Name: Um novo aplicativo do Electrical Penetration Graph (EPG) para aquisição e medição de sinais elétricos em Floema Sieve Elements (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T09:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Aprenda a usar a técnica EPG para registrar sinais elétricos intracelulares em elementos de crivo do floema durante a alimentação de afídeos. Este método permite estudar as respostas das plantas à herbivoria e as interações planta-inseto.

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VSR foi apoiada por uma IIF Marie Curie Grant (FERIDAS NA TERRA, sigla para: Ferida induzida sinais elétricos em Arabidopsis thaliana).

1. Aphid Empinar Nota: A escolha de espécies de plantas e de afídeos para gravações EPG depende do objetivo da pesquisa. Para estudos sobre a Arabidopsis thaliana, o pulgão Brevicoryne brassicae é apropriado. <ol><li> Traseira B. pulgões brassicae em uma estufa em Brassica oleracea. Manter as plantas utilizadas para a criação pulgão em gaiolas, a fim de evitar a contaminação de outras plantas. Manter plantas de criação de pulgões e plantas experimentais (no nosso caso B. oleracea e A. thaliana) em salas separadas, a fim de evitar a contaminação de plantas experimentais com pulgões. </li><li> Transferir pulgões para plantas frescas sobre a cada 2 semanas, antes de causar danos às plantas significativa, ou chegar a superpopulação. Transferir 10-20 pulgões adultos a uma planta criação fresco para iniciar uma nova colônia. </li><li> Monitorar criação plantas regularmente para contaminação por espécies de afídeos indesejados, outros insetos herbívoros, parasitóides de afídeos e fungi que podem afetar a saúde da colônia pulgão. </li><li> Recolha adultos, pulgões sem asas até uma semana após a sua última muda para a gravação EPG. </li><li> Após os experimentos, as plantas experimentais regresso que não foram utilizados para a câmara de crescimento, como muitas vezes eles têm alguns descendentes que foi produzido durante a gravação, o que poderia inadvertidamente contaminar outras plantas. </li></ol> 2. Insect Fiação para gravação EPG <ol><li> Para fazer eletrodos de insetos, obtenha pinos do conector de bronze (pregos, Ø 1,2 milímetros), fio de cobre fino (0,2 milímetros Ø), fio de ouro muito fina (Ø cerca de 20 mm), cola de prata à base de água, um parafuso de solda pequeno simples com fluido de solda e fio de solda com núcleo de resina, microscópio estereoscópico com ampliação de 10X, uma tesoura pequena ou bisturi, dois pinça fina, e uma folha de isopor ou caixa. Nota: Um misturador de vórtice pode ser útil. Nota: O protocolo passo-a-passo para fazer eléctrodos é indicado na Figura 2. </li><li> Para pulgãomanuseamento e de aplicação de cola, obtém-se: um pequeno pincel macio e camelhair aguarela (tamanho 2 ou menor) e os pinos de insectos, tais como aqueles usados ​​para conjuntos de insectos, embora uma agulha de costura ou palito fino pode funcionar tão bem. Passo 4 mostra como para iniciar a gravação EPG. </li><li> Passo 1. Nota: Os passos 1 e 2 abaixo mostram como preparar eletrodos de insetos menos o pulgão. Passo 3 mostra como ligar um afídeo ao eletrodo. Aspirador de fixação do pulgão é recomendado durante a fiação, mas nem sempre necessária para as espécies que se deslocam lenta (por exemplo, B. brassicae). <ol><li> Ligue o parafuso de solda e derreter algum fio de solda na sua ponta (Figura 2A). Umedeça a cabeça do pino conector de bronze com um pouco de fluido de solda (Figura 2B) e mergulhe-o de solda de metal derretido (Figura 2C). </li><li> Aplicar um revestimento de solda fundida de metal sobre uma extremidade de uma peça de 1-2 cm de comprimento do fio de cobre fina (figura2D). Em seguida, leve o fio do pino e cobre juntos contra o parafuso quente (Figura 2E) e movê-los juntos longe para esfriar e solidificar (Figura 2F). </li></ol></li><li> Passo 2. <ol><li> Completamente agitar (ou vortex) o frasco com cola de prata por vários minutos até que uma emulsão suave é mostrado. Cut (tesoura ou bisturi) alguns pedaços de fio de ouro (de cerca de 1,5 cm de comprimento) sobre o objeto placa do microscópio estereoscópico (Figura 2G). </li><li> Com um pino de bronze com fio de cobre soldada (feito na seção 2.3) e mergulhar a extremidade livre do fio de cobre para o pequeno reservatório de cola de prata que se reuniram no interior da tampa do frasco após abri-lo (Figura 2H). Nota: Apenas uma pequena gota é necessário. </li><li> Mover o fim-mergulhadas cola do fio de cobre para o pedaço de fio de ouro, ao levantar uma extremidade para evitar manchar a cola sobre a placa estereomicroscópio objecto. Tente se sobrepõem copper e um fio de ouro para alguns mm (Figura 2I), distribuindo a cola ao longo da sobreposição dos dois fios. </li><li> Espere até que a cola tenha sido seco o suficiente para manter os fios unida. Verifique o contato cola após a secagem e adicione um pouco de cola fresca com um pequeno alfinete ou outro pedaço de fio de cobre, se algumas partes dos fios aderiram mostrar peças livre de cola. </li><li> Após o eletrodo inseto está pronto, armazená-lo, por exemplo inserido em um pedaço de isopor. Nota: O comprimento do fio de ouro irá determinar a liberdade de movimento do pulgão: se for muito curto (menos do que 5 mm), o pulgão pode sentir-se constrangido e não irá comportar-se normalmente; se for muito longo (&gt; 2 cm), o pulgão vai mover-se livremente. Pulgões tendem a mover-se para o lado adaxial das folhas, se permitido. Se o fio de ouro toca a folha, o sinal será curto-circuito. </li></ol></li><li> Passo 3. <ol><li> O pulgão pode ser mantido no lugar por meio de sucção de luz, utilizando um vácuo; neste caso, instale tele sucção dispositivo, ao microscópio estereoscópico. Coloque a abertura de aspiração, no centro do campo. </li><li> Agite bem o frasco com cola de prata por vários minutos (ou até que um vortex) emulsão lisa é formado. Recolha um afídeo com a pequena escova. </li><li> Ligar o dispositivo de aspiração e montar o pulgão na abertura de sucção (Figura 2J), com a parte de trás do abdómen virou-se para o experimentador. Com o pincel fino, remova toda a cera da superfície do abdômen (abundante em pulgões de couve). </li><li> Abra o frasco de cola e molhar um pino com uma pequena gota de cola de prata (Figura 2K). Aplique a gota de cola de prata na parte traseira do abdômen do pulgão (Figura 2L-M). Que esta gotícula completamente seco durante vários minutos, agitar vigorosamente o frasco cola novamente e adicionar um segundo gota de cola de prata na parte superior da primeira. Nota: Embora a cola de prata é um condutor eléctrico, que não causa significativadanos à cutícula do inseto. </li><li> Depois de fechar o frasco de cola, inserir a extremidade livre do fio de ouro na gotícula molhado e ainda manter o fio, permitindo a cola secar completamente (Figura 2N). Evitar manchas cola sobre pernas ou antenas e descartar um afídeo se isso aconteceu. </li><li> Desligue o dispositivo de fixação de sucção e cuidadosamente levante o inseto (Figura 2O). Se necessário, utilizar um pincel fino para auxiliar na supressão do pulgão do dispositivo de sucção. Nota: Fiação B. O brassicae não requerem um vácuo, uma vez que pode ser ligado em um pedaço de tecido de um laboratório de precisão, a superfície áspera do que fornece o pulgão com aderência suficiente de modo que não será levantada depois de aplicar uma gota de cola húmida ao seu abdómen. Após secagem da cola pode-se levantar o pulgão do tecido com a ajuda de um pincel fino. </li><li> Insira o pino de bronze com o inseto com fio para o isopor e, se necessário, continuarcablagem de todos os outros insectos a ser usado para a sessão de gravação EPG. Nota: Estes protocolos para a instalação elétrica pulgões funcionar bem para nós. O usuário pode encontrar a sua / seu próprio método para fiação pulgões. </li></ol></li><li> Passo 4. <ol><li> Coloque plantas na gaiola de Faraday (Figura 2P) sobre um suporte não condutor: utilizar placas de Petri ou uma placa de vidro ou de plástico. </li><li> Insira um eletrodo planta no solo de cada vaso. Insira o pino de bronze do inseto com fio ao conector de entrada do pré-amplificador EPG (Figura 2T). Nota: o eléctrodo de terra, não corresponde ao eléctrodo de terra utilizado em outras técnicas electrofisiológicas. Ele tem a tensão de deslocamento necessário para ajustar e compensar as tensões eletrodo de polarização. </li><li> Na interface do software de aquisição Stylet +, com freqüência de amostragem fixa de 100 Hz, digite um nome de arquivo, especifique o tempo de gravação, e escrever um texto para especificar os detalhes da experiência (tratamento, planta / inse<html> ct espécies, etc.) em Linhas de comentário 2 e 3. </li><li> Abaixe os insetos para uma área de pouso adequado da planta e começar a sessão de gravação clicando no botão Iniciar do software de aquisição (Stylet +) interface. Nota 1: um máximo de 8 canais podem ser utilizados simultaneamente num EPG configurado. Um EPG-eléctrodo ou vários EPG-eléctrodos por planta pode ser usado. Nota 2: quando o foco do estudo é o comportamento do pulgão, iniciar a gravação antes do acesso planta dos afídeos para evitar perder as primeiras atividades de penetração planta. </li><li> Para estudar as respostas electrofisiológicos das SE a estímulos, esperar, pelo menos, 10 minutos após o pulgão tenha entrado em fase floema, a fim de assegurar que o pulgão está numa fase ingestão floema sustentada, e que a linha de base do sinal é estável. Só então, iniciar um experimento estimulação da planta. </li></ol></li></ol>tp_upload / 52826 / 52826fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Fazendo EPG-eletrodos com pulgões ou outros insetos hemípteros para gravações gráfico penetração elétrica (EPG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Painéis AI, etapas necessárias para preparar EPG-eletrodos menos o pulgão. Em primeiro lugar, derreter uma peça de metal de solda na extremidade de um parafuso de solda (A). Em seguida, mergulhe a cabeça do alfinete de bronze em uma gota de fluido de solda (B), e entre em contato com o metal derretido na ponta do parafuso de solda (C). Imediatamente após este passo, em contacto com a extremidade de um fio de cobre para a ponta do parafuso de solda, de modo a que a cola da cabeça do pino de latão (EF). Com um bisturi ou uma lâmina, cortar um pedaço do fio de ouro (L). Mergulhoa extremidade livre do fio de cobre (juntou-se na outra extremidade ao pino de latão) sobre a cola de prata (H), e juntar-se rapidamente o fio de ouro a ele (I) antes da prata seca-se. O fio de ouro é um excelente condutor, e pode ser polarizada. Na realidade, na maioria dos casos, a polarização é muito pequeno para ser detectado, e se assim for, isto pode ser compensado com a tensão de deslocamento (V). Painéis de JO, passos necessários para ligar um pulgão (ou outro inseto hemíptero) para o eletrodo. Primeiro, levante cuidadosamente um afídeo com um pincel fino aquarela e colocá-lo na abertura do dispositivo de sucção a vácuo (J). Ligar a bomba de vácuo e cobrir o buraco da válvula de ar com um pedaço de papel para aplicar sucção. Mergulhe a ponta do pino de inseto na cola de prata (K), e colocar uma pequena gota de cola na parte superior do abdômen do pulgão, sob microscópio estereoscópico (LM). Dentro dopróxima ~ 20 seg, antes da gota de cola de prata sobre a seca de afídeos, inserir a extremidade do fio de ouro do eléctrodo de insectos para a gotícula de cola húmida de prata, e mantê-lo no lugar para 1-3 min, até que a cola tem de prata completamente (N) secou-se ao ar. Neste ponto, desactivar sucção através da remoção da folha de papel que cobre o orifício da válvula de ar do dispositivo de sucção e cuidadosamente remover o pulgão, a partir do dispositivo de sucção: levantando o pulgão após a ligação, muitas vezes requer alguma ajuda de um pincel fino (O). Painel P mostra uma visão geral de todo o EPG criada dentro da gaiola de Faraday, e Painel Q mostra uma visão geral da combinação planta-pulgão para EPG. Consulte a seção 2 acima para uma explicação mais detalhada deste processo. Pequenas letras são rótulos referentes aos itens que se deve fazer EPG-eletrodos: um: parafuso de solda; b: derretido do metal de solda;c: fluido de solda; d: bronze conector de pino (unha); e: fio de cobre; f: Fio Ø 18μm ouro; g: dispositivo de sucção; h: pulgão; i: cola de prata à base de água; j: gaiola de Faraday; k: eletrodo planta; l: conector de entrada (BNC) do pré-amplificador EPG.

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<li>Morris, G., Foster, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duelling+aphids%3A+electrical+penetration+graphs+reveal+the+value+of+fighting+for+a+feeding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site.</a> Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).</li>
</ol>

A WFT lançou a EPG Systems como uma atividade de aposentadoria e é afiliada financeiramente a ela.

Este artigo fornece um protocolo detalhado para a tomada elétrica Penetração Gráfico (OPG) gravações. A técnica EPG está bem estabelecida, com 100-200 de usuários ativos em todo o mundo, e tem sido implementada para muitos estudos sobre diferentes temas, por exemplo: a) resistência de plantas para pulgões e outros insetos portadores de estilete 13; b) de vírus de plantas e patógenos mecanismos de transmissão 14; c) Modo de inseticida de ação, (toxicidade e mudanças de comportamento) 15; ...

A capacidade para produzir sinais eléctricos de longa distância é uma característica vantajosa de organismos multi-celulares que permite respostas eficientes a estímulos externos. Esta característica tem evoluído independentemente em plantas e animais, e representa, portanto, um processo de evolução convergente. Dado que os sinais eléctricos são acoplados com funções importantes em animais, tais como a transmissão neuronal e a contracção muscular, a base molecular, o mecanismo de transmissão, e a função de sinais eléctricos induzidos por estímulos em animais são sujeitos de pesquisa intensiva. Em contraste, induzida por estímulo sinalização elétrica em plantas tem recebido pouca atenção da investigação. Embora as plantas não têm nervos ou músculos, parece haver provas suficientes para assumir que os sinais elétricos induzida por estímulo em plantas desempenham um papel fundamental nas suas respostas aos factores ambientais. O floema, o componente vivo da vasculatura planta, tem sido postulada como uma das principais substrate para a transmissão de sinais eléctricos induzidos por estímulos, a partir estimulada / danificado para áreas não estimuladas intactas / 2. As principais células do floema são os elementos de peneira (SES), células alongadas, relativamente simples. As extremidades das SEs estão ligados a outro SEs, formando um contínuo, de baixa resistência, sistema de tubo de peneira que se espalha por toda a planta. Há, no entanto, muito poucos estudos sobre as propriedades elétricas dessas células altamente especializadas. Nesses estudos anteriores, os pesquisadores acessada SEs com qualquer vidro micro-eletrodos 3 estiletes ou com eletrodos de vidro que foram acoplados a plantar-inseridos de pulgões, após stylectomy (corte) 4. Microeléctrodos de vidro são feitas a partir de capilares de vidro que são puxados numa extremidade com calor para uma ponta fina de menos do que 1 um de diâmetro, e depois encheram-se com uma solução de KCl. Um fio de Ag / AgCl ou platina, inserido no eléctrodo de vidro de KCl cheio é então ligado à entrada do amplificador, e um referenteeléctrodo for inserido no banho em torno da célula de interesse, completando o circuito. Esta configuração regista a diferença de potencial entre o eléctrodo de referência extracelular e intracelular do eléctrodo de medição, ou seja, o potencial da membrana da célula 5. Com este método, Umrath feita a primeira gravação intracelular a partir de uma célula de planta, utilizando as algas Nitella 6,7. Nitella é um organismo relativamente simples com células grandes, e portanto passíveis de experiências electrofisiologia intracelulares. Em contraste, a inserção de eléctrodos de vidro intracelular para as pequenas células de plantas terrestres, tridimensionais multi-celulares é tecnicamente exigente, requer um investigador altamente especializado, bem como a visualização sofisticado, micromanipulação, e material anti-vibração. Apesar de eletrodos de vidro são adequados para gravar a partir de células superficiais em plantas, tais como células epidérmicas raiz 8, recordin intracelulargs de células profundamente enraizado no tecido da planta, tais como SEs, muito prováveis ​​respostas induzidas por causar danos, confundindo os resultados. Em 1989, Fromm e Eschrich relataram a utilização de um método alternativo, designado por &quot;método pulgão &#39;, em que eléctrodos de vidro são acoplados a estiletes afídeos após stylectomy 4. O método pulgão é minimamente invasivo, por estiletes flexíveis não causar danos no tecido ou célula como eléctrodos de vidro fazer. Estiletes afídeos são grande invenção da natureza para a penetração planta, e pulgões são consideravelmente mais qualificados do que os seres humanos em encontrar SEs. Infelizmente, este método pulgão também é altamente exigente em termos de competências e de equipamento técnico. Além disso, o sucesso de cada experiência que implementa esta técnica depende inteiramente do pulgão estar no modo de alimentação - com o estilete estavelmente inserida num SE, no momento da stylectomy. Pensando em retrospectiva, pode-se ver que as chances de sucesso dessa técnica poderia ter sido improved adicionando à configuração experimental um instrumento que permite identificar se o estilete é pulgão na SE quando se aplica stylectomy. Em 1964, McLean e Kinsey descrito um &#39;sistema de controlo electrónico &quot;para o estudo do comportamento de alimentação de afídeos em tempo real 9,10. Neste sistema, o pulgão da planta e penetrou-estilete foram integrados num circuito eléctrico. Mais tarde, em 1978, Tjallingii concebeu uma versão modificada do sistema, chamado sistema de &#39;Electrical Penetration Graph &quot;(EPG) 11,12. Considerando que o sistema original de monitoramento eletrônico foi sensível aos potenciais originou-resistência, apenas com o sistema EPG, a força eletromotriz (fem) originou potenciais, ou seja, gerada na planta ou no inseto, pode ser gravadas, além de potenciais decorrentes da a resistência (R) no insecto. Isto representa uma melhoria importante, porque tanto o sinal componentes, emf e R,fornecer informação biológica relevante sobre os acontecimentos durante a penetração planta por pulgões. O que torna o pré-amplificador EPG sensíveis aos R componentes é a sua relativamente baixa resistência de entrada de 1 GÊ, que é próximo da média da resistência de plantas / pulgão. Uma pequena tensão de deslocamento (Figura 1, V) de cerca de 100 mV é aplicada à planta, o qual, em seguida, é dividido entre plantas e de insectos, de um lado, e a resistência de entrada do outro. As tensões e as alterações são medidas num ponto (Figura 1A, B) entre o insecto e a resistência de entrada. Portanto, o R-componentes representam modulações de resistência de plantas pulgão da tensão de offset, enquanto os EMF-componentes são uma certa fração do potencial da planta na ponta do estilete e potenciais causados ​​no inseto. Os potenciais de plantas - mais relevantes aqui - são potenciais principalmente membrana das células vegetais perfurados por estiletes afídeos. Os potenciais de insectos parecem ser principalmentepotenciais de streaming causadas por movimentos fluidos dentro dos dois canais estilete, ou seja, a comida e os canais salivares; há potenciais nervosas ou musculares internos são registrados no EPG. Na prática, as funções de ponta de estilete como uma ponta do eletrodo. Todas as células vegetais são carregadas negativamente para dentro em relação ao exterior da célula positiva. A corrente eléctrica (isto é, o movimento de iões carregados em solução aquosa) que flui a partir do interior para o exterior e vice-versa é muito limitada devido à alta resistência da membrana celular. Normalmente, o potencial de repouso é mantida constante. No entanto, quando os iões negativos mover para fora ou iões positivos mover-se através da membrana celular, o potencial de membrana é reduzido, isto é, &#39;despolariza&#39;. A despolarização ocorre no caso de excitação celular. Íons, em seguida, entrar ou sair quando os canais iónicos específicos na membrana são abertos ou quando a membrana está danificado e íons vazar dentro e para fora. Todas as células têm canais iônicos e bombas em tele membrana plasmática que trazem o potencial de membrana para o seu nível de repouso, restaurando a concentração original de vários iões dentro da célula. O potencial de repouso e as suas modificações são componentes emf, e, por conseguinte, a técnica do EPG é adequado para medi-los. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52826/52826fig1.jpg" /> Figura 1. EPG-eletrodos. O GPE-eléctrodo é um pulgão de estar integrados no circuito eléctrico de penetração Gráfico (EPG), cuja estilete é inserido um elemento de crivo (SE) no modo de alimentação estável. Se o empalado-SE estilete está em repouso (painel A), a tensão no circuito, gravado por EPG, é estável e, ao nível de potencial de repouso (painel C, de lazer). Se o SE é animado, seus despolariza membranas (painel B), que é visualizada no EPG como um aumento gradual na voltagem (painel C, despolarização). À medida que o equilíbrio iónico no SE retorna ao descanso, ou seja, repolarizes, a tensão registrada por EPG diminui gradualmente ao resto nível potencial (Painel C, Repolarização). No painel C, &quot;A&quot; e &quot;B&quot; referem-se aos diferentes cenários apresentados nos painéis A e B, respectivamente. V = fonte de tensão compensado ajustável. Ri = resistor de entrada. Em paralelo com a resistência externa 1 GÊ, o amplificador tem uma interna (no amplificador operacional) de alta resistência de 1,5 TΩ (painéis A e B, a cinzento). Por controle remoto da chave do pré-amp EPG pode ser alterado de normal a EMF-mode, que permite a obtenção de valores de alta precisão de tensão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Na próxima seção, nós fornecemos o leitor com um protocolo básico para a realização de experimentos EPG que é válido para ambos os estudos de insetos com foco e focou-planta.

<table><tbody><tr><td>Pinos de conector de latão</td><td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>&Phi; Fio</td></tr><tr><td>de cobre fino</td> de 1,2 mm <td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>aprox. &Phi; 0,2 mm</td></tr><tr><td>Fio de ouro fino</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>&Phi; 18 &micro; m</td></tr><tr>Loja <td></td> de <td>ferragens</td><td>para fluidos de solda</td><td>combinando com o fio de solda</td></tr><tr><td>Loja</td><td></td><td></td>de <td>ferragens</td> para solda com núcleo de resina</tr><tr><td>Isopor</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cola de prata à base de água</td><td>EPG Systems</td><td></td><td><a href="http://www.epgsystems.eu/">receita em: www.epgsystems.eu</a></td></tr><tr><td>Toalhetes de papel</td><td>Kimberly-Clark</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Parafuso de solda</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>estereomicroscópio</td><td>Hund Wetzlar</td><td></td><td>a ampliação mínima é 10X</td></tr><tr><td>Tesoura pequena</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinças finas</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice</td><td>A. Hartenstein</td><td>L46</td><td></td></tr><tr><td>Pincéis de aquarela</td><td>qualquer</td><td></td><td>número 1 ou 2</td></tr><tr><td>Dispositivo</td><td></td><td></td> de sucção de ar <td>veja a descrição em: www.epgsystems.eu</td></tr><tr><td>Alfinetes de insetos</td><td>qualquer</td><td></td><td>nº 1 ou 2</td></tr><tr><td>Mesa</td><td></td><td></td><td></td>sólida</tr><tr><td>Gaiola</td><td></td><td></td> de Faraday <td>Feito à mão</td></tr><tr><td></td><td>Computador Fujitsu Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição de dados</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>Stylet+d</td></tr><tr><td>Giga-4 (-8) Sistema Completo</td><td>EPG Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>inclui o seguinte:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Caixa de controle principal com saída</td><td></td> USB <td>Di155/Di710</td><td>12/14 bit, taxa 100&nbsp; Hz (softw. fixo)</td></tr><tr><td>Sondas EPG 4 (8)</td><td></td><td></td><td>50x pré-amplificador DC</td></tr><tr><td>Grampos giratórios na haste</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptador</td><td></td><td></td> de energia DC <td>bipolar, 230/115 VAC para -/+8 VDC</td></tr><tr><td>Eletrodos e cabos</td><td></td><td></td><td></td>da planta</tr><tr><td>Cabos adicionais de teste e terra&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um novo aplicativo do electrical penetration graph (epg) para aquisição e medição de sinais elétricos em floema sieve elements

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Propriedades electrofisiológicas de células são frequentemente estudado in vitro, depois dissociando-os dos seus ambientes nativos. No entanto, o estudo de transmissão eléctrico entre células distantes de um organismo requer in vivo, gravações livre de artefactos de células embebidas dentro do seu ambiente nativo. A transmissão de sinais elétricos a partir de feridos para áreas sem ferimentos em uma planta tem, desde há muito despertou o interesse de botânicos. O floema, a parte viva da vasculatura planta que se espalha por toda a planta, tem sido postulada como uma das principais tecido em transmissão eléctrica em plantas. A falta de métodos eletrofisiológicos adequados coloca muitos desafios para o estudo das propriedades elétricas das células do floema in vivo. Aqui nós apresentamos uma nova abordagem para eletrofisiologia intracelular de elementos crivados (SEs) que usa pulgões vivos ou outros insetos hemípteros floema-alimentação, integrado no gra penetração elétricaph (EPG) circuito. A versatilidade, robustez e precisão deste método, foi possível gravar e estudar em detalhe os sinais elétricos induzidos por feridas em SEs das veias centrais da planta modelo Arabidopsis thaliana 1. Aqui mostramos que GPE-eléctrodos pode ser facilmente implementado para registos electrofisiolicos intracelulares de SE em veias marginais, bem como estudar a capacidade das SE para responder com sinais eléctricos de vários estímulos externos. A abordagem EPG aplicado a electrofisiologia intracelular das SE pode ser implementada de uma grande variedade de espécies de plantas, em um grande número de combinações de plantas / insectos, e para muitos pesquisa pretende.

Em um estudo anterior, implementamos a técnica EPG-eletrodo com o objetivo de caracterizar os sinais elétricos produzidos em SEs do midvein durante o ataque da lagarta 1. A nervura central é um local de inserção preferencial para eléctrodos de vidro convencionais, bem como dos eléctrodos de vidro e de estilete, porque é SE-denso, e relativamente robustos, portanto, susceptível de fixação necessários para a implementação destas técnicas. Aqui, nós tiramos proveito da versatilidade do eletrodo EPG com o objecti...

O Gráfico de Penetração Elétrica (EPG) é uma técnica bem estabelecida para estudar o comportamento alimentar de insetos portadores de estilete. Aqui mostramos uma nova aplicação do EPG como uma ferramenta não invasiva para a aquisição de registros eletrofisiológicos intracelulares de elementos de peneira (SEs), as células que formam a vasculatura do floema nas plantas.

Um novo aplicativo do Electrical Penetration Graph (EPG) para aquisição e medição de sinais elétricos em Floema Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar os sinais elétricos de longa distância transmitidos por meio dos elementos crivados, de uma área sendo consumida por uma lagarta até uma área intacta em uma planta. Isso é conseguido montando um circuito de gráfico de penetração elétrica ou EPG, que integra um inseto hematófago, como um afídeo, e uma planta. O afídeo insere seu estilete na planta, fechando assim o circuito, e a gravação do EPG começa.Eventualmente, o afídeo insere seu estilete em um elemento crivado e saliva nele por alguns minutos, seguido pela fase prolongada de ingestão; tanto a fase de salivação ou E1 quanto a fase de ingestão ou E2 contêm potenciais de corrente pequenos e rítmicos. Em seguida, uma lagarta é colocada sobre uma folha e deixada se alimentar de uma folha. Enquanto o afídeo registrado pelo EPG continua se alimentando do fluxo em uma folha vizinha, o dano causado pela lagarta à nervura central iniciará um sinal elétrico que será transmitido através do floema para as outras folhas, incluindo a folha da qual o afídeo ligado ao EPG está se alimentando.O tamanho do sinal pode ser medido por comparação com um pulso de calibração de tamanho conhecido, que foi aplicado anteriormente durante a fase E dois ou de ingestão. Os resultados mostram que o dano mediado por lagarta em uma folha induz consistentemente um sinal elétrico complexo e significativamente grande no fluxo de uma folha vizinha, com um primeiro componente lento e um segundo componente rápido sobreposto ao primeiro. A técnica de gráfico de penetração elétrica foi introduzida na década de 1960.A monitorização EPG contribuiu significativamente para o nosso conhecimento sobre a penetração de plantas por afídeos e outros insetos hemípteros. O principal interesse econômico reside no estudo dos mecanismos de resistência da planta hospedeira, bem como dos mecanismos de transmissão de vírus vegetais. Assim, surgiu o conceito de utilizar o EPG como um método de eletrofisiologia intracelular em plantas, estabelecendo uma associação entre gravações EPG e gravações intracelulares realizadas com eletrodos de vidro convencionais, preenchidos com cloreto de potássio, tanto nas gravações EPC quanto nas gravações convencionais feitas com eletrodos de vidro.Existem dois níveis de tensão: um nível de tensão relativamente alto, que corresponde à posição intracelular da ponta do eletrodo de vidro ou da ponta do estilo dos AE, e um nível de tensão relativamente baixo, que corresponde à posição intracelular do eletrodo de vidro ou do orifício dos AE. No caso do EPG. Ao criar pulgões para gravações de PG, a escolha da planta e da espécie de pulgão depende do objetivo da pesquisa; para estudos sobre a rápida opana, o pulgão é apropriado, devendo ser criado em estufa com gaiolas ao redor do criadouro.As plantas devem ser protegidas contra afídeos e parasitoides utilizando telas de malha fina com aberturas menores que um milímetro, mas as tampas das gaiolas devem ser de material transparente para permitir a fotossíntese. A cada duas semanas, a população de afídeos deve ser transferida para plantas novas. Apenas 10 a 20 adultos são necessários, podendo os demais afídeos ser descartados.Para gravações EPG de insetos, um eletrodo especializado deve ser construído a partir de pinos de conector de latão, um pedaço de fio de cobre com comprimento de um a dois centímetros, como filamentos de um cabo elétrico, e um pedaço de fio de ouro muito fino com cerca de 1,5 centímetro de comprimento. Além disso, utilize uma cola prateada à base de água e um pequeno parafuso de solda simples com fluido de solda e fio de solda com resina. Para começar, derreta um pedaço de fio de metal de solda na ponta de um parafuso de solda.Em seguida, mergulhe a ponta do prego de latão em uma gota de fluido de solda. Imediatamente, encoste a ponta do fio de cobre na ponta do parafuso de solda, fundindo-o ao pino de latão. Agora agite bem ou use vortex na cola de prata para que a emulsão não esteja sedimentada.Abra o frasco e mergulhe a extremidade livre do fio de cobre na cola na tampa, sob um estereoscópio. Una a malha de ouro com uma sobreposição de pelo menos um milímetro e deixe a cola de prata secar. Tente não espalhar a cola sobre a placa do microscópio após a secagem; verifique o contato entre a cola de prata e o fio de ouro nas partes onde os fios em junção não estão colados.Adicione cola fresca com um pequeno alfinete ou fio de cobre até que o inseto esteja pronto. O eletrodo concluído pode ser armazenado com segurança em isopor. Para fixar o pulgão, utilize um dispositivo de vácuo caseiro simples.A sucção é controlada por um pequeno pedaço de papel sobre um orifício de entrada. Ligue o dispositivo de vácuo e mova-o sobre a platina do microscópio estereoscópico para centralizar sua ponteira de sucção. Colete um afídeo com um pincel de aquarela de tamanho pequeno dois ou menor, e posicione o afídeo sobre seu lado ventral em direção à ponteira de sucção para facilitar o acesso ao dorso.Usando o pincel, remova qualquer cera superficial do abdômen, que é abundante no pulgão do repolho. Agite ou vortexe bem a cola prata e, com um alfinete fino para insetos, aplique uma pequena gota de cola prata sobre o dorso do pulgão. Deixe secar por dois a três minutos.Agite novamente o frasco e aplique uma gota de cola sobre a primeira gota seca. Em seguida, fixe o fio de ouro do eletrodo para inseto preparado na segunda gota de cola de prata. Enquanto ainda estiver úmida, mantenha o fio na posição, imóvel, até a cola secar.Se alguma cola acabar grudando nas pernas ou em qualquer parte do afídeo, recomece com um novo animal. O eletrodo para insetos pode ser reutilizado. Após a cola ter secado.Desligue a sucção e solte o pulgão do dispositivo de vácuo. O inseto com fiação está agora pronto para ser usado em gravações de EPG. Alguns pulgões podem ser preparados sem fixação a vácuo.Neste caso, coloque o afídeo sobre um pedaço de papel toalha de laboratório, que é áspero o suficiente para o afídeo permanecer preso. Durante a aplicação da cola, um fio de ouro pode ser inserido na primeira gota de cola de prata. Se esta gota for muito pequena ou se secar muito rapidamente, o fio de ouro não se fixará adequadamente.Nesse caso, basta colocar uma pequena gota de cola de prata sobre a primeira e inserir o fio de ouro, aguardando até que a cola seque. Em seguida, levante o pulgão do papel manteiga com a ajuda de um pincel fino. Armazene os pulgões com fio metálico inserindo o prego de latão na espuma de poliestireno até o momento em que for necessário.Para começar, coloque as plantas experimentais dentro da gaiola de Faraday sobre um suporte não condutor, como uma placa de Petri. Agora, insira um eletrodo vegetal no solo de cada vaso. O eletrodo vegetal não é um eletrodo de terra que precise ser conectado à gaiola de Faraday.Em seguida, insira o pino de latão do eletrodo no EPG. Ajuste previamente a posição da planta e do inseto até que estejam em contato, com o inseto na posição desejada sobre a planta. Utilizando o software de interface Style plus, que possui uma frequência de amostragem fixa de 100 hertz, digite um nome de arquivo, especifique o tempo de gravação e insira um texto para detalhar os aspectos do experimento nas linhas de comentário.Em seguida, inicie a gravação por meio do software clicando no botão de início no canto superior esquerdo. Comece o experimento posicionando o afídeo com fio na planta, com até oito canais, ou seja, oito insetos com fio podem ser registrados simultaneamente por um único conjunto de EPG, seja um por planta ou vários afídeos em uma mesma planta. Quando o afídeo inserir seu estilete na planta, o circuito será completado.As tensões flutuantes do sinal EPG aparecerão na tela do computador; faça ajustes da tensão da planta e do ganho para uma gravação ideal. Na maioria dos casos, levará pelo menos uma hora para que um pulgão entre na fase de fluxo. A alimentação contínua por fluxo é indicada por pelo menos 10 minutos da forma de onda E dois.Neste momento, o eletrodo está pronto para adquirir sinais elétricos do elemento crivado, os quais só devem ser induzidos quando o sinal E dois estiver estável. É importante aplicar um ou mais pulsos de calibração, que serão usados posteriormente para estimar o tamanho dos sinais elétricos. Cortar uma folha com tesoura induz consistentemente um sinal elétrico de longa distância que é adquirido pelo afídeo gravado pelo EPG.Em um experimento mais realista, uma lagarta faminta é utilizada como agente causador de ferimento. Os danos provocados pela lagarta induzem consistentemente sinais elétricos lentos e rápidos que se propagam até as outras folhas e podem ser registrados com eletrodos EPG. O ruído gerado pela introdução da lagarta não afetará a resposta eletrofisiológica da planta, mas poderá mascará-la; portanto, é necessário minimizar esse ruído.O experimentador deve estar aterrado para testar se uma lagarta se alimentando induz sinais elétricos na folha que está sendo consumida. Uma lagarta faminta é colocada sobre a folha que também contém o pulgão registrado pelo EPG, quando duas folhas diferentes foram cortadas sequencialmente com tesoura na junção da lâmina foliar. Um eletrodo EPG posicionado na nervura central de uma folha intacta, adjacente às duas folhas cortadas, detectou respostas eletrofisiológicas semelhantes no mesmo elemento de peneira frente a esses ferimentos.Esses eletrofisiológicos consistiram em uma despolarização lenta e uma despolarização rápida sobreposta à lenta. Em outro experimento, duas folhas também foram cortadas, mas neste caso, uma era vizinha à folha contendo o eletrodo EPG, enquanto a outra não era vizinha à folha com o eletrodo EPG. Neste caso, o único elemento crivado respondeu de maneira diferente aos ferimentos.O ferimento na folha não vizinha induziu inicialmente apenas um sinal elétrico lento, enquanto o ferimento na folha vizinha induziu um sinal complexo com componentes lentos e rápidos. Esses resultados sugerem que os elementos de sieve são capazes de detectar a localização do dano aqui usando um afídeo conectado ao sistema EPG, foram realizadas gravações intracelulares de um elemento de sieve marginal em uma folha de uma planta de arabidopsis. O corte de uma folha vizinha induziu um sinal elétrico que foi transmitido ao elemento de sieve no qual o estilete do afídeo estava inserido.Diferentemente dos elementos crivados nas veias principais, os elementos crivados nas veias marginais responderam a danos remotos com apenas uma única onda lenta de despolarização, que pode corresponder à onda lenta de despolarização nos elementos crivados centrais. O método de gráfico de penetração elétrica ou repetição é uma técnica que pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de eletrofisiologia vegetal e fisiologia vegetal, como, por exemplo, quais canais estão envolvidos nos sinais elétricos de longa distância que se propagam de folha para folha, e, mais importante ainda, qual é o papel desses sinais na adaptação das plantas ao seu ambiente? Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma ideia de como preparar plantas e insetos para o EPG.Registrar a fiação de insetos parece complicado, mas demonstramos que é bastante simples e pode incentivá-lo a implementá-lo em sua própria pesquisa.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Um microdispositivo com elevado potencial de transferência é utilizado para demonstrar tridimensional (3D) dieletroforese (DEP) com novos materiais. Papel nanoplatelet grafeno e fita dupla face foram alternadamente empilhados; um micro-poços 700 um foi perfurado transversal às camadas. DEP comportamento de esferas de poliestireno, foi demonstrada em micro-poços.

Desenvolvimento de um dispositivo 3D Grafeno Eletrodo dieletroforética

Esta apresentação demonstra um método pelo qual a eletroporação de células aderentes e cultivadas é usada para o estudo da comunicação intercelular e juncional, enquanto as células crescem em uma lâmina revestida com óxido de índio-estanho condutor e transparente.

Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

Os transportadores nas membranas celulares permitem a segregação diferencial de íons através das membranas celulares ou camadas celulares e desempenham papéis cruciais durante a fisiologia, reparo e patologia dos tecidos. Descrevemos o microeletrodo de auto-referência íon-seletivo que permite a medição de fluxos de íons específicos em células e tecidos individuais in vivo.

Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

Este manuscrito descreve as aplicações dos eletrodos seletivos-próton e patch aperto métodos para medir a atividade dos sistemas de transporte de prótons. Esses métodos de superar algumas limitações das técnicas comumente utilizadas para estudar a actividade de transporte de prótons, como sensibilidade moderada, resolução de tempo e controle do meio intracelular insuficiente.

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

O artigo descreve um protocolo otimizado para fazer fatias de tecido cerebral-hipófise viável, usando o medaka peixes teleósteos (Oryzias latipes), seguido por gravações eletrofisiológicas de células da hipófise, usando a técnica de remendo-braçadeira com o configuração de remendo perfurada.

Fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos

Este artigo contem um jogo dos protocolos para o desenvolvimento de redes pluripotentes induzidas humanas do cardiomiócito (hipsc-cm) cultivadas em placas de de mea para electroporate reversivelmente a membrana de pilha para medidas do potencial da ação. Gravações de alta taxa de transferência são obtidas dos mesmos sites de célula repetidamente ao longo dos dias.

Redes humanas de cardiomiócitos derivadas de iPSC em matrizes de microeletrodos Multipoços para gravações em potencial de ação recorrente

O uso combinado da tecnologia de matriz de microeletrodos e estimulação química induzida por 4 aminopirdina para investigar a atividade nociceptiva em nível de rede no chifre dorsal da medula espinhal é delineado.

Atividade de rede de gravação em circuitos nociceptivos da coluna vertebral usando matrizes de microeletrodos

Este protocolo descreve as técnicas de microfabricação necessárias para construir um dispositivo de eletroporação microfluídica de laboratório em um chip. A configuração experimental realiza transfecções controladas em nível de célula única em um fluxo contínuo e pode ser estendida a rendimentos mais altos com controle de base populacional. Uma análise é fornecida mostrando a capacidade de monitorar eletricamente o grau de permeabilização da membrana celular em tempo real.

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Eletropenetrografia AC-DC para o Estudo dos Comportamentos de Sondagem e Ingestão de Mosquitos Culex tarsalis em Mãos Humanas

A eletroporação de substrato poroso (PSEP) combina entrega consistente e de alto rendimento com alta viabilidade celular. A introdução de medições de impedância elétrica transepitelial (TEEI) fornece informações sobre os processos intermediários do PSEP e permite a entrega sem rótulos. Este artigo discute um método para realizar experimentos de entrega de PSEP e análise de medição TEEI simultaneamente.

Eletroporação Baseada em Substrato Poroso com Monitoramento de Impedância Elétrica Transepitelial

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Monitoramento de mudanças induzidas por eletroporação na geração de potencial de ação em células Tet-On Spiking HEK geneticamente modificadas

Aprenda a usar a técnica EPG para registrar sinais elétricos intracelulares em elementos de crivo do floema durante a alimentação de afídeos. Este método permite estudar as respostas das plantas à herbivoria e as interações planta-inseto.

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