Encapsulation alginato de pluripotentes células estaminais utilizando um bocal Co-axial

O objetivo geral deste procedimento é incorporar células-tronco em cápsulas de alginato e hidrogel com segurança e eficácia, e cultivá-las dentro das cápsulas para controlar a agregação e o microambiente, isso é feito misturando primeiro uma suspensão de células-tronco filtradas e uma solução de alginato de sódio. A mistura é então transferida para uma seringa e um bico coaxial é instalado na seringa antes de colocá-los em uma bomba de seringa. Em seguida, as gotículas são preparadas expelindo a suspensão celular com gás nitrogênio co-fluindo, seguido de coleta e solução de cloreto de cálcio.

As cápsulas são então tratadas com poli L lisina para evitar vazamento celular e EDTA para fluidizar as cápsulas internas antes de cultivar as células encapsuladas em uma condição de agitação rotativa. Finalmente, as células são coletadas das cápsulas por EDTA e destruição física da membrana. Em última análise, o encapsulamento de alginato de células-tronco pluripotentes evita que as células se agreguem excessivamente e limita o estresse absoluto experimentado pelas células em cultura de suspensão.

Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo biológico e biomédico, como grande expansão do transplante de células e pesquisa no nicho de células-tronco. Iniciar o encapsulamento celular recolhendo as células conforme descrito no protocolo de texto após centrifugação a 160 vezes G durante três minutos. Lave o estaminado pluripotente induzido ou a pelota da pilha IPS por Resus, suspendendo nos heaps a solução salina tamponada e centrifugando três vezes após o resus, suspendendo as pilhas e os heaps salino tamponado.

Filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de 40 mícrons para remover agregados grandes, que poderiam entupir o bico. Em seguida, misture dois mililitros de suspensão de células filtradas e três mililitros de solução de alginato de sódio a 5%. Para obter uma suspensão celular de cinco mililitros em 3% de densidade celular de alginato de sódio é DIR mais de 1 milhão de células por mililitro.

Depois de coletar a suspensão celular em uma seringa de cinco mililitros, instale um bico coaxial na seringa e coloque-os em uma bomba de seringa, emita o fluxo de gás nitrogênio através da agulha externa do bico coaxial e expulse a suspensão celular através do bico interno. Colete gotículas em 250 mililitros de solução de cloreto de cálcio a 0,5% e aguarde de 10 a 20 minutos para dação, mexendo a 60 a 90 RPM. Após a lavagem com solução salina tamponada com pilhas, as cápsulas coletadas são utilizadas como cápsulas nuas para tratar as cápsulas incubadas cápsulas de alginato de cálcio em 0,05% de peso por volume.

Solução de poli L lisina por cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com agitação. Depois de coletar as cápsulas em um tubo e lavar com solução salina tamponada com heaps, incube-as em DMEM contendo 10% de FBS. Para neutralizar a carga elétrica em sua superfície, utilize as cápsulas resultantes como cápsulas revestidas para gerar cápsulas ocas.

Incubar as cápsulas em solução salina tamponada contendo 10 milimolares de EDTA durante cinco minutos. As cápsulas tratadas com EDTA são utilizadas como cápsulas ocas. Incubar as células encapsuladas a 75 RPM com agitação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 10 dias após a incubação, coletar e incubar as cápsulas em EDTA 10 milimolar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 10 minutos.

Coletar as células das cápsulas de alginato sem tratamento com poli l licina por centrifugação a 1000 vezes G por três minutos. Se as cápsulas de alginato forem tratadas com poli L lisina, quebre a membrana de alginato de poli L lisina pipetando para cima e para baixo cerca de 10 vezes com uma agulha presa a uma seringa. O diâmetro da agulha deve ser menor que o tamanho da cápsula, e agulhas de calibre 25 são usadas neste experimento.

Após centrifugação a 1000 a 5.000 vezes G por cinco minutos, colete o pellet celular estritamente das membranas de alginato poli L licina quebradas Se amostras de mRNA forem coletadas das células, observe que as membranas de alginato poli L licina restantes podem impedir a purificação do mRNA, conforme visualizado por uma câmera de alta velocidade. A solução de alginato expelida forma esférica imediatamente após a expulsão. Se a suspensão for expelida com um caudal de azoto inferior a um litro por minuto, o tamanho das gotículas é uniforme.

No entanto, se o fluxo de nitrogênio for superior a um litro por minuto, a gota se decompõe e o tamanho das gotículas se torna heterogêneo. Diante disso, é difícil preparar gotículas menores que 500 mícrons usando esse método. No processo de gelificação, as gotículas de alginato de sódio formam cápsulas de alginato de cálcio de formato esférico em solução de cloreto de cálcio.

Se a concentração de alginato de sódio for alta o suficiente, no entanto, a baixa concentração de alginato de sódio causa a forma nons, esférica e nonoo das cápsulas, que têm um problema no processo de codificação. Mesmo que a concentração de alginato de sódio não seja suficiente, cápsulas esféricas podem ser formadas aumentando a concentração de cálcio. No entanto, cerca de 50 milimolares de cloreto de cálcio são apropriados para encapsulamento porque uma concentração muito alta de cloreto de cálcio diminui o crescimento e a viabilidade celular.

As células encapsuladas podem crescer nas cápsulas, mas o vazamento celular pode ocorrer em cápsulas sem o revestimento de alginato poli L lisina. No caso das células IPS de camundongo, as células formam agregados em forma de disco em cada cápsula de alginato de cálcio, enquanto as células se aglomeram e formam agregados esféricos únicos em cada cápsula oca. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como encapsular e cultivar células no controle de tamanho.

Capturas de hidrogênio sem nenhum equipamento especial, sem absorvente orgânico.