Name: Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Lernen Sie die neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in serumfreier Monolayer-Kultur. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung von Neuralvorläufern für Hochdurchsatz-Screenings.

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Die Arbeit wurde durch ein Stipendium für Entwicklung und Förderung von Wissenschaft und Technologie vom thailändischen Bildungsministerium an W.W. und Zuschüsse von Tenovus und dem Anonymous Trust an M.P.S. finanziert.

1. Medien Vorbereitung ANMERKUNG: Das Protokoll beruht auf der Verwendung einer Mischung aus zwei getrennten Medien: DMEM / F12 mit modifizierten N2 Ergänzung und Neurobasalmedium mit B27 Ergänzung ergänzt ergänzt, typischerweise in einem 1: 1 Verhältnis. <ol><li> Bereiten Sie die modifizierte N2 Ergänzung durch Vermischen der Komponenten in einem 15-ml-Tube. Nicht vortexen oder filtern diese; mischen durch Umdrehen des Röhrchens, bis die Lösung klar ist. <ol><li> Starten Sie durch Pipettieren von 7,2 ml DMEM / F12, dann fügen Sie 1 ml 25 mg / ml Insulin (in 0,01 M HCl hergestellt) und gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens. Es dauert ein paar Minuten, bis die Lösung klar ist. </li><li> 1 ml 100 mg / ml Apo-Transferrin (in Wasser), 33 ul 0,6 mg / ml progesternone (in Ethanol bildete), 100 ul 160 mg / ml (1 M) Putrescin (in Wasser bildete ), 10 ul 3 mM Natriumselenit (in Wasser) und 666 &amp; mgr; l 7,5% Rinderserumalbumin und mischen das Felgenbett. Aliquot in 2,5 ml und bei -20 °C für bis zu 2 Monate. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Medien. <ol><li> Zu 250 ml DMEM / F12 hinzufügen 2,5 ml N2. Gut mischen, aber nicht schütteln oder Filter. </li><li> Zu 250 ml Neurobasal Medien 5 ml B27 Ergänzung. Gut mischen, aber nicht schütteln oder Filter. </li><li> Mischen Sie die Medien aus den Schritten 1.2.1 und 1.2.2 in einem Verhältnis 1: 1. In einigen Fällen ist eine 1: 3-Mix erforderlich sein (ergänzt als 1: 1-Mischung in Schritt 1.2.4). </li><li> Zu der Mischung hinzufügen 0,5 ml L-Glutamin (Endkonzentration 0,2 mM) und 3,5 ul 2-Mercaptoethanol (Endkonzentration 0,1 mM) und gut mischen ohne Schütteln. Lagern Sie das Material bei 4 ° C für bis zu 3 Wochen und vermeiden, um Licht. Diese Endmischung wird als N2B27. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Gelatine-Lösung. <ol><li> Eine 1% ige Gelatinelösung in Reinstwasser und Autoklaven bei 121 ° C, 15 psi, 15 Min. Es ist wichtig, daß die Flasche für diese verwendet wird, ist vollständig frei von Reinigungsmittel oder Desinfektionsmittel, so empfiehlt es sich, dass eine neue Flasche istdafür verwendet und wird immer nur in Reinstwasser zwischen Gebrauch gespült. Aliquot der 1% igen Lösung in 50 ml-Teilmengen und halten bei 4 ° C für Monate. </li><li> Erwärmen ein Aliquot von 1% Gelatine in einem 37 ° C warmen Wasserbad gelöst und in den 500 ml warmem phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Gut mischen und pipettieren genug, um den Boden jeder Vertiefung oder Platte abzudecken. Ermöglichen die Gelatine, die Oberfläche für mindestens 30 min. </li></ol></li></ol> 2. Ausplattieren der Zellen Hinweis: Dieses Protokoll gilt auch für die Maus ESC in 10% Serum mit Leukämie (LIF), Serum-Ersatz mit LIF oder Serum-freien Medien mit LIF und bone morphogenetic protein 4 (BMP4) oder MEK und GSK3-Inhibitoren (2i Medien) gewachsen mit oder ohne LIF. Jedoch kann die Zeitsteuerung und die Effizienz der Differenzierung in Abhängigkeit von den Medien und Zellen (siehe Diskussion) variieren. Bei den hier gezeigten Experimenten verwendeten wir den 46C Maus ESC Linie (das hat eine EGFP Reporter klopfte in one der endogenen SOX1 Allele), in GMEM mit 10% Serum und LIF gewachsen. Für optimale Ergebnisse ist es wichtig, dass die Zellen dissoziiert und im N2B27 Medien erneut plattiert; einfaches Ändern von Medien aus GMEM / Serum / LIF zu N2B27 führt immer zu einem reduzierten Differenzierung Effizienz im Vergleich zu Neubelegung der Zellen. <ol><li> Wachsen die Zellen in GMEM mit 10% Serum, 1 mM Natriumpyruvat, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1 M 2-Mercaptoethanol und 100 Einheiten / ml LIF 13. Um einen subkonfluenten Kultur der Maus ESC, Platte erhalten Sie 1 x 10 6 Zellen in einen T25-Kulturflasche, die stattfinden wird 2 - 3 Werktagen. </li><li> Beachten Zellen unter Hellfeld-Mikroskop. Wenn die Zellen subkonfluenten und bereit, Durchgang sind, spülen Sie sie zweimal in PBS. 1 ml der Zellabtrennungs Reagenz und zurück in den Inkubator für 2-5 min. Obwohl Trypsin und andere Enzyme können für Zelldissoziation verwendet werden, können sie eine negative Wirkung auf die Zellhaftung aufweisen, so dass die Beschichtungsdichten müssen sein adjusted. </li><li> Sobald die Zellen beginnen, von der Platte zu heben, tippen Sie auf das Schiff, um sie in eine Einzelzellsuspension zu entfernen. Sammle die Zellen in eine Gesamtmenge von 10 ml Medium und Zelldissoziation Reagenz und Pipette in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Dreh die Zellen bei 300 g für 3 min bei RT. </li><li> Vorsichtig den Überstand aspirieren und das Pellet in 10 ml vorgewärmtes N2B27 durch Auf- und Abpipettieren 3-5 mal. Beim Pipettieren der Suspension ab, Pipette gegen die Seite des Rohrs zu vermeiden, Blasen zu erzeugen. Zählen Sie die Zellen, die mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer und Erfassung der Konzentration. </li><li> Bereiten Sie eine Zellsuspension, die die gewünschte Anzahl an Zellen pro Volumeneinheit zu je Vertiefung in vorgewärmten N2B27 plattiert werden. Eine Dichte von 10.500 Zellen pro cm 2 in einer 6-Well-Platte (das heißt, 1 x 10 5 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte) ist optimal. Siehe Tabelle 1 für die vorgeschlagene Anzahl von Zellen pro cm 2 und plaTing Medienvolumina für eine Vielzahl von Zellkulturgefäßen. </li><li> Saugen Sie das Gelatine aus dem Kulturgefäß und Platte der Zellsuspension nach dem vorgeschlagenen Dichte und Volumen in der Tabelle 1. Wirbeln Sie nicht die Platten, da dies die Zellen an der Mitte zu konzentrieren. Zeigen die Kulturen in einem feuchten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie alle Medien 1 - 2 Tage durch Ersetzen alle Medien mit frischen N2B27. Pipette vorsichtig wie Spülen der Zellen könnte Dichte beeinflussen und verringern Differenzierung Effizienz in den folgenden Tagen. Wo anfänglichen Lebensfähigkeit nach der Beschichtung schlecht ist, die Platte der Zellen in einem 1: 3-Mix der N2 und B27-Medien ergänzt und geändert werden, um diese N2B27 nach den ersten beiden Tagen. Zellen beginnen zu differenzieren und sollte SOX1 Ausdruck innerhalb von 4 (durch grüne Fluoreszenz des Reporters in der 46C-Zelllinie verwendet werden, hier nicht sichtbar) zeigen - 6 Tage. </li></ol> 3. Immunfluoreszenzfärbung NEINTE: Das Protokoll kann auf jeden Schiffstyp angewandt werden. Das Volumen von jedem Reagenz pro Vertiefung von 6-Loch-Platte beschrieben und kann auf jede Oberfläche skaliert. Replattierung wird nicht aufgrund der geringen Rentabilität danach empfohlen. <ol><li> Entfernen Differenzierungsmedium und fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% (v / v) Paraformaldehyd, lassen für 15 Minuten. </li><li> Waschen und Permeabilisierung der Zellen mit 2 ml PBS-T (phosphatgepufferte Salzlösung mit 0,5% (v / v) Tween-20) zweimal. Zellen in PBS-T für bis zu 2 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden. </li><li> Ersetzen PBS-T mit 1 ml PBS-T mit 10% (v / v) Serum (von der gleichen Spezies wie der sekundäre Antikörper). Inkubiere 1 Stunde auf der Platte Wippe bei RT keine unspezifische Bindung zu blockieren. </li><li> Nach 1 Stunde, waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS-T, und Inkubation in 500 ul Maus-IgG gegen βIII-Tubulin (verdünnt 1: 1000 in PBS-T mit 10% Serum). Setzen Sie auf dem Teller Wippe, und lassen Sie O / N bei 4 ° C. </li><li> Von diesem Schritt immer schützen das Gefäßvon Licht. Mit PBS-T wasche die Zellen zweimal, dann fügen 500 ul fluoreszenzmarkierten Anti-Maus-IgG-Antikörper (2 &amp; mgr; g / ml in PBS-T mit 10% Serum, verdünnt). Legen Sie es auf dem Teller Wippe für 1 h bei RT. </li><li> Mit PBS-T Spülen Sie die Zellen zweimal, dann fügen Sie 500 ul DAPI (0,5 ug / ml verdünnt in PBS-T) und lassen Sie für 5 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen erneut und halten sie in PBS-T. Zellen bereit sind, fotografiert zu werden und kann für bis zu 2 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden. Beachten Sie, dass GFP-Signal verblasst im Laufe der Zeit, so ist es unangemessen, GFP Intensität der festen und lebende Zellen oder von Zellen zu unterschiedlichen Zeiten fixiert zu vergleichen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Monoschicht neuronalen Differenzierung Protokoll wird seit mehr als einem Jahrzehnt 6 gewesen. Das Protokoll ist sehr leistungsfähig, von definiertem Medium zusammengesetzt ist und in einer Monoschicht-System, das das System eher für präklinische macht gemacht (zB Arzneimittel-Screening) verwendet. Es gibt jedoch einige wichtige Faktoren, die die Differenzierung Effizienz zu bestimmen. Dieser Artikel weist darauf hin, die Faktoren und die Lösung für jedes Hindernis. D...

Embryonale Stammzellen sind pluripotente Zellen des frühen Embryos mit der Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in vitro proliferieren, abgeleitet, während die Fähigkeit beibehalten wird (durch Bildung einer Chimäre) in alle adulten Zelltypen folgenden Wiedereinführung in einem geeigneten Stadium Embryos differenzieren, die Injektion in syngene oder immunsupprimierten (durch Bildung einer Teratom) oder in vitro unter Umständen von Cues 1. Die in vitro Differenzierung von embryonalen Maus-Stammzellen zu neuralen Linien wurde erstmals 1995 beschrieben und involviert die Bildung von vielzelligen Aufhängung Aggregate (Embryoid Bodies, EBs) in serumhaltigem Medium mit dem Morphogen Retinsäure 2-4 ergänzt. Seitdem wurde eine Vielzahl von Protokollen entwickelt, die neuronale Differenzierung 5 ermöglichen. Viele noch zu nutzen Aggregation, andere Co-Kultur mit Zelltypen induzieren und mehrere beinhalten die Verwendung von Serum-freien Medien. Alle Protokolle haben Vorteile einnd Nachteile und die genaue Art der neuronalen oder neuronalen Zellen produziert auch variiert in Abhängigkeit von dem verwendeten Protokoll. Die ideale Protokoll wäre robust, skalierbar und nutzen vollständig definierten Medien und Substrate, sei zugänglich nicht-invasive Überwachung des Differenzierungsprozesses und führen zu der Erzeugung von reinen Populationen von neuronalen Vorläuferzellen in der Lage, durch externe Signale und zur Differenzierung strukturiert werden in allen neuronalen und glialen Subtypen mit hoher Effizienz und Ausbeute in einer relativ kurzen Zeit. In den letzten zehn Jahren haben wir mit Hilfe wurde ein Verfahren zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen und Neuronen aus Maus ESC in einer niedrigen Dichte, Serum-freien anhaftenden Monolayer-Kultur 6-10. Dieses Protokoll erfüllt viele der oben genannten Kriterien: in unseren Händen die Effizienz der Differenzierung hat ganz konsequent über viele Jahre und eine Vielzahl von Zelllinien wurde, kann nach oben oder unten skaliert werden (wir erfolgreich Schiffe aus Platten mit 96 Vertiefungen zu 15 cm Durchmesser dishes) und die verwendeten Medien sind gut definiert. Das Verfahren ist offen für Zeitraffermikroskopie zur Überwachung der Differenzierung und einer Vielzahl von Strukturierungs Signale hinzugefügt werden, um die Erzeugung von verschiedenen Typen von neuronalen Subtypen (zB Shh und Fgf8 für dopaminerge Neuronen 6) zu induzieren. Dennoch gibt es einige Probleme bezüglich der erfolgreichen Anwendung dieses Protokolls. Einer der wichtigsten Aspekte ist eine sorgfältige Vorbereitung der Medien. Wir bereiten immer die Medien im Haus trotz der Verfügbarkeit von kommerziellen Alternativen. Eine der verwendeten Ergänzungsmittel (N2; siehe Protocol) hat Änderungen gegenüber dem handelsüblichen Fassungen. Schließlich ist einer der wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens die optimale Zelldichte bei der Galvanisierung. Dies liegt hauptsächlich daran, während der autokrinen Natur eines der Induktion Signale (FGF4 11) erfordert, dass genügend Zellen vorhanden, um eine optimale viabil ermöglichen, sindkeit und Differenzierung, bei zu hohen Dichten Differenzierung (aufgrund autokrine Produktion von LIF 12 ggf. teilweise) beeinträchtigt. Es ist daher wichtig, dass die beiden Medienherstellung und Zell Plattierung sorgfältig durchgeführt und konstant, um optimale Ergebnisse sicherzustellen.

<table><tbody><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Zelldissoziationsreagenz</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serumfrei</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Rekonstituierung mit sterilem 0,01 M HCl</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Rekonstituierung mit sterilem Wasser</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Rekonstituierung mit Ethanol</td></tr><tr><td>Putrescin</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Rekonstituierung mit sterilem Wasser</td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Mit sterilem Wasser rekonstituieren</td></tr><tr><td>Rinderalbuminfraktion V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Stellen Sie sicher, dass es sich vor der Verwendung vollständig aufgelöst hat, da Glutamin normalerweise sedimentiert ist</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturschale</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Gewebekulturschale</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturschale</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Leukämie-Hemmfaktor</td>, der <td>im eigenen Haus hergestellt wurde, wie in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>Mouse anti &beta; III Tubulin IgG-Antikörper</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkierter Anti-Maus-IgG-Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>Schutz vor Licht</td></tr><tr><td>25 cm2 Gewebekulturkolben</td><td>ThermoScientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronale differenzierung von embryonalen stammzellen der maus in serum-freiem monolayer-kultur

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Die Fähigkeit, embryonalen Stammzellen der Maus zu differenzieren (ESC) zu neuralen Vorläuferzellen ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen, die neuronale Spezifikation sowie die Erzeugung von reifen neuralen Zelltypen für eine weitere Studie. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Unterscheidung von ESC zu neuralen Vorläuferzellen mit Serum-freien, Monokultur. Das Verfahren ist skalierbar, effizient und führt zur Produktion von ~ 70% neuralen Vorläuferzellen innerhalb 4-6 Tagen haben. Es kann zu ESC aus verschiedenen Stämmen unter einer Vielzahl von Bedingungen gewachsen angewendet werden. Neuralen Vorläuferzellen kann zugelassen werden, um weiter in funktionelle Neuronen und Glia differenzieren oder analysiert durch Mikroskopie, Durchflusszytometrie oder molekularen Techniken. Der Differenzierungsprozess zugänglich ist Zeitraffermikroskopie und kann mit der Verwendung von Reporter-Linien, um die neuronale Spezifikationsprozess Überwachung kombiniert werden. Wir bieten Ihnen detaillierte Anweisungen, Medienaufbereitung und Zelldichte-Optimierung, damit der Prozess zu be angelegt, um die meisten ESC Leitungen und einer Vielzahl von Zellkulturgefäßen.

In diesem Experiment verwendeten wir den 46C-Zellinie 14, embryonalen Stammzellen der Maus mit einer endogenen SOX1-GFP-Reporter, um neuronale Differenzierung zu verfolgen. Durch die Nutzung dieser Zelllinie Expression von SOX1, ein Marker für neurale Vorläufer, kann durch grüne Fluoreszenz detektiert werden. Plattierungsdichte ist ein kritischer Faktor, um die neuronale Differenzierung zu erreichen. Embryonale Stammzellen der Maus wurden in 6-Well-Platte bei unterschiedlicher Dichte reicht von 10.500 bis 88....

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Methode zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen unter Verwendung einer serumfreien Monolayer-Methode. Diese Vorläuferzellen können verwendet werden, um reife neuronale Zelltypen abzuleiten oder den Prozess der neuronalen Spezifikation zu untersuchen, und sind für die Skalierung im Multiwell-Format für das Screening von Verbindungen zugänglich.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, murine embryonale Stammzellen in einer serumfreien monolayer Zellkultur zu einer neuronalen Linie zu differenzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Kulturgefäße mit Gelatine beschichtet werden. Im zweiten Schritt werden die embryonalen Stammzellen in einer Einzelzell-Suspension in Differenzierungsmedium assoziiert und auf die geeigneten Ansätdichten verdünnt. Im letzten Schritt werden die Zellen auf die mit Gel-ENC beschichtete Platte ausgesät. Abschließend wird mittels Immunfluoreszenzmikroskopie die erfolgreiche Differenzierung durch Nachweis der gewünschten neuronalen Marker bestätigt. In der Regel haben Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, Schwierigkeiten, da das Ausplattieren in der geeigneten Dichte entscheidend für eine gute Differenzierung ist.Und es gibt mehrere Faktoren, die die Besiedlungsdichte direkt und indirekt beeinflussen. Bevor Sie die Zellen ansäen, erwärmen Sie eine Aliquot aus 1 % Gelatine im 37-Grad-Celsius-Wasserbad, bis sie vollständig aufgelöst ist. Anschließend mischen Sie die Gelatine mit 500 Milliliter warmer PBS und bedecken den Boden des Zellkulturbehälters mit ausreichend Lösung, um die Oberfläche zu benetzen, während die Gelatine auf der Oberfläche haftet.Spülen Sie die subkonfluente Kultur von embryonalen Mausstammzellen zwei Mal mit PBS. Anschließend fügen Sie ein Milliliter Dissoziationsreagenz zur Kultur hinzu. Nach zwei bis fünf Minuten klopfen Sie das Gefäß leicht an, um die Zellschicht in eine Einzelzell-Suspension zu lösen, und sammeln die Kultur in insgesamt 10 Milliliter Medium und Zelldissoziationsreagenz. Überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Kegelrohr und zentrifugieren Sie sie. Nach vorsichtiger Aspiration des Überstandes resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter vorgewärmtem N zwei B 27, indem Sie es gegen die Rohrwand abstumpfen. Um die Bildung von Blasen zu vermeiden, zählen Sie die Zellen, notieren die Konzentration und resuspendieren Sie sie gemäß der Tabelle in vorgewärmtem N zwei B 27 in der entsprechenden Zellzahl pro Volumeneinheit pro Vertiefung.Anschließend das Gelatine aus dem Kulturgefäß abpipettieren und die Zellen ohne Schwenken des Behälters ansäen. Die Kulturen in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid stellen. Das Medium alle ein bis zwei Tage wechseln.Bei frischem N zwei B 27 beginnen sich die Zellen zu differenzieren und zeigen innerhalb von vier bis sechs Tagen einen Socks-Einzelstrang, um die Zellen für die Immunfluoreszenz-Bildgebung zu färben. Entfernen Sie das Differenzierungsmedium aus den Kulturen und fixieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern 4 % Paraformaldehyd. Nach 15 Minuten waschen und permeabilisieren Sie die Zellen zweimal mit je zwei Millilitern PBS mit Tween. Anschließend blockieren Sie jegliche unspezifische Bindung durch eine einstündige Inkubation der Zellen.In einem Milliliter PBS-Tween, ergänzt mit Serum, auf einem Platten-Shaker, nachdem die Zellen wie gerade gezeigt wurden gewaschen wurden. Geben Sie 500 Mikroliter Maus-IgG gegen Beta-Drei-Tubulin zu den Kulturen für eine Übernacht-Inkubation auf dem Platten-Shaker bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag.Nach dem Waschen der Zellen die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Lichtschutz mit Schütteln mit fluoreszenzmarkiertem sekundärem Antikörper gegen US-IgG inkubieren. Die Zellen erneut waschen und für fünf Minuten in 500 Mikrolitern DPI einfärben. Schließlich, nach einem letzten Waschschritt, die Zellen bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius in PBS-Tween lagern.Bis zur Bildgebung. In diesem Experiment wurden murine embryonale Stammzellen mit einem endogenen SOX1-GFP-Reporter verwendet, um die neuronale Differenzierung zu verfolgen. Am sechsten Tag wurden die Zellen fixiert und mit dem neuronalen Marker Beta-3-Tubulin gefärbt.Bei der optimalen Dichte differenzierten die Zellen in neurale Vorläuferzellen und Neuronen, während eine höhere Dichte zu einer verminderten Anzahl von SOX1-GFP- und Beta-3-Tubulin-positiven Zellen führte. Das Volumen des Zellkulturbehälters beeinflusst ebenfalls die optimale Ansiededichte. Beispielsweise benötigen Zellen, die in einer 96-Loch-Platte kultiviert werden, eine Zelldichte, die etwa zehnmal höher ist.Die Zellen wurden in einer sechswelligen Kulturschale platziert, um die optimale und eine doppelt so hohe Konfluenzdichte zu erreichen. Während der Differenzierung verändern embryonale Stammzellen allmählich ihre Morphologie. Beispielsweise lassen sich anhand dieser Bilder die Zell- und Kolonie-Morphologie von Tag eins bis sechs nach der Aussaat bei optimaler Zelldichte beobachten.Am vierten Tag beginnen die Zellen, sich in neurale Vorläuferzellen zu verwandeln, was sich durch das Auftreten eines grünen fluoreszierenden Signals des SOX1-GFP-Reporters zeigt. Bis zum sechsten Tag sind die meisten Zellen SOX1-positiv. Obwohl das Vorhandensein einiger nicht-neuraler Zellen erwartet wird, sollten Sie nach dem Ansehen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie die neuronale Differenzierung von embryonalen Mausstammzellen in einer einlagigen Zellkultur initiiert wird.

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir entwickelten ein neues Protokoll, um die Effizienz der in vitro Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen zu verbessern. Die differenzierten ES-Zellen erworbenen motorischen Neuronen verfügt wie durch die Expression von neuronalen und motorischen Neurons Marker mit Hilfe von immunhistochemischen Techniken nachgewiesen.

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Das Video demonstriert ein Protokoll, das serumfreie Medien verwendet, um neuronale Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus zu erzeugen. Die gewünschte Konzentration an embryonalen Stammzellen, die in serumfreien Medien suspendiert sind, wird auf gelatinebeschichtete Deckgläser plattiert. Bei optimaler Zelldichte produzieren Zellen autokrine Signalfaktoren, die zusammen mit den neuronalen differenzierungsinduzierenden Faktoren in den serumfreien Medien die Differenzierung...

Generierung neuraler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen in serumfreien Monolayer-Kulturen

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vitro Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) aus embryonalen Stammzellen (mESCs) der Maus. Die mES-Zellen werden in Suspension kultiviert, um Embryoidkörper (EBs) zu bilden, die dann durch Retinsäurebehandlung in einer adhärenten Kultur zur Differenzierung in NPCs geführt werden.

Eine Technik zur Erzeugung neuraler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Das Video zeigte eine Zellkulturmethode zur Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in Neuronen. Durch die Inkubation von Zellen in einem nährstoffreichen Medium, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt wurde, reiften die Vorläuferzellen zu Neuronen mit entwickelten Axonen und Dendriten. Ein Stabilisierungsmittel sicherte die Lebensfähigkeit der Zellen und schützte vor oxidativen Schäden während des gesamten Differenzierungsprozesses.

Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in Neuronen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Differenzierung embryonaler Stammzellen in eine vernetzte Population von Neuronen mit funktionierenden Synapsen. Es werden die Schritte beschrieben, die an der Differenzierung embryonaler Stammzellen in Neuronen, der Induktion der Bildung neuronaler Netzwerke und der Anreicherung der Kultur mit vernetzten Neuronen beteiligt sind.

Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus zu einer vernetzten Neuronenpopulation

Serum in Embryokulturen genutzt enthält unbekannte Komponenten, die das Ergebnis von Experimenten, vor allem in Studien mit Signal Wechselwirkungen beeinflussen können. Hier verwendeten wir eine Serum-freien Kultursystem mit Sauerstoff angereichert und zeigen, dass Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für 16-40 h kultiviert morphologische Entwicklung vergleichbar zu entwickelnden Embryonen in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Wir beschreiben eine Technik für die zur Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Embryoidkörpern murinen embryonalen Stammzellen. Wir dann erklären, wie neuronale Differenzierung der Zellen Embryoidkörper von Retinsäure zu induzieren, und wie ihr Zustand der Differenzierung von Vorläuferzellmarker Immunofluoreszenz und Immunoblotting analysiert.

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

Wir beschreiben das Verfahren zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in neuronale Zellen mit der Hanging-Drop-Methode. Darüber hinaus führen wir eine umfassende phänotypische Analyse durch RT-qPCR, Immunfluoreszenz, RNA-seq und Durchflusszytometrie durch.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Lernen Sie die neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in serumfreier Monolayer-Kultur. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung von Neuralvorläufern für Hochdurchsatz-Screenings.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

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