Name: As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T15:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a isolar células T específicas para citomegalovírus de grau clínico usando um sistema automatizado de captura de citocinas. Este método simplifica a imunoterapia adotiva sem necessidade de instalações GMP.

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Agradecemos à Miltenyi Biotec, Alemanha, por fornecer reagentes e equipamentos CliniMACS Prodigy para estudos de avaliação. Agradecemos a George T. McNamara (departamento de pediatria, MD Anderson Cancer Center) pela revisão do manuscrito. Apoio financeiro: Subsídio Básico do Centro de Câncer (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Fundo Burroughs Wellcome; Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas; Fundação de Pesquisa Global CLL; Propriedade de Noelan L. Bibler; Fundação Gillson Longenbaugh; Harry T. Mangurian, Jr., Fundo para Imunoterapia de Leucemia; Instituto de Terapia Personalizada do Câncer; Sociedade de Leucemia e Linfoma; Fundação de Pesquisa do Linfoma; Fundo de Rede de Instituições Irmãs do MDACC; Fundação Miller; Sr. Herb Simons; Sr. e Sra. Joe H. Scales; Sr. Thomas Scott; Fundação Nacional para Pesquisa do Câncer; Fundação de Pesquisa do Câncer Pediátrico; Fundação Infantil William Lawrence e Blanche Hughes.

1. Preparação dos materiais em condições estéreis (Veja Materiais e Equipamentos Table) <ol><li> Prepare a 3 L de tampão de PBS / EDTA suplementado com albumina de soro humano (HSA) para uma concentração final de 0,5% (w / v). </li><li> Prepare 1 litro de solução saco de qualidade clínica a 0,9% de cloreto de sódio (NaCl) e 2 L de GMP grau de meio de cultura celular. </li><li> Preparar 60 nmol de CMV-específico antigénio peptídico cocktail por reconstituição de um frasco de CMV pp65 com 8 ml de água estéril. </li><li> Transferir CMV pp65 peptídeo cocktail em um volume de 50 ml usando um saco de congelação Luer / Pico interligação e prenda com uma pinça de bloqueio para evitar a posterior distribuição de cocktail para o conjunto de tubos. Abra a pilha conjunto de tubos de enriquecimento (TS 500) em condições estéreis. </li><li> Usando soldador tubulação estéril, ligue saco de congelação peptídeo cocktail na conexão do tubo de válvula 2 de conjunto de tubos TS 500. Não abra o peptídeo cocktail saco braçadeira neste momento. </li><li> Remover 1 x 10 9 tNc do produto de partida e de suspensão celular em tampão / EDTA PBS contendo 2,5% de HSA para um volume total de 50 ml. Injectar o produto celular em um saco de transferência de 150 ml. </li></ol> 2. Preparação e Utilização do Sistema Automatizado celular Enrichment (Veja Materiais e Equipamentos Table) <ol><li> Ligue o sistema de enriquecimento de células (Figura 1B) e selecione o programa &quot;CCS_IFN-γ Enrichment&quot;. Observar uma interface de usuário que mostra telas com instruções e imagens orientadores o operador através do procedimento. </li><li> Digite o parâmetro &quot;operador&quot; e &quot;Tubing Set P / N Não&quot;. Em seguida, instalar o dispositivo Tubing Set 500 para o enriquecimento de células automatizado, conforme as instruções exibidas na tela do monitor interativo. </li><li> Siga o passo a passo exibidas na tela para ligar a médio e buffers para o dispositivo. Número da ficha de catálogo e número de lote dos reagentes antes connecting para o instrumento. </li><li> Após a verificação final do conjunto de tubos, abra o grampo do saco peptídeo cocktail. Abra o saco de médio e iniciar priming automática do conjunto de tubos. </li><li> Após o passo de iniciação está completo, complementar HSA (2,5%) em tampão de NaCl no saco de reservatório (200 ml) com a ajuda do soldador tubo estéril. Transferir o produto celular partida para o &quot;saco de Aplicação&quot; usando o soldador tubulação estéril. </li><li> Conecte CCS (IFN-y) em reagentes respectiva tubagem através de adaptadores. Digite horário preferido para coletar uma fração do material celular antes processo de enriquecimento. Comente e verificar a exatidão de todos os dados / parâmetros inseridos. Iniciar o processo. </li><li> Antes do início do processo de enriquecimento de células automatizado, retirar o saco de Controlo de Qualidade (BQC, fracção inicial (ori), contém cerca de 1,3 ml em 100 ml de conteúdo câmara diluída com tampão / EDTA PBS). Selar a BQC, pesar e armazenar a 4 ° C. </li><li> Comece o enrichmeprocesso nt. No final do processo, as células alvo vai ser eluída com um volume aproximado de tampão de eluição a partir do saco de reservatório. </li><li> Selar o não-alvo celular Bag (NTCB, fração negativo = neg) e Bolsa alvo celular (TCB, fração positiva = pos) e pesar cada saco. Os pesos serão usados ​​mais tarde para o cálculo dos números de células. </li><li> Imediatamente após o procedimento de enriquecimento recolher duas alíquotas por fracção para análise de citometria de fluxo, e armazenar o restante das amostras a 4 ° C. Utilize uma aliquota da amostra para determinação da contagem de células e a outra aliquota de amostra para a análise do desempenho de enriquecimento (quadro 1). </li><li> Remover o conjunto de tubo do instrumento de enriquecimento de células. Transfira o arquivo de log para uma unidade USB para uso futuro. NOTA: Todos os reagentes devem ser preparados em condições estéreis. O uso de uma capa Segurança Biológica tipo II é altamente recomendável. Use aférese produto celular em estado estacionário (não mobilizado) isolado a partir de uma saudávelCMV-dador seropositivo para enriquecer as células T específicas de antigénio CMV. Apenas licenciada pela FDA HSA deve ser usado. O tampão para a preparação de células deve ser mantida a 19 ° C a 25 ° C como temperaturas mais elevadas ou mais baixas irão resultar em ambientes reduzida pureza e um rendimento reduzido das células alvo. </li></ol> 3. celular Contagem Determinação <ol><li> Aqui as alíquotas de BQC, NTCB TCB e para as contagens de células, como mostrado na Tabela 1. Adicionar CD45-VoBlue para cada alíquota (título de 1,11) e incuba-se no escuro durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 1,5 ml de solução de lise de glóbulos vermelhos recentemente preparada (1x) para a fracção original e fracção negativa, a 450 ul de solução preparada de fresco de lise de glóbulos vermelhos para a fracção positiva, todas as fracções e incubar durante 15 min à TA. </li><li> Imediatamente antes da análise, adiciona-se iodeto de propídio para uma concentração final de 1 ug / ml (1: 100 de diluição de 100 ug / mL). Use contador de células automático para determinar a contagem de células e vihabilidade. Use software recomendado aparelho contador de células para citometria de fluxo análise. Determinar as contagens absolutas de leucócitos para as fracções originais, negativos e positivos. NOTA: A contagem de células de leucócitos viáveis ​​por ml das amostras colhidas para análise de contagem de células é determinado usando o software analisador de células recomendadas. </li><li> Definir a região como mostrado na Figura 2 (região 5, leucócitos viáveis). Utilize a seguinte estratégia gating para determinar a contagem de células. Uma fracção de leucócitos viável no original é mostrada na Figura 2. </li><li> As regiões indicadas (Figura 2, 1-6), hierarquicamente são como se segue: 1: Tempo portão → 2: células individuais → 3: células CD45 + ^ 4: Os leucócitos (detritos excluído) → 5: leucócitos viáveis ​​→ 6: linfócitos viáveis </li><li> Repita os mesmos passos para determinar as contagens de células para as fracções positivas e negativas. Calcula-se a contagem de células de toda a fracçãoconsiderando o factor de diluente da amostra e o volume total da fracção (Tabela 2). </li></ol> 4. O exame do desempenho de separação <ol><li> Lavam-se as alíquotas de BQC, NTCB e células fracção TCB com tampão PBS / EDTA previamente arrefecido / 0,5% de soro AB. Centrifugar as células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul mistura de coloração anticorpo-fluorocromo contendo: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue e anti-IFN-y-PE (01:11) e título incubar no escuro durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de lise de glóbulos vermelhos recentemente preparada (1x) e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células num volume adequado de PBS / EDTA Tampão / 0,5% de soro AB. </li><li> Adicionou-se iodeto de propídio para uma concentração final de 1 ug / ml, imediatamente antes da análise (1: 100 dilutina de 100 ug / mL). Realizar análise de citometria de fluxo para avaliar a pureza da amostra. </li><li> Utilize a seguinte estratégia gating para calcular as células T CD3 + em estratégia viável Supressão de leucócitos para a determinação das células T CD3 + é mostrada na fracção positiva após o processo de enriquecimento CCS. As regiões indicadas (Figura 3A e 3B, 1-6) estão hierarquicamente ligados como se segue: As células CD45 + → 4:: 1: tempo portão → 2: Células individuais → 3 células (detritos excluídos) → 5: leucócitos viáveis ​​→ 6: As células viáveis ​​CD3 + populacionais </li><li> Determinação das frequências de células CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + e CD8 + IFN-γ + células T após processo de enriquecimento de CCS (Tabela 2). </li><li> Utilizar a estratégia de propagação para determinar as frequências de células CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + e CD8 + IFN-γ + células T mostrados abaixo fou um (capturado) fração positivo original e enriquecido após o processo de CCS. As regiões indicadas são hierarquicamente ligados e nomeados da seguinte forma: As células CD45 + → 4:: 1: tempo portão → 2: Células individuais → 3 células (detritos excluídos) → 5: Os leucócitos viáveis ​​→ 6: As células viáveis ​​CD3 + → 7: CD4 + células → 7a: CD4 + IFN-γ + células (box) → 8: CD8 + células → 8a: CD8 + IFN-gama + (box) </li></ol> NOTA: Os primeiros 6 regiões indicadas de hierarquia as ligações são as mesmas que na Figura 3, (1-6) e 2 última regiões são mostradas na Figura 4 (6-8a).

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<li>Leen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+of+banked+third-party+virus-specific+T+cells+to+treat+severe+viral+infections+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).</li>
</ol>

Ambos MD Anderson Cancer Center e Dr. Cooper tem um interesse financeiro em ZIOPHARM Oncology, Inc., e Intrexon Corporation. Em 7 de maio de 2015, Dr. Cooper foi apontado como o diretor executivo da ZIOPHARM Oncology. Dr. Cooper é agora um cientista visitante no MD Anderson. Dr. Cooper fundou e possui InCellerate, Inc. Ele tem patentes com Sangamo BioSciences com nucleases artificiais. Ele consulta com Targazyme, Inc. (As células-tronco anteriormente americanos, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, o destino Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals, e Bristol-Myers Squibb. Ele é membro do Conselho Consultivo da Cellectis Scientific. Ele recebe honorários da Miltenyi Biotec.

Terapia adoptiva de células T tem emergido como uma opção viável para o tratamento de malignidades de células-B 4. O seu potencial terapêutico é dependente infundindo o número desejado de células T específicas para o antigénio alvo que carecem de senescência replicativa 2. Isto pode ser conseguido, classificando uma população pura de células T específicas de antigénios a partir de células T expandidas de acordo com as boas práticas de fabrico actuais. Dois procedimentos de triagem são amplamente ut...

-Transplante de células estaminais hematopoiéticas (HSCT) 1 pode ser combinada com a terapia adoptiva de células T para melhorar o efeito do enxerto contra o tumor e para proporcionar imunidade a infecções oportunistas 2. Geração de células derivadas do doador T específicas de antigénio para perfusão tem historicamente exigido pessoal qualificado e uso de instalações especializadas que são GMP-compliant. A entrega dos referidos células T resultou na resolução de infecções oportunistas 3, bem como o tratamento da doença subjacente 4. Recentemente, os investigadores demonstraram que a transferência adoptiva de apenas alguns milhares de células T específicas do vírus (1 x 10 ~ 4 - 5 2,5 x 10 células / kg de peso corporal do receptor) podem tratar com sucesso infecções oportunistas CMV após transplante alogénico 5-9. Um número limitado de instalações GMP com requisitos de fabrico associados especializados e o custo elevado associado com a produção de células tem, no entanto, restro acesso dos doentes a terapias promissoras icted de células T 10. Uma abordagem para o isolamento de células T específicas de antigénio é calculada com base nos CAC usando um reagente bi-específico para reconhecer CD45 e IFN-γ. Como é mostrado, esta metodologia pode ser utilizada para gerar células T específicas para CMV grau clínico que empregam um dispositivo de enriquecimento de células CCS automatizado (Figura 1B). Células específicas do CMV T são geradas por incubação de péptidos sobrepostos de antígeno pp65 do CMV com o total de células nucleares leucoferese (TNC) de doadores CMV-soropositivos. Estes péptidos, apresentados no contexto do antigénio dos leucócitos humanos (HLA), activar as células T específicas de pp65 de CMV dentro da TNC a secretar IFN-γ. Estas células T podem então ser &quot;capturados&quot; e separado magneticamente. O funcionamento do dispositivo de enriquecimento de células de primeira geração (Figura 1A), exigiam pessoal especializado em cultura de células em condições GMP, e coordenação de pessoal para realizar as múltiplas sTEPS necessário para gerar um produto &quot;capturado&quot;. O procedimento normalmente necessários de 10 a 12 horas de operação contínua, e, portanto, o pessoal provavelmente precisará trabalhar mais de dois turnos nas instalações GMP. Estas restrições são agora obviado pela aplicação de um dispositivo de segunda geração (mostrado na Figura 1B). Este dispositivo realiza enriquecimento magnético, semelhante ao primeiro dispositivo de geração, mas automatiza outros aspectos do CCS em uma abordagem unbreached. Isto reduz significativamente a carga sobre a equipe GMP como a maioria dos passos pode ser realizado por uma equipe autônoma. Além disso, uma vez que o dispositivo funciona como um sistema fechado, as células T específicas de antigénio pode ser capturado e processado na bancada excepto as etapas envolvidas no isolamento leucaferese e preparação dos materiais de partida antes de o instrumento. Detalhes da instrumentação completa e funcionalidade deste dispositivo enriquecimento celular de segunda geração foram pubcido 11. Aqui, descrevemos os passos para enriquecer células específicas do CMV pp65 T a partir de um produto de aférese de estado estacionário com o sistema automatizado CCS enriquecimento celular. Uma vez isoladas, estas células T específicas de CMV pode ser imediatamente infundidas num paciente.

<table><tbody><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA Tampão 3 L saco</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>700-29</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy Conjunto de tubos TS 500</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-182</td><td></td></tr><tr><td>Saco de lixo de 5 L</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>110-004-067</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Captura de Citocinas CliniMACS (IFN-gama)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>279-01</td><td></td></tr><tr><td>Albumina (Humana) 25%&nbsp;</td><td>Grifols</td><td>58516-5216-2</td><td></td></tr><tr><td>Interconector Luer/Spike</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-701</td><td></td></tr><tr><td>Solução de NaCl a 0,9% (1 L)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP PepTivator HCMV pp65</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-109</td><td></td></tr><tr><td>Água para injeções</td><td>Hospira, inc, Lake Forest, IL</td><td>NDC-0409-4887-10</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtro MILLEX GV 0.22 &mu; m&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP Médio Saco de 2 L</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-306</td><td></td></tr><tr><td>Saco de transferência, 150 ml (para material de partida celular)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-301</td><td></td></tr><tr><td>Saco de congelamento CryoMACS 50</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 60 ml, estéril</td><td>BD, Laagstraat, Temse, Bélgica</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Produto de aférese soropositiva para CMV</td><td>Key Biologics, LLC, Memphis</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry Materials</td><td>Fabricante</td><td>Número de catálogo</td><td></td></tr><tr><td>AB Serum, GemCell</td><td>Gemini Bio-Products, West Sacramento, EUA</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>CD3-FITC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-080-401</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-033</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-065</td><td></td></tr><tr><td>CD14-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-072</td><td></td></tr><tr><td>CD20-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-077</td><td></td></tr><tr><td>CD45-VioBlue</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-136</td><td></td></tr><tr><td>aIFN-&gamma;-PE, humano</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-940</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-091-374</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Iodeto de Propídio (100 &micro; g/ml)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td>Fabricante</td><td>Número de Catálogo</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy Device&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-075-301</td><td></td></tr><tr><td>Software V1.0.0.RC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analisador MACSQuant 10</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Software 2.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5415R&nbsp;</td><td>Eppendorf AG</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>Celómetro K2</td><td>Nexelom Bioscience, Lawrence, MA</td><td>LB-001-0016</td><td></td></tr><tr><td>Soldador de tubos estéreis SCDIIB</td><td>Terumo Medical Corp., Elkton, MA</td><td>7811</td><td></td></tr></tbody></table>

as células t de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o sistema de captura de citocinas

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

A transferência adoptiva de células T específica de agentes patogénicos podem ser utilizados para prevenir e tratar infecções oportunistas, tais como o citomegalovírus (CMV) que ocorrem após o transplante de células-tronco hematopoiéticas. Células virais T específicas de dadores alogénicos, incluindo os doadores de terceiros, podem ser propagadas ex vivo em conformidade com as boas práticas de fabrico corrente (cGMP), empregando ciclos repetidos de estímulo-driven antígeno para propagar selectivamente as células T desejados. A identificação e isolamento de células T específicas de antigénio pode também ser realizada com base no sistema de captura de citoquinas de células T que foram activadas para secretar gama-interferão (IFN-γ). No entanto, a aplicação humana generalizada do sistema de captura de citocinas (CCS) para ajudar a restaurar a imunidade tem sido limitado como o processo de produção é demorada e requer um operador qualificado. O desenvolvimento de um dispositivo de enriquecimento celular de segunda geração, como Prodigy CliniMACS agorapermite investigadores para gerar células T-virais específico usando um, menos sistema de trabalho intensivo automatizado. Este dispositivo separa magneticamente marcada células a partir de células não marcadas usando tecnologia de células activadas por triagem magnética para gerar produtos de grau clínico, foi concebido como um sistema fechado, e pode ser acedido e é operado na bancada. Nós demonstramos o funcionamento deste novo dispositivo de enriquecimento de células automatizado para a fabricação de células T específicas para CMV pp65 obtidos a partir de um produto de aférese steady-state obtidas a partir de um dador seropositivo a CMV. Estas células T isolados podem então ser directamente injectado a um doente sob a supervisão regulamentar e institucional federal. Todos os passos de processamento de bio incluindo a remoção de células vermelhas do sangue, a estimulação de células T, separação das células T específicas de antigénio, purificação e lavagem estão completamente automatizado. Dispositivos como este levantam a possibilidade de que as células T para aplicação em seres humanos pode ser produzido fora da boa prática de fabrico dedicada (GMP) Instalações e em vez disso ser produzido em instalações bancárias de sangue onde os funcionários podem supervisionam protocolos automatizados para produzir vários produtos.

Neste estudo, um sistema de células automatizado enriquecimento CAC foi utilizado para a produção automatizada de células T específicas de pp65 de CMV. Células T específicas do CMV foram enriquecidas a partir de três produtos de células de aférese. O produto de aférese em estado estacionário foi colhida ao longo de 2 horas a partir de um doador CMV-soropositivos e gerou 10 10 células nucleares totais (CNC). 10 9 TNC foram então activadas com péptidos derivados de CMV pp65 (60 nmol) durante 4 h e o ...

O objetivo deste protocolo é fabricar células T de grau clínico específicas para patógenos usando um dispositivo de enriquecimento celular de segunda geração automatizado de bancada que incorpora um sistema fechado de captura de citocinas e não requer equipe dedicada ou uso de uma instalação GMP. As células T específicas do citomegalovírus pp65 geradas podem ser administradas diretamente aos pacientes.

As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

O objetivo deste procedimento é isolar linfócitos T específicos para antígenos de grau clínico para imunoterapia adotiva utilizando um sistema de captura de citocinas. Isso é realizado primeiramente incubando células mononucleares obtidas de um doador positivo para CMV com um painel de peptídeos sobrepostos derivados da proteína PP65 do CMV, a fim de ativar os linfócitos T. Em seguida, os linfócitos T ativados, específicos para o antígeno, positivos para CD45 e que expressam IFN-gama, são isolados por meio da captura de citocinas.O número e a pureza dos linfócitos T específicos para CMV são então avaliados por citometria de fluxo. Em última análise, pode-se obter um alto percentual de linfócitos T específicos para CMV positivos para CD4 e CD8 e que expressam IFN gama utilizando este sistema de captação de citocinas. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes são sua completa automação e o fato de não ser necessária uma instalação operando em conformidade com as boas práticas de fabricação para o isolamento dos linfócitos T clínicos capturados.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da terapia celular adotiva, como, por exemplo, como reduzir os custos associados à produção celular enquanto se aumenta simultaneamente o acesso a essas células. Para um grande número de pacientes, no entanto, este método pode fornecer informações sobre o isolamento de células T específicas para antígenos de CMB. Também pode ser aplicado ao estudo da resposta de células T a outros patógenos mediante a introdução nas células de antígenos peptídicos derivados dos agentes infecciosos específicos de interesse.Esse sistema automatizado também simplifica o processo de captura de citocinas e permite que os produtos de linfócitos T capturados sejam produzidos sob demanda, sem a supervisão direta de operadores. Antes de iniciar o procedimento, utilize um conector tipo agulha para transferir o coquetel de peptídeos C-M-V-P-P 65 recém-reconstituído para um saco de congelação com volume de 50 mililitros, assim que todo o peptídeo tiver sido transferido. Prenda o saco com pinças de bloqueio e abra o conjunto de tubos para enriquecimento celular em condições estéreis, remova o adaptador de frasco com ventilação e o filtro estéril do conjunto de tubos e conecte o saco do coquetel de peptídeos rosqueando o conector tipo agulha na conexão correspondente.Em seguida, suspenda 1 bilhão de células nucleadas em um volume total de 50 mililitros de tampão P-B-S-E-D-T-A recém-preparado com albumina sérica humana e injete o produto celular em uma bolsa de transferência de 150 mililitros. Agora, ligue o sistema de enriquecimento celular e selecione o programa do sistema de captura de citocinas IFN Gamma Enrichment. Uma interface de usuário exibindo telas com instruções e imagens do procedimento aparecerá.Insira o operador e a tubulação, configure os parâmetros do número do lote. Em seguida, utilizando as instruções exibidas na tela do monitor interativo, instale o conjunto de tubos Prodigy no dispositivo automatizado de enriquecimento celular. Após registrar os números de catálogo e lote dos reagentes, siga as instruções passo a passo exibidas na tela para conectar o meio e os tampões ao dispositivo.Em seguida, após uma verificação final do conjunto de tubos, abra os sacos do coquetel de peptídeos e do meio e inicie o escorvamento automático dos tubos. Quando o escorvamento estiver completo, utilize uma soldadora estéril de tubos para adicionar albumina sérica humana ao tampão de cloreto de sódio no saco reservatório e para transferir o produto celular inicial para o saco de aplicação. A seguir, use adaptadores para conectar os reagentes do sistema de captura de citocinas aos respectivos tubos e insira o tempo desejado para o término do processo de enriquecimento celular.Revise e verifique a precisão de todos os dados e parâmetros inseridos. Em seguida, remova o selo de controle de qualidade do saco, pese o saco e armazene-o a quatro graus Celsius. Agora, inicie o processo de enriquecimento.As células-alvo serão coletadas em tampão de eluição a partir do saco reservatório. Ao final do enriquecimento, colete duas alíquotas de cada uma das frações de células não-alvo negativas e células-alvo positivas. Em seguida, feche e pese os sacos das células não-alvo e das células-alvo e armazene-os a quatro graus Celsius.Por fim, remova o conjunto de tubos do instrumento de enriquecimento celular e transfira o arquivo de registro para uma unidade USB para uso posterior. Para determinar o número de células enriquecidas em cada uma das amostras, adicione CD 45 violeta azul a uma das alíquotas da célula alvo e da célula não alvo do controle de qualidade, durante 10 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 1,5 mililitro de solução frescamente preparada de lise de hemácias às frações de controle de qualidade e negativa e 450 microlitros à fração positiva, durante 15 minutos.À temperatura ambiente, imediatamente antes da análise, adicione iodeto de propídio às amostras numa concentração final de um micrograma por mililitro e carregue as amostras em um contador celular automático. Para determinar o número absoluto de células de cada amostra, utilize a amostra de controle de qualidade para definir o tempo de seleção conforme demonstrado. Selecione as células únicas em um gráfico de dispersão frontal (altura) por área de dispersão frontal, seguido por uma seleção de monócitos e linfócitos nas células positivas para CD45, e então exclua os detritos no gráfico de dispersão frontal por dispersão lateral para permitir a identificação das células viáveis.O número de células viáveis na amostra original de controle de qualidade pode então ser calculado para avaliar a qualidade da lavagem de enriquecimento, utilizando as segundas alíquotas das frações positiva e negativa originais com tampão P-B-S-E-D-T-A pré-resfriado suplementado com soro B. Re-suspenda os pellets em 100 microlitros da mistura apropriada de anticorpo com fluorocromo para marcação, no escuro e a quatro graus Celsius. Após 10 minutos, incube as amostras em um mililitro de solução fresca de lise de hemácias por 15 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, centrifugue as células novamente, ressuspendendo os pellets imediatamente antes da análise em P-B-S-E-D-T-A fresco suplementado com soro AB, adicionando iodeto de propídio conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, utilize uma estratégia de seleção como a descrita para calcular o número de células T viáveis CD3 positivas e a fração positiva após o enriquecimento pelo sistema de captura de citocinas, bem como as frequências das populações de células T CD4 e CD8 positivas únicas e duplamente positivas para CD4 IFN gama e CD8 IFN gama neste experimento representativo. A contagem absoluta de células T positivas para interferon gama foi avaliada antes e após o processo de enriquecimento.O número total de linfócitos T positivos para interferon gama antes do enriquecimento foi de 1.140.000, derivado das 1 bilhão de células nucleadas iniciais. Após o enriquecimento, foram obtidas 309.000 células T positivas para interferon gama; havia 0,16% de células T duplo-positivas para IFN gama e CD4 identificadas antes do processamento, que aumentou para 47,5% após o enriquecimento. Enquanto isso, a pureza das células T positivas para CD8 e IFN gama foi enriquecida de 0,47% para 90,3%. A recuperação da amostra e a fração positiva capturada foi de 32,9% para as células T CD4 simplesmente positivas e de 31,8% para as células T CD8 simplesmente positivas.Com base na medição das células T positivas para IFN gama na população inicial considerada em conjunto, esses dados indicam que tanto as células T específicas para CMV PP65 positivas para CD4 quanto as positivas para CD8 podem ser colhidas automaticamente e de maneira adequada para sua aplicação humana. Após este procedimento, outros ensaios, como testes de endotoxinas e micoplasma, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a esterilidade do produto final após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da terapia celular adotiva explorarem o uso terapêutico de células T multiespecíficas para antígenos no controle de várias infecções oportunistas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como os linfócitos T de grau clínico podem ser isolados usando um sistema automatizado. Não se esqueça de que trabalhar com amostras biológicas pode ser extremamente perigoso e de que precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo descreve o enriquecimento de células T do baço de um camundongo por seleção negativa usando um separador magnético. A técnica envolve direcionar as outras células da amostra para depleção usando anticorpos ou ligantes direcionados contra antígenos específicos da superfície celular.

Enriquecimento de células T: uma técnica para isolar células T da população de células mistas por separação magnética

As células tumorais circulantes (CTCs) são prognóstico em vários tipos de câncer metastático. Este manuscrito descreve o sistema padrão ouro CellSearch (CSS) CTC plataforma enumeração e destaca os erros comuns erros de classificação. Além disso, dois protocolos adaptados são descritos para o marcador caracterização definida pelo usuário de CTCs e CTC enumeração em modelos de ratos pré-clínicos de metástase que utilizam esta tecnologia.

Adaptação do Semi-Automática de circulação Tumor de Células (CTC) Ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de Pesquisa

Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T.

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

Aqui descrevemos um ensaio de cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa em tandem (HPLC-MS/MS) para quantificar o imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco usando uma etapa de precipitação de proteína manual simples e extração em coluna online.

Quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS / MS

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar o isolamento e expansão de células mononucleares derivadas de citocinas derivadas de citocinas derivadas de citocinas induzidas por citocinas por cdinénsiainduzidas porcitocinas + CD56+ células assassinas e ilustrar seu efeito de citotoxicidade contra células cancerígenas hematológicas e sólidas usando um sistema de citometria de fluxo de diagnóstico in vitro.

Isolamento e Expansão de células T assassinas induzidas por citocina para tratamento de câncer

O chip microfluídico clínico é uma importante técnica de análise biomédica que simplifica o pré-processamento de amostras de sangue de pacientes clínicos e cora por imunofluorescência as células tumorais circulantes (CTCs) in situ no chip, permitindo a rápida detecção e identificação de uma única CTC.

Plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Este protocolo descreve um método escalável para a expansão de produtos de Terapias Celulares Adotivas (ACT), nomeadamente células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)-T e células Killer Induzidas por Citocinas (CIK), utilizando dispositivos de expansão rápida permeável a gases (G-Rex), demonstrando crescimento eficiente e robusto em um ambiente clinicamente relevante.

Geração Eficiente e Rápida de Células Assassinas Induzidas por CAR-T e Citocinas em Dispositivos Escaláveis por GMP

Nós apresentamos um protocolo para a produção de antígenos específicos do mouse células T usando transdução...

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

Este artigo descreve o procedimento para a preparação de uma versão marcada com fluorescência do bacteriófago lambda, infecção...

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

Aprenda a isolar células T específicas para citomegalovírus de grau clínico usando um sistema automatizado de captura de citocinas. Este método simplifica a imunoterapia adotiva sem necessidade de instalações GMP.

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As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas

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