de imunomarcação de réplica de fratura por congelamento.

Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala

Para estudar os efeitos de Aβo in vivo, desenvolvemos um modelo baseado em infusões repetidas de Aβo solúvel no hipocampo juntamente com infusão contínua de anticorpo Aβo (6E10) no hipocampo usando bombas osmóticas para neutralizar o efeito neurotóxico de Aβo.

Neurodegeneração em um modelo animal de Chronic beta-amilóide Oligï¿½ero Infusion é contrariada pelo anticorpo Tratamento infundido com bombas osmóticas

Cirurgia no útero de sobrevivência em camundongos permite a manipulação molecular de expressão de genes durante o desenvolvimento. Aqui nós descrevemos o uso de alta freqüência ultra-sonografia para guiar a injeção de vetores retrovirais para o cérebro do rato no dia embrionário (E) 9.5.

Ultra-som guiada microinjeção em parte frontal do cérebro do rato In Utero Em E9.5

Aprenda a infusão estereotáxica de beta-amilóide oligomérico no hipocampo de camundongos para estudar efeitos tóxicos neuronais em modelo de doença neurodegenerativa. Este método permite investigar patologias celulares em vivo.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

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