Name: Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys 2 -His 2 Domínios zinc-finger (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a entregar proteínas funcionais em células de mamíferos utilizando domínios zinc-finger permeáveis. Este método demonstra expressão bacteriana, purificação e análise por citometria de fluxo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (DP1CA174426 para Carlos F. Barbas) e da Universidade ShanghaiTech, Shanghai, China (a JL). Gráficos moleculares foram gerados utilizando pymol.

1. Clonagem <ol><li> Obter de dois dedos domínios ZIF substituído por alanina que foram sub-clonados no sistema de expressão vector pET-28 e estão disponíveis mediante pedido (PET-2F-ZiF). 34 </li><li> EmGFP amplificar por PCR a partir do plasmídeo pBAD-esmeralda com os iniciadores 5 &#39;Xmal-EmGFP (3-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC 5&#39;-GGAAATTG CCCGGG&#39;; sítio Xmal em negrito) e 3 &#39;Saci-EmGFP (5&#39;-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3&#39; site eu Sac em negrito);. <ol><li> Use 5 ng de ADN molde, 10 ul de tampão de polimerase 10x, 1 Unidades (U) de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP e 0,2 pM de cada iniciador numa solução de 100 uL com o restante volume constituídos de água destilada / desionizada . Use as condições dos ciclos: 95 ° C durante 5 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 1 min; 72 ° C durante 10 min. Purifica-se o produto de PCR por gel extractie em determinar a concentração de ADN utilizando um espectrofotómetro de medição Abs 260 x 50 ug / ml. </li></ol></li><li> Digest pET-2F-ZiF e a inserção que codifica EmGFP com as enzimas de restrição Xmal e Sac I em tampão recomendado durante 3 horas a 37 ° C utilizando 10 U de enzima por 1 ug de ADN. Visualizar o ADN por electroforese em gel de agarose, utilizando um corante fluorescente intercalante, tal como brometo de etídio. </li><li> Purifica-se o ADN digerido por gel extraction kit e determinar a concentração de DNA por um espectrofotómetro Abs medindo 260 x 50 ug / ml. </li><li> Ligadura o ADN que codifica EmGFP purificado em 50-100 ng de pET-2F-ZiF usando 1 U de T4 DNA ligase durante pelo menos 1 h à TA. Para melhores resultados, realizar a reacção de ligação utilizando uma razão de 6: molar de inserção-para-um vector. </li><li> Descongelar 50 ul de quaisquer células XL-1 azul de E. coli quimicamente competentes de Escherichia em gelo e misturar suavemente com 10-20 ng de ligado pET-2F-ZiF-EmGFP. </li><li> Manter em gelo durante 30 min. O choque térmico a mistura a 42 ° C durante 90 seg e recuperar as células em 2 ml de caldo super óptima com repressão catabólica (SOC) durante 1 hora a 37 ° C com agitação. </li><li> Espalhe 100 ul de cultura de recuperação em um caldo lisogenia (LB) placa de ágar com 50 ug / ml de canamicina e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> No dia seguinte, inocula 6 ml de Super Broth (SB) ou cultura LB contendo 50 ug / ml de canamicina com uma colónia da placa de agar LB e a cultura O / N a 37 ° C. Nota: Colony PCR utilizando os iniciadores 5 &#39;e Xmal-EmGFP 3&#39; Saci-EmGFP poderia ser usado para identificar os clones positivos antes de miniprep. </li><li> Purificar pET-2F-ZiF-EmGFP por miniprep e confirmar plasmídeo por sequenciação de ADN utilizando o promotor de T7 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;). </li></ol> 2. Expressão e purificação <ol><li> Descongelar 50 ul de quimicamente competentes BL21 de E. coli células no gelo e misture delicadamente com 100 ng do PET-2F-ZiF-EmGFP plasmid. Transformação como descrito nos passos 1,7-1,8. </li><li> No dia seguinte, inocular 10 ml de meio LB contendo 50 ug / ml de canamicina com uma única colónia e crescer O / N a 37 ° C com agitação. </li><li> No dia seguinte, dilui-se os 10 ml da cultura D / N para 1 L de meio LB suplementado com 50 ug / ml de canamicina, 0,2% de glucose e 100 mM de ZnCl2. Crescer a cultura a 37 ° C com agitação até uma densidade óptica a 600 nm (OD 600) de 0,8 e induzir a expressão da proteína com 2 mM de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Após 6 horas de crescimento a 37 ° C, as células da colheita por centrifugação a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. Nota: As condições de indução são muito variáveis ​​e dependem da estabilidade das proteínas a ser expressa. Monitorar a OD a 600 a cada 30 min até uma DO600 de 0,8 seja alcançado. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de tampão de lise (50 mM Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 mM de ZnCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM de MgCl 2, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) e 10 mM de imidazol, pH 8,0). Lisar as células no gelo por ultra-sons com a seguinte configuração: 50% de potência, 4 min de tempo de processo com 5 sec on / off intervalos de 10 segundos. Evitar o sobreaquecimento da solução. </li><li> Centrifuga-se o lisado celular a 25000 xg durante 30 min a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um tubo de recolha de fresco. Para melhores resultados, executar todos os passos seguintes a 4 ° C. </li><li> Executar o sobrenadante através de uma coluna pré-embalada com 1 ml de suspensão equilibrada de Ni-NTA. Lava-se a resina com 20 ml de tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 fiM de ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de MgCl 2 e 30 mM de imidazol, pH 8,0). </li><li> Elui-se a proteína com 5 ml de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 fiM de ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de MgCl2, e 300 mM de imidazole, pH 8,0). </li><li> Tampão de trocar a proteína eluída com tampão de armazenamento (50 mMTris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 mM de ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de MgCl2 e glicerol a 10%, pH 8,0) e concentrar a proteína de pelo menos 40 jiM utilizando um concentrador de rotação por centrifugação de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Determinar a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford ou BCA. Misturar 2 ul de proteínas purificadas com 2 ul 2 × SDS-PAGE de corante de carga, ferver a 95 ° C durante 10 min e em seguida resolver a 4% -20% de Tris-Glicina SDS-PAGE para avaliar a pureza de proteína (Figura 2). </li></ol> 3. Proteína de armazenamento <ol><li> Alíquota da proteína concentrada, congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. Para as proteínas de fusão EmGFP, cobrir o tubo com folha de alumínio para proteger a proteína da luz. </li><li> Evite congelamento e descongelamento da solução de proteína repetido. Nota: ZiF proteínas fundidas são estáveis ​​sob estas condições durante pelo menos 1 mês. Ou armazenamento inadequado mês&gt; 4 pode levara precipitação de proteínas ou de fotobranqueamento EmGFP. </li></ol> Transdução 4. Protein <ol><li> Manter as células HeLa em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C em uma atmosfera totalmente humidi ficada com 5% de CO 2. Nota: As células passadas mais de 30 vezes não são recomendados para a transdução de proteína. </li><li> Pré-revestimento de uma placa de 24 poços com 500 ul de 50 ug / ml de poli-lisina para 30 a 60 min a 25 ° C. Semear as células num prato de 24 cavidades a uma densidade de 2 x 10 5 células por poço. Em 24 horas após a sementeira, ou uma vez que as células são entre 80% -90% confluentes, retirar o suporte de cada poço e lava-se com 500 ul de DMEM isento de soro pré-aquecido (SFM). </li><li> Para cada poço, adicione 250 mL de SFM contendo 2 uM de proteína ZiF-EmGFP e 100 uM de ZnCl2. Incubar as células a 37 ° C durante 1 h. Nota: domínios ZIF entrar nas células primarily através de macropinocitose, 34, o qual é um mecanismo dependente de energia. Portanto, as células devem ser incubados a 37 ° C durante internalização proteína eficiente. </li><li> Remover meios a partir de células e lava-se três vezes com 500 ul de cálcio e sem magnésio salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) suplementado com 0,5 mg / ml de heparina. Nota: A heparina é necessário remover a proteína ligada à superfície que pode complicar análises a jusante. </li><li> (Opcional) tratamentos repetidos até três vezes para maior entrega. </li><li> Isolar células tratadas imediatamente depois de heparina de lavagem por digestão com 0,05% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 2 min. Re-suspender as células isoladas em 0,5 ml de DPBS suplementadas com 1% de FBS. </li><li> Medir a intensidade de fluorescência de cada amostra por 35 citometria de fluxo utilizando o isotiocianato de fluoresceína (FITC) canal (Figura 3). Ajuste a dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) para colocar a população deinteresse na escala, assegurando que as populações com propriedades diferentes são resolvidos um do outro. </li><li> Colete 10.000 eventos ao vivo para cada amostra e analisar os dados utilizando citometria de fluxo de análise de dados software. 36 Normalize fluorescência de células HeLa tratadas com ZiF-EmGFP a essas células tratadas apenas com SFM. </li></ol>

<ol><li>Berg, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+domain+delivery+of+therapeutic+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).</li>
<li>Lindsay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+cell+delivery%3A+application+in+protein+target+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).</li>
<li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA delivery systems.</a> Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).</li>
<li>Guo, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+nonviral+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in nonviral vectors for gene delivery.</a> Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).</li>
<li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li>
<li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55, 1189-1193 (1988).</li>
<li>Elliott, G., O'Hare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+trafficking+and+protein+delivery+by+a+herpesvirus+structural+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein.</a> Cell. 88, 223-233 (1997).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).</li>
<li>Smith, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+cationic+cell-permeable+miniature+proteins+via+alpha-helical+arginine+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).</li>
<li>Daniels, D. S., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+cell-permeable+miniature+proteins+based+on+a+minimal+cationic+PPII+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).</li>
<li>Karagiannis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+biomimetic+cell+penetrating+peptide+library%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nan%22%5BJournal%5D)">Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library.</a> ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).</li>
<li>Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+cell+penetrating+peptide+identified+using+a+plasmid+display-based+functional+selection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform.</a> ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+grafting+to+endow+cell+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Arginine grafting to endow cell permeability.</a> ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+delivery+of+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo+using+a+supercharged+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein.</a> ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).</li>
<li>Panyam, J., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+for+drug+and+gene+delivery+to+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).</li>
<li>Zelphati, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+proteins+with+a+new+lipid-mediated+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system.</a> J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).</li>
<li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).</li>
<li>Voelkel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+from+retroviral+Gag+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein transduction from retroviral Gag precursors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).</li>
<li>Sinha, V. R., Trehan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+microspheres+for+protein+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Biodegradable microspheres for protein delivery.</a> J. Control Release. 90, 261-280 (2003).</li>
<li>Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+TALEN+proteins+via+bioconjugation+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering.</a> PLoS One. 9, e85755(2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyarginine+as+a+multifunctional+fusion+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Polyarginine as a multifunctional fusion tag.</a> Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).</li>
<li>Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+protein+transduction+is+cell+type-dependent+and+is+enhanced+by+dextran+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate.</a> J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).</li>
<li>Al-Taei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+traffic+and+fate+of+protein+transduction+domains+HIV-1+TAT+peptide+and+octaarginine.+Implications+for+their+utilization+as+drug+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors.</a> Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).</li>
<li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cell-penetrating+peptide-mediated+peptide+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery.</a> Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188, 773-782 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+by+direct+delivery+of+zinc-finger+nuclease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins.</a> Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).</li>
<li>Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+zinc+finger+proteins%3A+the+advent+of+targeted+gene+regulation+and+genome+modification+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies.</a> Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in targeted genome editing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+human+proteins+that+deliver+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo.</a> Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).</li>
<li>Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+Cys2-His2+zinc-finger+domains%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains.</a> ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).</li>
<li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basics of flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).</li>
<li>Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+human+gene+expression+by+ligand-inducible+TALE+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors.</a> ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).</li>
<li>Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Aart%2C+a+designed+six-finger+zinc+finger+peptide%2C+bound+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA.</a> J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, um protocolo passo-a-passo para a entrega de proteína utilizando dedo de zinco (ZiF) domínios de células-permeável é apresentado. O domínio ZiF não reduz a atividade de carga enzimática fundido 34; permite a produção e purificação de proteínas em rendimentos quase idênticos aos observados com a proteína não modificada; e pode transportar proteínas e enzimas para uma ampla gama de tipos de células, com as eficiências que excedem os sistemas tradicionais de penetração de células de péptido ou de proteína ...

Altamente estratégias de fornecimento de proteína eficientes e versáteis são críticos para muitos pesquisa básica e aplicações terapêuticas. A entrega directa das proteínas purificadas em células representa um dos métodos mais seguros e mais fáceis para alcançar este objectivo. 1,2 Ao contrário das estratégias que dependem de expressão de genes de ácidos nucleicos, 3-5 entrega proteína não apresenta nenhum risco de mutagénese de inserção, é independente do transcrição / máquinas e tradução celular permite um efeito imediato. No entanto, a falta de métodos simples e generalizáveis ​​para dotar a atividade de penetração celular para proteínas confunde rotineiramente sua entrada direta nas células. Os métodos actuais para facilitar a entrega intracelular de proteínas são baseadas no uso de ocorrência natural ou 6-8 concebidos de penetração de células, péptidos 9-12 domínios de transdução de sobrealimentação, 13,14 nanopartículas 15, 16 e lipossomas partículas semelhantes a vírus 17,18 </sup&gt; e materiais de microesferas poliméricas. 19 Infelizmente, muitas dessas abordagens são dificultados pelas taxas de captação celular baixos, 20,21 pobre estabilidade, 22 inadvertida tipo de célula de especificidade, 23 propriedades de escape baixo endossomais 24 e toxicidade. 25 Além disso, muitos proteína tecnologias de transdução de reduzir a bioactividade das proteínas entregues 14. O nosso laboratório demonstrou anteriormente que zinc-finger nuclease proteínas (ZFN) - endonucleases de restrição quimérico que consiste de uma Cys His 2 2 zinc-finger programável proteína de ligação a ADN e domínio de clivagem da endonuclease de restrição FokI 26-28 - são inerentemente célula.dia permeável. 29 Esta actividade de penetração celular surpreendente mostrou ser uma propriedade intrínseca do domínio dedo-de-zinco personalizados, com uma plataforma de ligação de ADN que surgiu como uma ferramenta poderosa para o genoma segmentado enengenha-, 30-32 e ser considerada como o resultado da constelação de seis resíduos carregados positivamente na superfície da proteína. De facto, várias proteínas de ligação de ADN, incluindo c-Jun e N-DEK foram mostrados para possuir uma capacidade inata para atravessar as membranas celulares. 33 Mais recentemente, no nosso laboratório expandido estes resultados e demonstraram que a actividade da célula de penetração de zinco finger (ZIF) da domínios poderia ser aproveitado para a entrega de proteínas intracelulares. Fusão genética de ambos domínios ZIF de um ou dois dedos para carga proteína específica levou a absorção eficiências que superaram muitos sistemas de entrega de peptídeos convencionais de penetração celular. 34 Mais notavelmente, entrega ZiF mediada não comprometeu a atividade de carga enzimática fundido e facilitado altos níveis de entrega cytosolic. Colectivamente, estes resultados demonstram o potencial do domínio ZiF para facilitar a entrega eficiente e fácil de proteínas, e potencialmente mais diversos tipos de macromoléculas, em células. Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo sobre como implementar a tecnologia ZiF para entrega de proteína em células de mamíferos é apresentada. Nós previamente construído um conjunto de um, dois, três, quatro, cinco e seis domínios dedo-Zif que não possuem a capacidade de se ligar ao ADN, devido a substituição de cada um dos resíduos de ligação ao ADN de hélice α, mas são capazes de fornecer proteínas em células 34 (Figura 1). A produção e a transdução de esmeralda GFP (EmGFP) em células HeLa usando um domínio ZiF de dois dedos é descrito. Este protocolo é extensível para quase qualquer proteína solúvel capaz de expressão em Escherichia coli e quase qualquer tipo de células de mamíferos. Os resultados esperados são fornecidos e estratégias para maximizar o desempenho do sistema também são discutidos.

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>Expandir sistema de PCR de alta fidelidade</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Tris-Glycine Mini géis de proteína, 1,5 mm, 10 poços</td><td>Life Technologies</td><td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampão de Amostra Laemmli</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Life Technologies</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato</td> de canamicina <td></td><td></td> Sigma-Aldrich 208086-5G <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-25</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DTT Fisher Scientific</td><td>PR-V3151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Resina de Agarose</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Unidades de Filtro Centrífugo</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Fundo Plano de 24 Poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Poli-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, Sem Cálcio, Sem Magnésio</td><td>Life Technologies</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>Heparan Sulfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4777</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop ND-1000 espectrofotômetro&nbsp;</td>Kit de purificação de PCR QIAquick da <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

entrega protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável cys<sub&gt; 2</sub&gt; -his<sub&gt; 2</sub&gt; domínios zinc-finger

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Devido à sua modularidade e capacidade de serem reprogramados para reconhecer uma ampla gama de sequências de DNA, os domínios de ligação ao DNA de dedo de zinco Cys2-His 2 surgiram como ferramentas úteis para a engenharia genômica direcionada. Como muitas outras proteínas de ligação ao DNA, os dedos de zinco também possuem a capacidade inata de atravessar as membranas celulares. Recentemente, demonstramos que essa permeabilidade celular intrínseca pode ser aproveitada para a entrega de proteínas intracelulares. A fusão genética de motivos de dedos de zinco leva ao transporte eficiente de cargas de proteínas e enzimas para uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. Ao contrário de outras tecnologias de transdução de proteínas, a entrega via domínios dedo de zinco não inibe a atividade enzimática e leva a altos níveis de entrega citosólica. Aqui, um protocolo passo a passo detalhado é apresentado para a implementação da tecnologia de dedo de zinco para entrega de proteínas em células de mamíferos. As principais etapas para alcançar altos níveis de entrega intracelular mediada por dedos de zinco são destacadas e estratégias para maximizar o desempenho desse sistema são discutidas.

Dois dedos de proteínas de fusão ZiF-EmGFP pode ser expresso em E. coli com&gt; 95% de homogeneidade e rendimentos elevados (&gt; 25 mg / ml) (Figura 2). Em geral, de um e de dois dedos proteínas de fusão ZiF pode ser produzido em quantidades quase idênticas às de proteína não modificada tipo selvagem. No entanto, em alguns contextos, as proteínas de fusão ZiF cinco e seis dedos não são capazes de ser produzidos em rendimentos elevados o suficiente para aplicações a jusante. <p class="jove_...

Domínios dedo-de-zinco são intrinsecamente célula-permeável e capaz de mediar a entrega de proteína em uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo para a implementação da tecnologia de dedo de zinco para a entrega intracelular de proteínas é apresentada.

Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domínios zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como utilizar domínios de dedo de zinco para entregar proteínas funcionais, como a proteína verde fluorescente, em células de mamíferos. Isso é realizado primeiramente gerando um plasmídeo de expressão contendo a proteína verde fluorescente esmeralda MGFP fundida translacionalmente a domínios de dedo de zinco. O segundo passo é expressar a proteína de fusão fluorescente em bactérias.Em seguida, as células bacterianas são lisadas e a proteína de fusão fluorescente é purificada. O passo final consiste em incubarem-se células de mamífero com a proteína de fusão fluorescente purificada para permitir a captação. Por fim, a fluorescência das células tratadas pode ser quantificada por citometria de fluxo para determinar a eficiência da entrega da proteína de fusão nas células.A principal vantagem do domínio de transdução de proteínas tipo thief ou de outros peptídeos derivados do HIV, como o peptídeo rígido ou a poliarginina, é que ele pode facilitar uma alta taxa de entrega citosólica sem comprometer a atividade da carga enzimática do campo. Para iniciar a PCR, amplifique a sequência de GFP esmeralda ou MGFP a partir de um plasmídeo de acordo com o protocolo descrito, purifique o produto da PCR utilizando um kit de extração em gel e, em seguida, quantifique a concentração de DNA usando um espectrofotômetro. Em seguida, obtenha um vetor de expressão PET 28 contendo a sequência da alanina.Substitua dois dedos de zinco ou dois domínios FZ, vetor digestivo e o produto MG F-P-P-C-R com as enzimas de restrição XMA e SAC, utilizando 10 unidades da enzima por micrograma de DNA e incube as digestões por três horas a 37 graus Celsius. Purifique os fragmentos de DNA por extração em gel e meça as concentrações do vetor e do produto MG F-P-P-C-R. Usando um espectrofotômetro, combine o produto MG F-P-P-C-R e 50 a 100 nanogramas do vetor em um único tubo numa proporção molar de seis para um de inserção em relação ao vetor.Em seguida, adicione uma unidade de ligase de DNA T4 e incube a reação por uma hora à temperatura ambiente para transformar bactérias com o plasmídeo ligado. Deixe descongelar. Um alíquota de 50 microlitros de células de E. coli quimicamente competentes em gelo. Em seguida, misture suavemente as células com 100 a 20 nanogramas do DNA ligado e incube as células com o DNA em gelo por 30 minutos.Após a incubação, submeta as células a choque térmico a 42 graus Celsius por 90 segundos. Adicione dois mililitros de meio SOC ao tubo e permita que as células se recuperem por uma hora a 37 graus Celsius com agitação para selecionar os transformantes. Espalhe 100 microlitros da cultura em placas de ágar LB contendo 50 microgramas por mililitro de canamicina e incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte.Inocule um cultivo de seis mililitros de LB contendo 50 microgramas por mililitro de canamicina com uma colônia isolada da placa de cultura mantida durante a noite. Incube o cultivo durante a noite a 37 graus Celsius com agitação. No dia seguinte, recolha e faça a mini-prep das células para isolar o plasmídeo e, em seguida, confirme o plasmídeo por sequenciamento com o iniciador.Para o promotor T sete, o plasmídeo deve conter uma fusão traducional N terminal dos dois domínios FZ com MGFP. Para iniciar a purificação da proteína, primeiro transforme células BL 21 com 100 nanogramas do plasmídeo purificado.Selecione os transformantes em ágar LB contendo canamicina; no dia seguinte, inocular uma cultura de 10 mililitros de caldo LB contendo canamicina com uma única colônia da placa de cultura de crescimento noturno e incubar a cultura durante a noite a 37 graus Celsius com agitação. Dilua toda a cultura noturna em um litro de caldo LB, suplementado com canamicina, 0,2% de glicose e cloreto de zinco 100 micromolar. Incube a cultura a 37 graus Celsius com agitação até atingir uma densidade óptica a 600 nanômetros de 0,8 e, em seguida, adicione IPTG até uma concentração final de dois milimolares para induzir a expressão. Após seis horas de indução, centrifugue a cultura a 5.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius para colher as células.Re-suspenda o pellet celular em cinco mililitros de tampão de lise e, em seguida, lise as células em gelo por sonicação usando 50% de potência e um ciclo de cinco segundos ligado e dez segundos desligado, durante quatro minutos. Em seguida, centrifugue o lisado celular a 25.000 ×g durante 30 minutos a quatro graus Celsius e, então, transfira o sobrenadante para um novo tubo de coleta mantido em gelo. Para purificar a proteína, carregue o sobrenadante em uma coluna previamente acondicionada com um mililitro de suspensão de ácido nítrico de níquel.Após passar o sobrenadante pela coluna, lave a resina com 20 mililitros de tampão de lavagem. Elua a proteína da coluna com cinco mililitros de tampão de eluição e, em seguida, transfira a solução para um tubo de diálise, diализando a proteína e o tampão de armazenamento durante a noite após a diálise. Utilize um concentrador centrífugo para concentrar a proteína até pelo menos 40 micromolares por centrifugação a 3000 × g durante uma hora.Determine a concentração e a pureza da proteína conforme indicado no protocolo descrito no texto. Aliquote 200 microlitros da proteína em tubos fuge de 1,5 mililitro e cubra os tubos com papel alumínio para proteger as proteínas de fusão MGFP do fotodesvanecimento. Em seguida, congele rapidamente a proteína em nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius para preparar a transdução proteica; primeiro, pré-revesta os poços de uma placa de 24 poços com 500 microlitros de uma solução de 50 microgramas por mililitro.Polilisina por 30 a 60 minutos a 25 graus Celsius. Aspire a solução dos poços antes de semear a cultura de células. Incube as células em DMM contendo 10% de FBS e 1% de antibiótico antimicótico a 37 graus Celsius em incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono.Colete as células e semeie-as em uma placa de 24 poços com uma densidade de 200.000 células por poço. Em seguida, coloque a placa de 24 poços no incubador após cerca de 24 horas de incubação, quando as células estiverem com 80 a 90% de confluência. Aspire o meio de cada poço e lave as células com 500 microlitros de meio sem soro pré-aquecido ou SFM.Adicione 250 microlitros de SFM contendo duas micromolares de proteína Z-M-G-F-P e 100 micromolares de cloreto de zinco a cada poço e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, aspire o meio dos poços e lave as células três vezes com 500 microlitros de solução salina tamponada com fosfato de docos livre de cálcio e magnésio, conhecida como DPBS, suplementada com 0,5 miligramas por mililitro de heparina. A seguir, adicione 200 microlitros de tripsina 0,05% EDTA aos poços e incube a 37 graus Celsius por dois minutos para destacar as células da placa.Transfira as células destacadas para um novo tubo e centrifugue a 300 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, re-suspenda as células em 500 mililitros de DPBS suplementado com 1% de FBS e meça a intensidade média de fluorescência da amostra por citometria de fluxo utilizando o canal fite conforme descrito anteriormente. Ajuste o espalhamento para frente e o espalhamento lateral para posicionar a população de interesse na escala.Em seguida, utilize o direcionamento definido para analisar as amostras controle e teste. Colete 10.000 ventriculócitos viáveis por amostra e use o software de análise de citometria de fluxo para processar os dados. Normalize a intensidade fluorescente das células tratadas com proteína em relação às células tratadas com soro controle.Proteínas de fusão Zif MGFP foram produzidas em *E. coli*, purificadas e analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS. Esses resultados mostram que a proteína de fusão com dois dedos ZIF MG FP foi purificada com homogeneidade superior a 95%. Quando células HELo foram tratadas com concentrações crescentes da proteína de fusão ZIFF MG FP.Eles exibiram um aumento dependente da dose na intensidade média de fluorescência, conforme medido por citometria de fluxo; tratamentos consecutivos com a proteína de fusão Z-MG-FP em uma concentração de dois micromolares resultaram em quase 100% das células com fluorescência MGFP. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar os domínios de transação da proteína thief para entregar proteínas funcionais em minhas células.

direct-protein-delivery-to-mammalian-cells-using-cell-permeable-cys2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transdução da proteína permite a entrega direta de proteínas biologicamente ativos nas células. Em contraste com os métodos convencionais, tais como a transfecção de DNA viral ou transdução este paradigma não-invasivo altamente eficiente permite a manipulação celular de uma forma titulável contornar toxicidade celular eo risco de transformação oncogênica por modificação genética permanente.

Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis

Na era pós-genômica humana, a disponibilidade de proteínas recombinantes em conformações nativas é crucial para a investigação estrutural, funcional e terapêutico e desenvolvimento. Aqui, nós descrevemos um-teste e em grande escala sistema de expressão de proteínas em células humanas embrionárias de rim 293T que podem ser utilizados para produzir uma variedade de proteínas recombinantes.

A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

Deformação mecânica rápida de células surgiu como um método promissor, livre do vector para a entrega intracelular de macromoléculas e nanomateriais. Este protocolo fornece etapas detalhadas sobre como usar o sistema para uma ampla gama de aplicações.

Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic

A expressão de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos está se tornando um método atraente para a produção de complexos proteicos para biologia estrutural. Aqui apresentamos um sistema de expressão simples, mas altamente eficiente, usando células de mamíferos cultivadas em suspensão para purificar complexos de proteínas para estudos estruturais.

Expressão de proteínas recombinantes de Biologia Estrutural em HEK 293F Suspensão Cells: Uma abordagem inovadora e acessível

Descrevemos aqui um sistema de expressão de granzima econômico usando células HEK293T que produz altos rendimentos de protease pura, totalmente glicosilada e enzimaticamente ativa.

A High Yield e custo-eficiente sistema de expressão de Granzimas Humanos em células de mamíferos

Descrevemos como entregar proteínas e pequenas moléculas impermeáveis a células em células de mamíferos cultivadas por um protocolo simples de co-incubação com um reagente que faz com que as organelas endocíticas se tornem vazantes.

Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT

Este é um protocolo rápido e econômico para a produção de proteínas de mamíferos glicosiladas secretadas e subsequente purificação em uma única etapa com rendimentos suficientes de proteína homogênea para cristalografia de raios-X e outros estudos biofísicos.

Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

A produção em escala laboratorial de proteínas eucarióticas com modificação pós-traducional apropriada representa uma barreira significativa. Aqui está um protocolo robusto com rápido estabelecimento e retorno para expressão de proteínas usando um sistema de expressão de mamíferos. Este sistema suporta aminoácidos seletivos, marcação seletiva de proteínas e moduladores de moléculas pequenas da composição de glicanos.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

Os métodos existentes para a modificação de plantas têm aplicabilidade limitada. A nova tecnologia derivada de peptídeos proposta aqui promete simplicidade e eficiência na introdução de proteínas ou genes exógenos nos compartimentos intracelulares desejados de plantas intactas.

Peptídeo derivado Método para Transporte genes e proteínas Através Celular e Barreiras organelares em plantas

Este é um protocolo para estudar as interações da proteína-proteína intracelular baseadas no sistema biotina-avidina suspenso com a novidade de combinar sequências de célula-penetrante. A principal vantagem é que a sequência de destino é incubada com células vivas em vez de lisados celulares e, portanto, as interações ocorrerá dentro do contexto celular.

Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Aprenda a entregar proteínas funcionais em células de mamíferos utilizando domínios zinc-finger permeáveis. Este método demonstra expressão bacteriana, purificação e análise por citometria de fluxo.

Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys

Explorar mais vídeos