Name: Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a gerar IgG humana recombinante a partir de células B imortalizadas por vírus Epstein-Barr. Este método preserva o pareamento original das cadeias pesada e leve para estudos de autoanticorpos patogênicos.

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Contrato de investigação Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) a (GN-G.). Fellowship da Organização Holandesa para Pesquisa &quot;Graduate School of Translational Programa de Neurociência&quot; Scientific (022005019) para (CH). Concessões do Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) ea Association Française contre les Myopathies para (PM-M.); bem como por um Veni Fellowship da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (916.10.148) uma bolsa da Fundação Cérebro dos Países Baixos (FS2008 (1) -28) eo Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) (a ML ). Agradecemos Jozien Jaspers por sua ajuda na triagem de células B por citometria de fluxo.

<ol><li>Vrolix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+of+thymic+B+cells+from+early-onset+myasthenia+gravis+patients+with+antibodies+against+the+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor.</a> J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).</li>
<li>Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+generation+of+human+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the generation of human monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).</li>
<li>Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+identification+of+autoantibodies+specific+to+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases+in+high+throughput+operation%3A+Proposal+of+reliable+and+feasible+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies.</a> Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).</li>
<li>Losen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+myasthenia+gravis+by+preventing+acetylcholine+receptor+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+making+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">A novel method for making human monoclonal antibodies.</a> J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+induced+clonal+expansion+in+immortalized+B+cells+from+the+peripheral+blood+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients.</a> J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+individual+immune+responses+elicited+by+in+vitro+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Different individual immune responses elicited by in vitro immunization.</a> Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cell+immortalization+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B cell immortalization for monoclonal antibody production.</a> Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monoclonal+antibodies+by+immortalization+of+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+B+cells%3A+analysis+of+B+cell+repertoire+and+production+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies.</a> Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth.+Curr+Protoc+Immunol+%2F+edited+by%5BTitle%5D)+AND+%22John+E.+Coligan+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by.</a> John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Ibrahim, S. F., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and cell sorting.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).</li>
<li>Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+feeder+cells+on+the+X-ray+sensitivity+of+human+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells.</a> Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).</li>
<li>Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+virus+growth-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> J Vis Exp. (57), 3321(2011).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+in+automated+DNA+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.</a> Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste texto, todos os passos para a geração de anticorpos IgG a partir de PBMC humanas são apresentados em detalhe. Este protocolo inclui algumas vantagens em relação às técnicas anteriormente publicados. Uma das vantagens é que o anticorpo produzido mantém as cadeias pesada e leve correspondentes ao par original no clone de células B. A identificação de anticorpos IgG pode ser feito em qualquer tipo de dador humano, e não há necessidade de exacerbação da resposta imunitária devido à vacinação 5. A utilização...

O objetivo deste artigo é descrever em detalhe uma metodologia para gerar e caracterizar anticorpos monoclonais IgG humanas obtidas a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC). O interesse em estudar anticorpos humanos tem crescido em muitos campos diferentes de pesquisa. Em particular, muitos grupos de pesquisa estão interessados ​​na patologia causada por auto-anticorpos 1-3. Clonámos e caracterizado auto-anticorpos patogénicos 1. O estudo de auto-anticorpos podem ajudar a identificar as suas metas e desenvolver estratégias terapêuticas, por exemplo, utilizando anticorpos concorrente 4. Além disso, o estudo de anticorpos humanos podem também ser de interesse em outras áreas de pesquisa, ou seja, para avaliar a resposta imune após a vacinação 5, para caracterizar o perfil de anticorpos de indivíduos que foram expostos e se tornaram resistentes a patógenos específicos 6 ou para estudar quais Os anticorpos são emo repertório singular 7,12. Diversas técnicas têm sido desenvolvidas para gerar anticorpos monoclonais humanos recombinantes 8-12; A maioria destes usar exibição em fagos e imortalização de células B. O uso de exibição em fagos tem sido amplamente aplicada para a descoberta de novos anticorpos 13. No entanto, tem um grande inconveniente, isto é, que os pares de cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana estão dissociados no processo. A produção de hibridomas com células B humanas ou transformação EBV supera esta desvantagem. Usamos a infecção das células B timo com EBV em associação com a estimulação das células B policlonais através do receptor Toll-like? 9 (TLR-9) 6,12. Neste artigo, descreve detalhadamente a tecnologia que nós usamos para o desenvolvimento de anticorpos humanos IgG, com uma visão completa de todos os passos do PBMC isolamento para a geração de anticorpos em vitro. Esteprotocolo pode ser utilizado para a análise de qualquer tipo de perfil de IgG humana. No nosso laboratório, as células B produtoras de anticorpos de IgG têm sido separados com sucesso a partir do resto de PBMC após separação. Cinquenta células B ordenadas 8 podem então ser plaqueadas em placas multi-poços e imortalizadas por EBV e TLR-9 activação, para a expansão clonal de células B individuais. Como células de alimentação, os fibroblastos a partir de tecido de pulmão embrionário humano têm sido utilizados, linha de células WI38, o que facilita a visualização das células B imortalizadas. A partir destas células B, as sequências das cadeias pesada e leve da imunoglobulina pode ser obtido por PCR, e os genes dos anticorpos de imunoglobulina G clonado em vectores de expressão e produzido in vitro. Usando esta técnica, os anticorpos individuais com exactamente a mesma sequência de anticorpo encontradas no dador pode ser estudada.

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>Solução Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>contendo polissacarose e diatrizoato de sódio</td></tr><tr><td>FACSAria II classificador de células&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 placas de micro poço de fundo em U&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Instituto Memorial Avançado de Roswell Park (RPMI) 1640 médio&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>30% v/v sobrenadante contendo EBV da linha celular B95-8&nbsp; &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3.4 x 108 cópias/ml</td></tr><tr><td>CpG2006&nbsp;</td><td>Células Wi38 ODN</td><td>7909</td><td></td>da Invivogen</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina-2</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>10799068001</tr><tr><td>placas ELISA</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fc&gamma; Fragmento Específico (não conjugado)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>4% de leite em pó desnatado (Bloqueador de Grau Blotting)&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>IgG Humano&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>Imunoglobulina purificada por IgG HUMANA, 5,6 mg/ml</td></tr><tr><td>Cabra F(ab)2 IgG anti-humana Fc&gamma; (conjugado com peroxidase (PO))</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>Leitor ELISA (Perkin Elmer 2030)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>IgM Anti-Humano AffiniPure Rabbit conjugado com peroxidase, Fc5&micro; &nbsp; </td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Síntese Direta de cDNA de Células SuperScript III&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700</td><td>Kit</td> de Isolamento de RNA de Alta Pureza da Applied Biosystems<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Kit</td> de sistema de transcrição reversa <td>Roche 11828665001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polimerase Taq Recombinante</td><td>TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>Primers (2 &mu; l)</td> <td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td><td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit de purificação</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 kit de sequenciamento de ciclo&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>placa de reação de 0,1 ml (MicroAMP Optical 96-well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Analisador genético ABI300&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>células competentes DH5&alpha; (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3.875 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3.883 bp)&nbsp;</td><td>Meio SOC Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Meio de ágar à base de LB suplementado com Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>Meio líquido à base de Terrific Broth (TB) suplementado com Zeocin (Fast-Media Zeo TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA Miniprep kit&nbsp;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (Espectrofotômetro ND1000)</td><td>Meio</td> de ágar à base de Nanodrop <td></td><td></td></tr><tr><td>LB suplementado com Blasticidina (Ágar Fast-Media Blast Agar)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>Meio líquido à base de Caldo Fantástico (TB) suplementado com Blasticidina (Fast-Media Blast TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>20.000 U/ml, em 10x NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10.000 U/ml, em 10x NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3200S</td><td>0.1-10.0 kb, 1.000 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10,000 U/ml, em 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP Fosfatase Alcalina Termossensível</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 U/&micro; l, em 10x FastAP Buffer</td></tr><tr><td>DH5&alpha; células competentes&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human IgG</td><td>BD Pharmingen</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22</td><td>Fisher scientific</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de igg humana recombinante de anticorpos monoclonais as células seleccionadas a partir de b imortalizadas

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Encontrar novos métodos para gerar anticorpos monoclonais humanos é um campo de pesquisa ativo que é importante para as ciências básicas e aplicadas, incluindo o desenvolvimento de imunoterápicos. No entanto, as técnicas para identificar e produzir tais anticorpos tendem a ser árduas e, às vezes, o par de cadeias pesada e leve dos anticorpos é dissociado. Aqui, descrevemos um protocolo relativamente simples e direto para produzir anticorpos monoclonais recombinantes humanos a partir de células mononucleares do sangue periférico humano usando a imortalização com o vírus Epstein-Barr (EBV) e a ativação do receptor Toll-like 9. Com uma coloração adequada, as células B produtoras de anticorpos podem ser isoladas para posterior imortalização e expansão clonal. Os transcritos de anticorpos produzidos pelos clones de células B imortalizados podem ser amplificados por PCR, sequenciados como pares de cadeias pesadas e leves correspondentes e clonados em vetores de expressão de imunoglobulinas. Os anticorpos obtidos com esta técnica podem ser ferramentas poderosas para estudar respostas imunes humanas relevantes, incluindo autoimunidade, e criar a base para novas terapêuticas.

O gate de triagem após coloração das células positivas de CD22 e IgG é mostrado na Figura 1 Nesta imagem da área das células duplamente positivas -. Células B produtoras de anticorpos IgG - é seleccionado para classificar todas essas células em um tubo separado. Na análise, cerca de 1% do total de PBMC correspondem a esta população positiva dupla. O número de células classificadas obtidos dependerá do número de células obtidas na secção 1. Os diferentes resultados após 5 sem...

A síntese de anticorpos monoclonais humanos é o primeiro passo em estudos destinados a desvendar os mecanismos fisiopatológicos das respostas imunes mediadas por auto-anticorpos. Desenvolvemos um protocolo para gerar anticorpos monoclonais de imunoglobulina G humana (IgG) recombinantes a partir de células B classificadas no sangue, incluindo isolamento de células B, clonagem de anticorpos e síntese in vitro.

Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

O objetivo geral deste procedimento é clonar e expressar anticorpos produzidos por linfócitos B. Isso é realizado primeiramente isolando linfócitos B a partir de um tecido-fonte relevante, como sangue ou timo. O segundo passo consiste em realizar triagem e selecionar a população de linfócitos B positiva para a produção de IgG.Em seguida, as células são imortalizadas por infecção com o vírus Epstein-Barr juntamente com a ativação do receptor tipo toll 9 por C-P-G-O-D-N 2006 e mantidas em cultura. Os passos finais consistem em isolar RNA de clones que testaram positivo para produção de IgG por Eliza e gerar DNA complementar das cadeias leve e pesada da IgG. Por fim, as sequências de IgG podem ser clonadas em vetores de expressão mamíferos para produzir grandes quantidades de IgG humana monoclonal.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a tecnologia de exibição em fagos, é que o emparelhamento original das cadeias pesada e leve da IgG não é perdido. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da autoimunidade, como a descoberta e a caracterização funcional de autoanticorpos patogênicos. Não se esqueça de que trabalhar com material de paci

generation-recombinant-human-igg-monoclonal-antibodies-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A alta taxa de transferência de plataforma, desenvolvimento, fabricação automatizada de células da linha para a produção de proteínas terapêuticas é descrito. Implementação de BD Sorter celular FACS Aria, CloneSelect Imager e TECAN Freedom EVO sistema de manipulação de líquidos tem demonstrado capacidade de processamento aumentou significativamente no desenvolvimento de linhagem de células com melhor qualidade de células de linha e alta reprodutibilidade.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

Este vídeo demonstra um método de geração de anticorpos a partir de células de mamíferos através da introdução de vetores plasmidiais com genes de cadeia pesada e leve. Esses vetores interagem com a polietilenimina e entram nas células formando poliplexos; Posteriormente, eles são traduzidos em proteínas individuais e montados em anticorpos completos, que são secretados no meio extracelular.

Geração de anticorpos monoclonais recombinantes a partir de culturas de células de mamíferos

O vídeo demonstra uma técnica para gerar anticorpos monoclonais a partir de células B específicas do antígeno. Vetores de expressão eucarióticos que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos, clonados a partir de células B específicas de antígenos isolados, são introduzidos em células de mamíferos usando poliplexos. Uma vez dentro das células, esses vetores sofrem tradução, e os peptídeos de cadeia pesada e leve resultantes se reúnem em anticorpos, que são posteriormente secretados...

Uma técnica para gerar anticorpos monoclonais a partir de células B específicas do antígeno

Um protocolo otimizado é apresentado para a geração de anticorpos monoclonais baseados na tecnologia de hibridoma. Os camundongos foram imunizados com um imunoconjugado. As células do baço foram fundidas por PEG e um impulso elétrico com células de mieloma imortal. As células de hibridoma produtoras de anticorpos foram selecionadas por HAT e triagem ELISA antígeno-específica.

Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

O método de BSelex para identificar e recuperar anticorpos antígeno-específicos individuais das pilhas mononucleares do sangue periférico humano combina a citometria do fluxo com o único PCR da pilha e a clonagem.

Método de triagem de célula única para a seleção e recuperação de anticorpos com especificidades desejadas de populações de células B de memória humana enriquecida

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Um sistema eficiente de estrutura e análise da função de um gene em...

Produção recombinante Retroviral e infecção de células B

Camundongos C57BL / 6 foram usados ​​para estudar a patogênese Hc e fornecer o melhor modelo. Estamos explorando os benefícios potenciais da imunidade humoral contra este fungo e gerou várias mAbs [a histona H2B e um calor 60kDa proteína de choque] que testamos para sua eficácia protectora após a administração intraperitoneal.

Administração passiva de anticorpos monoclonais contra H. capsulatum E outros patógenos fúngicos

Aprenda a gerar IgG humana recombinante a partir de células B imortalizadas por vírus Epstein-Barr. Este método preserva o pareamento original das cadeias pesada e leve para estudos de autoanticorpos patogênicos.

Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

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