Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

O objetivo geral deste procedimento é clonar e expressar anticorpos produzidos por linfócitos B. Isso é realizado primeiramente isolando linfócitos B a partir de um tecido-fonte relevante, como sangue ou timo. O segundo passo consiste em realizar triagem e selecionar a população de linfócitos B positiva para a produção de IgG.

Em seguida, as células são imortalizadas por infecção com o vírus Epstein-Barr juntamente com a ativação do receptor tipo toll 9 por C-P-G-O-D-N 2006 e mantidas em cultura. Os passos finais consistem em isolar RNA de clones que testaram positivo para produção de IgG por Eliza e gerar DNA complementar das cadeias leve e pesada da IgG. Por fim, as sequências de IgG podem ser clonadas em vetores de expressão mamíferos para produzir grandes quantidades de IgG humana monoclonal.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a tecnologia de exibição em fagos, é que o emparelhamento original das cadeias pesada e leve da IgG não é perdido. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da autoimunidade, como a descoberta e a caracterização funcional de autoanticorpos patogênicos. Não se esqueça de que trabalhar com material de pacientes e com o vírus EBV pode ser arriscado.

O vírus EB é um patógeno humano e precauções como VSL dois PROEs e o uso de proteção adequada devem sempre ser tomadas ao realizar esses passos. Antes de corar os PBMCs, plaqueie-os em um frasco de 25 centímetros com seis mililitros de meio RPMI 1640 completo e deixe-os recuperar durante a noite. Após o bloqueio e lavagem das células, colete os PBMCs em um tubo com meio mililitro de meio e centrifugue-os. Em seguida, ressuspenda as células em tampão de marcação e conte-as.

Em seguida, prepare dois tubos FACS com 5 milhões de células em 200 microlitros de tampão e adicione a esses tubos. Acrescente 10 microlitros de anti-CD22 PE-Cy5 ou 40 microlitros de anti-IgG PE e deixe incubarem por 30 minutos no gelo e no escuro, depois lave, filtre e separe as células. O objetivo é quantificar as células duplo-positivas.

Inicie diluindo as CMBP classificadas em uma célula por microlitro em meio RPMI 1640 completo, com adição de CPG 2006 e VEB. Em seguida, em uma câmara de fluxo laminar, semeie 110 microlitros da diluição celular com VEB e CPG 2006 em dois poços de uma placa de fundo redondo de 96 poços previamente revestida com células WI 38 irradiadas. A infecção com 50 células por poço é otimizada e aumenta a probabilidade de obtenção de um anticorpo monoclonal.

No entanto, recomendamos confirmar isso por meio de uma PCR. Após uma semana de incubação, examine as células ao microscópio para verificar o crescimento de linfócitos B. Após duas semanas, troque o meio aspirando lentamente 90 microlitros de meio de cada poço e transfira-o para uma nova placa.

Para testar a produção de IgG por ELISA. Em seguida, adicione novamente 100 microlitros de meio suplementado fresco, incluindo IL-2, a cada poço. Continue monitorando o crescimento do clone durante a terceira e a quarta semana de crescimento.

Repita a troca do meio a cada semana. Consulte o protocolo descrito no texto para métodos de expansão clonal. Verifique o sobrenadante das trocas de meio quanto à produção de IgG utilizando um ensaio imunoenzimático ou ELISA.

Primeiro, prepare as placas ELIZA para dispensar em cada poço 50 microlitros de anticorpos de cabra anti-humano FC, diluídos um para 200 em tampão de revestimento. Após a incubação e lavagem da placa, bloquee os poços com 100 microlitros de tampão bloqueador por poço e incube a placa novamente. Após a incubação de bloqueio, remova o líquido da placa sobre uma toalha de papel.

Com a placa preparada, dilua os sobrenadantes com quatro volumes de RPMI. Em seguida, para controles padrão, faça uma diluição seriada de solução de IgG humana em RPMI, de 1000 nanogramas por mililitro a 15,6 nanogramas por mililitro.

Inclua também uma amostra em branco. Aplique 50 microlitros do sobrenadante ou do padrão em cada poço e incube a placa de ELIZA por uma hora a 37 graus Celsius da mesma maneira; placas adicionais de Eliza S podem ser montadas para analisar diluições adicionais dos sobrenadantes a fim de testar a afinidade do anticorpo. Após a incubação, lave a placa.

Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de incubação com fab dois conjugado à peroxidase a cada poço. Após mais uma hora de incubação e outra lavagem, adicione 100 microlitros de solução de substrato com TMB a cada poço. Incube então a placa por até 10 minutos, até que a coloração azul que aparecer se estabilize.

Em seguida, interrompa a reação e meça a absorção. Quaisquer sobrenadantes de clones com absorbância medida acima de três desvios padrão do branco são considerados positivos.

Para anticorpos IgG humanos, a especificidade antigênica pode ser detectada por ensaios adicionais. Para começar, siga o protocolo descrito para sintetizar DNA complementar a partir dos clones positivos. Em seguida, monte reações de PCR para as cadeias pesada, kappa e lambda da IgG.

Nos resultados, localize a cadeia pesada entre 400 e 550 pares de bases. Localize a cadeia leve entre 300 e 400 pares de bases. Se elas não estiverem presentes, utilize um microlitro dos produtos como molde para outra PCR.

Os novos produtos devem estar na faixa apropriada. Em seguida, prossiga com a clonagem dos melhores produtos. Primeiro, sequencie-os. Seus eletroferogramas devem ser limpos e corresponder a uma única sequência de imunoglobina.

Após o protocolo descrito no texto. Clone o produto de PCR purificado em um micrograma de DNA plasmidial. Certifique-se de realizar a ligação durante a noite a 16 graus Celsius.

Usando a enzima DNA ligase T4, prepare a célula HX em DMEM suplementado e cultive-as até atingirem 75% de confluência em frascos de cultura de 75 centímetros quadrados. Para cada transfeção de cadeia pesada e leve, prepare uma mistura com 1,75 mililitros de DMEM sem soro, contendo 4,5 microgramas do vetor da cadeia pesada, 3 microgramas do vetor da cadeia leve e 50 microlitros de solução de polietileno. Adicione suavemente esta mistura a uma placa de células HX e agite suavemente a solução sobre a placa.

Incube a placa durante a noite e, em seguida, comece a coletar o meio de cultura diariamente, substituindo-o por meio sem soro. O meio contém os anticorpos e pode ser coletado diariamente por quatro dias após a triagem de pBMCs positivos para CD22 e IgG ter sido realizada por citometria de fluxo.

A área das células duplo positivas, linfócitos B produtores de anticorpos IgG, foi coletada separadamente para expansão. Cerca de 1% dos pbmc estavam nessa população duplo positiva. Após cinco semanas de imortalização por EBV e estímulos com CPG 2006, clones imortalizados foram isolados.

As células alimentadoras WI 30 têm um formato fibroblasto mais alongado, e os clones de células B aparecem como células redondas muito pequenas crescendo agrupadas no centro da placa multiwell de fundo redondo. O sobrenadante dos clones em crescimento foi testado utilizando um ELIZA para IgG. Um clone positivo foi avaliado em um com um eli, valor três desvios padrão acima do valor do branco.

Pelo menos três sobrenadantes de um clone positivo testaram positivo no ELISA. Os anticorpos de um clone positivo foram sequenciados após a clonagem das regiões variáveis e constantes do par de cadeias pesada e lambda da imunoglobulina, podendo-se caracterizar as cadeias pesada e leve. Após este procedimento.

Outros métodos, como o sequenciamento, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como uso de anticorpos, uso gênico, diversidade genética, entre outras. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de autoimunidade explorarem doenças, patologias e estratégias terapêuticas relevantes para doenças autoimunes, como a miastenia grave. As implicações dessa técnica estendem-se para o diagnóstico e tratamento de doenças como a miastenia grave, pois a descoberta de anticorpos patogênicos pode levar ao desenvolvimento de novos tratamentos, como anticorpos competidores, que não possuem atividade inflamatória.