Um novo aplicativo do Electrical Penetration Graph (EPG) para aquisição e medição de sinais elétricos em Floema Sieve Elements

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar os sinais elétricos de longa distância transmitidos através dos elementos da peneira de fluxo de uma área sendo comida por uma lagarta para uma área intacta em uma planta. Isso é conseguido montando um gráfico de penetração elétrica ou circuito EPG que integra um inseto hemin, como um pulgão e uma planta. O pulgão insere seu estilo na planta, fechando assim o circuito, e a gravação do EPG começa.

Eventualmente, o pulgão insere seu estilo em um elemento de peneira e saliva nele por alguns minutos, seguido pela fase de ingestão de longa duração, tanto a salivação ou E uma fase quanto a ingestão ou E duas fases contêm potenciais de fluxo pequenos e rítmicos. Em seguida, uma lagarta é colocada em uma folha e deixada para se alimentar de uma folha. Enquanto o pulgão registrado no EPG continua a se alimentar do fluxo em uma folha vizinha, o dano infligido pela lagarta à nervura média iniciará um sinal elétrico que será transmitido através do phem para as outras folhas, incluindo a folha da qual o pulgão com fio EPG está se alimentando.

O tamanho do sinal pode ser medido por comparação com um pulso de calibração de tamanho conhecido, que foi aplicado anteriormente durante o E dois ou fase de ingestão. Os resultados mostram que o dano mediado pela Caterpillar de uma folha induz consistentemente um sinal elétrico complexo e significativamente grande no fluxo de uma folha vizinha com um primeiro componente lento e um segundo e sobreposto ao primeiro componente rápido. A técnica do gráfico de penetração elétrica foi introduzida na década de 1960.

O monitoramento do EPG contribuiu substancialmente para o nosso conhecimento da penetração de pulgões e outros insetos da bainha. O principal interesse econômico é estudar mecanismos de resistência da planta hospedeira, bem como mecanismos de transmissão de vírus de plantas. Então, criei um conceito de usar EPG como um método para eletrofisiologia intracelular em plantas, fazendo uma associação entre gravações de EPG e gravações intracelulares feitas com eletrodos de vidro convencionais preenchidos com cloreto de potássio em gravações EPC e gravações convencionais feitas com eletrodos de vidro.

Existem dois níveis de tensão, um nível de tensão relativamente alto que corresponde à posição intracelular da ponta do eletrodo de vidro ou da ponta do estilo EAs, e um nível de tensão relativamente baixo, que corresponde à posição intracelular do eletrodo de vidro ou do ilhó dos EAs. No caso do EPG. Ao criar pulgões para gravações de PG, a escolha das espécies de plantas e pulgões depende da pesquisa Procure estudos sobre a opana rápida, o pulgão é apropriado, crie-os em uma estufa nas gaiolas ao redor da criação.

As plantas devem ser à prova de pulgões e parasitóides usando telas finas com aberturas de menos de um milímetro, mas os topos das gaiolas devem ser de material transparente para permitir a fotossíntese. A cada duas semanas, a população de pulgões deve ser transferida para plantas frescas. 10 a 20 adultos são tudo o que é necessário, os pulgões restantes podem ser descartados.

Para gravações de EPG de insetos, um eletrodo especializado deve ser construído a partir de pinos conectores de latão, um comprimento de um a dois centímetros de fio de cobre, como filamentos de um cabo elétrico, e um pedaço de fio de ouro muito fino de cerca de 1,5 centímetros de comprimento. Além disso, use uma cola de prata à base de água e um pequeno parafuso de solda simples com fluido de solda e fio de solda de cabo de resina. Para começar, derreta um pedaço de fio de metal de solda na ponta de um parafuso de solda.

Em seguida, mergulhe a cabeça do prego de latão em uma gota de fluido de solda. Entre imediatamente em contato com a ponta do fio de cobre com a ponta do parafuso de solda, derretendo-o no pino de latão. Agora agite bem ou vórtice a cola de prata para que a emulsão não assente.

Abra a garrafa e mergulhe a extremidade livre do fio de cobre na cola da tampa sob um estereoscópio. Junte a malha dourada com uma sobreposição de pelo menos um milímetro e deixe a cola prateada secar. Tente não manchar a cola na placa do microscópio depois que a cola estiver seca, verifique o contato entre a cola de prata e o fio de ouro onde partes dos fios da junta não estão coladas.

Adicione cola fresca com um pequeno alfinete ou fio de cobre até que o inseto esteja pronto. O eletrodo completo pode ser armazenado com segurança em isopor. Para consertar o pulgão, use um dispositivo de vácuo simples construído em casa.

A sucção é controlada por um pequeno pedaço de papel sobre um orifício de entrada. Ligue o dispositivo de vácuo e mova-o na placa do microscópio estéreo para centralizar sua ponta de sucção. Colete um pulgão em um pincel de aquarela de tamanho pequeno ou menor e monte o pulgão em seu lado ventral em direção à ponta de sucção para facilitar o acesso ao dorso.

Usando a escova, remova qualquer cera superficial do abdômen, que é abundante no pulgão do repolho. Agora agite bem ou vortex a cola de prata e, usando um alfinete de inseto fino, aplique uma pequena gota de cola de prata no dorso dos pulgões. Deixe secar por dois a três minutos.

Agite o frasco novamente e aplique uma gota de cola em cima da primeira gota seca. Em seguida, prenda o fio de ouro do eletrodo de inseto preparado na segunda gota de cola de prata. Enquanto ainda estiver molhado, mantenha o fio na posição enquanto a cola seca.

Se alguma cola entrar nas pernas ou em qualquer pulgão, comece de novo com o novo animal. O eletrodo de inseto pode ser reciclado. Assim que a cola secar.

Desligue a sucção e liberte o pulgão do dispositivo de vácuo. O inseto com fio agora está pronto para ser usado para gravações de EPG. Alguns pulgões podem ser conectados sem fixação a vácuo.

Nesse caso, coloque o pulgão em um pedaço de tecido de laboratório, que seja áspero o suficiente para que o pulgão fique preso. Durante a aplicação da cola, um fio de ouro pode ser inserido na primeira gota de cola de prata. Se essa gota for muito pequena ou se secar muito rapidamente, o fio de ouro não se prenderá corretamente.

Nesse caso, basta colocar uma pequena gota de cola prateada em cima da primeira e inserir o fio de ouro, esperar até que a cola seque. Em seguida, levante o pulgão do lenço de papel com a ajuda de uma escova fina. Armazene os pulgões com fio inserindo o prego de latão no isopor até que seja necessário.

Para começar, coloque as plantas experimentais na gaiola de Faraday em um suporte não condutor como uma placa de Petri. Agora, insira um eletrodo de planta no solo de cada vaso. O eletrodo da planta não é um eletrodo de aterramento que precisa ser coletado para a gaiola de Faraday.

Em seguida, insira o pino de latão do eletrodo no EPG. Pré-ajuste a posição da planta e do inseto até que estejam em contato com o inseto na posição desejada na planta. Usando o software de interface Style plus, que tem uma frequência de amostragem fixa de 100 hertz, insira um nome de arquivo, especifique o tempo de gravação e escreva texto para especificar detalhes do experimento nas linhas de comentário.

Em seguida, inicie a gravação através do software clicando no botão Iniciar no canto superior esquerdo. Comece o experimento abaixando o pulgão com fio na planta em até oito canais, o que significa que oito insetos com fio podem ser registrados simultaneamente por uma configuração de EPG, um por planta ou mais pulgões em uma planta. Quando o pulgão insere seu estilo na planta, o circuito é concluído.

As tensões flutuantes do sinal EPG aparecerão na tela do computador, faça ajustes da tensão e ganho da planta para uma gravação ideal. Na maioria dos casos, um pulgão levará pelo menos uma hora para entrar na fase de fluxo. A alimentação de fluxo sustentado é indicada por pelo menos 10 minutos de forma de onda E dois.

Neste ponto, o eletrodo está pronto para adquirir sinais elétricos do elemento da peneira, que só devem ser induzidos quando o sinal E dois estiver estável. É importante fornecer um ou mais pulsos de calibração, que serão usados posteriormente para estimar o tamanho dos sinais elétricos. Cortar uma folha com uma tesoura induz consistentemente um sinal elétrico de longa distância que é adquirido pelo pulgão registrado no EPG.

Em um experimento mais realista, uma lagarta faminta é usada como agente feridor. Os danos infligidos pela Caterpillar induzem consistentemente sinais elétricos lentos e rápidos que viajam para as outras folhas e podem ser adquiridos com eletrodos de EPG. O ruído gerado pela introdução da lagarta não afetará a resposta eletrofisiológica da planta, mas pode mascará-la para minimizar esse ruído.

O experimentador deve ser aterrado para testar se uma lagarta que se alimenta induz sinais elétricos na folha que está sendo comida. Uma lagarta faminta é colocada na folha que também contém o pulgão registrado no EPG quando duas folhas diferentes foram cortadas sequencialmente com uma tesoura na junção da lâmina peral. Um eletrodo de EPG colocado na nervura média de uma folha intacta que era vizinha de ambas as folhas cortadas detectou respostas eletrofisiológicas semelhantes do mesmo elemento de peneira a essas feridas.

Estes eletrofisiológicos consistiam em uma despolarização lenta e uma despolarização rápida sobreposta à lenta. Em outro experimento, duas folhas também foram cortadas, mas, neste caso, uma era vizinha da folha contendo o eletrodo de EPG, enquanto a outra não era vizinha da folha com o eletrodo de EPG. Nesse caso, o elemento de peneira única respondeu de forma diferente às feridas.

O ferimento na folha não vizinha induziu primeiro apenas um sinal elétrico lento, enquanto o ferimento na folha vizinha induziu um sinal complexo com componentes lentos e rápidos. Esses resultados sugerem que os elementos SIV são capazes de detectar a localização do dano aqui usando um pulgão conectado ao sistema EPG, os registros intracelulares foram feitos a partir de um elemento de peneira marginal em uma folha de uma planta de arabidopsis. O corte de uma folha vizinha induziu um sinal elétrico que foi transmitido ao elemento da peneira no qual o estilete de pulgão foi inserido.

Ao contrário dos elementos da peneira nos veios principais, os elementos da peneira nos veios marginais responderam a danos remotos com apenas uma única onda de despolarização lenta que pode corresponder à onda de despolarização lenta nos elementos da peneira central. O gráfico de penetração elétrica ou repetição é um método que pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da eletrofisiologia vegetal e fisiologia vegetal, como, por exemplo, quais estão nos canais, subjacentes aos sinais elétricos de longa distância que viajam de folha em folha e, o mais importante, quais são os papéis desses sinais na adaptação das plantas ao seu ambiente? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma ideia de como preparar plantas e insetos para o EPG.

Registrar a fiação de insetos parece complicado, mas mostramos que é bastante simples e pode encorajá-lo a implementá-lo em sua própria pesquisa.