Name: Encapsulation alginato de pluripotentes células estaminais utilizando um bocal Co-axial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a encapsular células-tronco pluripotentes em hidrogéis de alginato utilizando um bocal co-axial. Este método reduz o estresse de cisalhamento e a agregação celular, facilitando a produção em massa e pesquisas sobre nichos de células-tronco.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo projeto S-Innovation da Agência Japonesa de Ciência e Tecnologia (JST), pelo Programa de Pós-Graduação para Líderes em Inovação da Vida (GPLLI) da Universidade de Tóquio e pela Bolsa de Pesquisa para Jovens Cientistas da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência. Agradecemos à nac Image Technology Inc. por gravar filmes usando uma câmera de alta velocidade.

1. Materiais Preparando <ol><li> Preparar tampão HEPES 10 mM. Ajustar o pH para 7,0 à TA e adicionar NaCl a 0,9%. </li><li> Preparar a solução de alginato e 5% de solução de EDTA a 10 mM através da mistura de solução salina tamponada com HEPES preparado em 1.1. Ajustar o pH para 7,0 à temperatura ambiente. </li><li> Autoclave os reagentes (1.1, 1.2) durante 20 min a 121 ° C. </li><li> Preparar 60 milímetros pratos revestidos com gelatina em camadas com 1,2-2,0 x 10 6 de fibroblastos de rato embrionário (MEF) células, as quais são tratadas como células de alimentação por incubação dentro de DMEM contendo 10% de FBS ES-qualificados e 10 ug / ml de mitomicina C para 90 - 120 min. </li><li> Manter rato induzida estaminais pluripotentes (IPS) sobre o prato de células com as células de alimentação na presença de 5 ml de DMEM de alto teor de glucose contendo 20% de FBS ES-qualificado, 50 uM de 2-mercaptoetanol, aminoácidos não-essenciais, e antibióticos ( 100 unidades / ml de penicilina G sódio, 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina, e 250 ng / ml de amphotericin B). </li><li> Semente 4 × 10 5 células iPS sobre uma placa de 60 mm revestidas com gelatina e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. Alterar o meio de cultura todos os dias durante a incubação. Após 3-4 dias de cultura, as células trypsinize durante 1 min com 500 ul de tripsina a 0,05% contendo EDTA a 0,02% a 37 ° C e 5% de CO 2. Depois disso, retire as células tocando no prato de cultura dez vezes. </li><li> Adicionar 2,5 ml de DMEM com 10% de FBS e antibióticos ES-qualificado (seguindo as células iPS dissociação do rato em células individuais por pipetagem com 1.000 mL micropipeta, três vezes) suspensão de células centrifugar a 160 × g por 3 min e remover o sobrenadante e contar as células . Seguindo a contagem das células, propagar novamente as células recolhidas num prato revestido com gelatina e incubar durante 30 min para isolar as células iPS a partir das células MEF. Após a contagem das células (geralmente 1-3 × 10 6 células / prato pode ser coletado), reseed 4 × 10 5 células iPS emo prato. </li></ol> 2. celular encapsulação em cápsulas de Hidrogel de Alginato <ol><li> Recolher as células por o mesmo procedimento descrito em 1.5 e 1.6. Após a centrifugação a 160 x g durante 3 minutos, lava-se a pelete de células iPS com solução salina tamponada com HEPES três vezes. Depois de re-suspender as células em solução salina tamponada com HEPES, filtrar a suspensão de células através de um filtro de 40 um da célula, a fim de remover grandes agregados, o que poderia de outro modo entupir o bocal. </li><li> Misturar 2 ml de suspensão de células numa solução salina tamponada com HEPES e 3 ml de solução a 5% Alg-Na. Finalmente 5 ml de suspensão de células numa solução de 3% Alg-Na é obtido. A densidade celular é desejavelmente superior a 10 6 células / ml. </li><li> Depois de recolher a suspensão de células para uma seringa de 5 ml, instalar um bocal co-axial (Figura 1A, B) na seringa e colocá-las sobre a bomba de seringa. Emit N2 fluxo de gás (inferior a 1 L / min) através da agulha exterior do bico de co-axial eexpelir a suspensão de células através do bocal interno. </li><li> Recolhe gotas em 250 ml de 0,5% de solução de CaCl2 e esperar 10-20 min para a gelificação enquanto se agitava a 60-90 rpm. </li></ol> 3. Tratamento de cápsulas de alginato (opcional) <ol><li> Incubar cápsulas Alg-Ca em 0,05% de poli-L-lisina (PLL) solução durante 5 min a 37 ° C e 5% (w / v) de CO 2. </li><li> Após lavagem das cápsulas com solução salina tamponada com HEPES, incubar em DMEM contendo FBS a 10% a fim de neutralizar a carga eléctrica na sua superfície. Utilizá-los na forma de cápsulas revestidas (Figura 1C). </li><li> Incubam-se as cápsulas em solução salina tamponada com HEPES contendo 10 mM de EDTA durante 5 minutos. As cápsulas tratado com EDTA são utilizados na forma de cápsulas ocas (Figura 1C). </li></ol> 4. Cultura e coletar células em alginato Cápsulas <ol><li> Incubar as células encapsuladas a 75 rpm com agitação a 37 ° C e 5% de CO 2durante 10 dias. </li><li> Recolha e incubar as cápsulas em EDTA 10 mM a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 10 min. Recolher as células a partir das cápsulas de alginato PLL sem tratamento por centrifugação a 1000 × g durante 3 min. </li><li> Se as cápsulas de alginato são tratadas com PLL, romper a membrana Alg-PLL, pipetando para cima e para baixo em torno de dez vezes com uma agulha ligada a uma seringa e centrifuga-se que em 1000 - 5000 × g durante 5 min. Diâmetro da agulha deve ser menor do que o tamanho da cápsula e 25 g (260 ^ m) de agulhas são utilizadas nesta experiência (600 um) </li><li> Após a centrifugação, coletar sedimento celular estritamente a partir de membranas Alg-PDD quebrados se você quiser coletar amostras de mRNA a partir de células. Restantes membranas Alg-PLL possivelmente prevenir a purificação de ARNm. </li></ol>

<ol><li>Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+production+of+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large scale production of stem cells and their derivatives.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).</li>
<li>Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+microcarrier+properties+affecting+the+expansion+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+Res%22%5BJournal%5D)">Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).</li>
<li>Schroeder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+lineage+selection+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+stirred+bench+scale+bioreactor+with+automated+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control.</a> Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).</li>
<li>Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agitation+can+induce+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+microcarrier+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%22%5BJournal%5D)">Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures.</a> Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).</li>
<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+for+testing+controlled+%C3%9F-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments.</a> Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+morphology%2C+and+pluripotency+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+in+three+different+types+of+alginate+beads+for+mass+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production.</a> Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).</li>
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<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
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<li>Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+Preparation+of+Monodispersed+Calcium+Alginate+Microbeads+in+a+Novel+Microfluidic+System%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Technol%22%5BJournal%5D)">Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System.</a> Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).</li>
<li>Sakai, M. P., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Bioactive+Hydrogel+Capsules+for+The+3D+Expansion+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors.</a> Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+effects+of+secreted+soluble+factor+preserve+better+pluripotent+state+of+embry-+onic+stem+cell+culture+in+a+membrane-based+compartmentalized+micro-bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor.</a> Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+alternative+fate+other+than+default+neuronal+fate+of+embryonic+stem+cells+in+a+membrane-based+two-chambered+micro-+bioreactor+by+cell-secreted+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

<html> A encapsulação pode ser cultura em comparação com as culturas em suspensão directos. Cultura em suspensão é um método mais simples para obter grandes quantidades de células estaminais pluripotentes que os métodos de encapsulamento. No entanto, controlando a agregação de células numa cultura em suspensão é ainda difícil. No método de encapsulamento, agregação celular é limitado em cápsulas e podem, portanto, ser bem controlada. A publicação anterior mostrou que células encapsuladas formado agregados de tamanho unif...

As células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS) são atualmente fonte de intensa pesquisa devido ao seu papel na medicina regenerativa. No entanto, grandes quantidades de células são necessárias para a regeneração dos tecidos. Por exemplo, aproximadamente um bilhão de células pancreáticas necessárias para um paciente diabético tipo 11. No entanto, a cultura convencional de pratos só é capaz de obter 1 × 105 células/cm2, exigindo assim 1m2 de área de cultura para obter células pancreáticas derivadas de células-tronco suficientes para tratar um paciente diabético tipo 1. O desenvolvimento de um sistema para a cultura em massa de células-tronco pluripotentes, como microcarreador2 e cultura em suspensão, é, portanto, necessário para a medicina regenerativa. A cultura em suspensão representa um método promissor de cultura em massa, mas controlar a agregação de células é um desafio em culturas em suspensão direta de células iPS humanas3. De fato, as células suspensas são expostas à tensão de cisalhamento, o que causa dano celular3 ou diferenciação4.
A pesquisa em encapsulamento à base de hidrogel foi conduzida para resolver problemas associados à cultura em suspensão. Nas cápsulas de hidrogel, as células são protegidas do fluxo do meio. Relatórios anteriores documentaram o uso de vários tipos de hidrogel, incluindo agarose5, PEG6 e alginato (Alg), para encapsulamento celular. O hidrogel de Alg-Ca é um dos hidrogéis mais úteis para o encapsulamento celular porque o hidrogel de Alg-Ca é formado imediatamente após a queda da solução de alginato em uma solução de CaCl2 e também é prontamente digerido por enzimas ou reagentes quelantes. 
Aqui, estabelecemos um processo de encapsulamento de alginato estável para células iPS usando um bico coaxial. Ao usar o fluxo de gás N2 para formar gotículas, é possível encapsular células em cápsulas uniformes sem a necessidade de outros reagentes, como óleo. Neste método, a taxa de fluxo de N2 e a concentração de CaCl2 e alginato são as principais condições operacionais que afetam o tamanho, a forma e a uniformidade das cápsulas. Este relatório demonstra a otimização dessas condições operacionais por meio do uso de uma câmera de alta velocidade e um microscópio.

<table><tbody><tr><td>Embrião de camundongo</td><td>fibroblasto Cell Biolabs</td><td>SNL 76/7</td><td></td></tr><tr><td>Célula-tronco pluripotente induzida</td><td>por camundongo RIKEN Bio resorce center</td><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td><td></td></tr><tr><td>DMEM de alta glicose</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>ES qualificado&nbsp; FBS</td><td>GIBCO</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos Antibacterianos</td><td>GIBCO</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácido Não Essencial</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>GIBCO</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Fator Inibidor de Leucemia ESGRO</td><td>Merck Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina / EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 26 G/16 G</td><td>Seringa Hoshiseido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml</td><td>TERUMO</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>Sódio&nbsp; Cloreto</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Alginato de Sódio</td><td>Wako</td><td>194-09955</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Wako</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina (MW = 15.000 - 30.000)</td><td>SIGMA</td><td>P7890</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>DOJINDO</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de silinge</td><td>COMO UM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>Câmera Hispeed</td><td>nac tecnologia de imagem</td><td>Memrecam HX-3</td><td></td></tr></tbody></table>

encapsulation alginato de pluripotentes células estaminais utilizando um bocal co-axial

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

As células-tronco pluripotentes (células PS) são o foco de intensa pesquisa devido ao seu papel na medicina regenerativa e na triagem de medicamentos. No entanto, o desenvolvimento de um sistema de cultura em massa seria necessário para o uso de células PS nessas aplicações. A cultura em suspensão é um método de cultura promissor para a produção em massa de células PS, embora algumas questões, como o controle da agregação e a limitação da tensão de cisalhamento do meio de cultura, ainda não tenham sido resolvidas. Para resolver esses problemas, desenvolvemos um método de encapsulamento de alginato de cálcio (Alg-Ca) usando um bico coaxial. Este método pode controlar o tamanho das cápsulas facilmente co-fluindo gás N2. O diâmetro da cápsula controlável deve ser maior que 500 μm, pois uma vazão muito alta de gás N2 causa a quebra de gotículas e, portanto, de cápsulas de tamanho heterogêneo. Além disso, uma baixa concentração de Alg-Na e CaCl2 causa cápsulas não esféricas. Embora uma cápsula de Alg-Ca sem revestimento de Alg-PLL se dissolva facilmente, permitindo a coleta de células, elas também podem vazar de cápsulas sem revestimento de Alg-PLL. De fato, um revestimento de alginato-PLL pode prevenir o vazamento celular, mas também é difícil de quebrar. Essa tecnologia pode ser usada para pesquisar o nicho de células-tronco, bem como a produção em massa de células PS, porque o encapsulamento pode modificar o microambiente ao redor das células, incluindo a matriz extracelular e a concentração de fatores secretados.

No protocolo de 2,5, a solução de alginato expelido forma uma forma esférica imediatamente após a expulsão (Figura 2A - H). Se a suspensão é expulso com uma taxa de fluxo de N2 inferior a 1 L / min, o tamanho das gotículas é uniforme (Figura 2I). No entanto, se o fluxo de N2 é superior a 1 L / min, a gotícula de quebra (Figura 2G, de setas brancas) e o tamanho das gotas se torna heterogéneo (Figura 2J). Sendo assim, é difícil prepa...

Estabelecemos um método de encapsulamento de células-tronco pluripotentes (células PS) em cápsulas de hidrogel de alginato usando um bico coaxial. Isso evita que as células se agreguem excessivamente e limita a tensão de cisalhamento experimentada pelas células em cultura em suspensão. A técnica é aplicável à produção em massa de células PS, bem como à pesquisa de nicho de células-tronco.

Encapsulation alginato de pluripotentes células estaminais utilizando um bocal Co-axial

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

O objetivo geral deste procedimento é incorporar células-tronco em cápsulas de hidrogel de alginato de forma segura e eficaz, e cultivá-las dentro das cápsulas para controlar a agregação e o microambiente. Isso é realizado primeiramente misturando uma suspensão filtrada de células-tronco com uma solução de alginato de sódio. A mistura é então transferida para uma seringa, e um bico coaxial é instalado na seringa antes de posicioná-la em uma bomba de seringa. Em seguida, as gotas são preparadas expelindo a suspensão celular com fluxo de gás nitrogênio, seguido pela coleta e adição de solução de cloreto de cálcio.As cápsulas são então tratadas com poli-L-lisina para prevenir vazamento celular e com EDTA para fluidificar o interior das cápsulas antes do cultivo das células encapsuladas em condições de agitação rotativa. Por fim, as células são coletadas das cápsulas mediante EDTA e destruição física da membrana. Em última instância, o encapsulamento em alginato de células-tronco pluripotentes evita que as células se agreguem em excesso e limita o estresse de cisalhamento a que as células são submetidas em cultivo em suspensão.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áre

alginate-encapsulation-pluripotent-stem-cells-using-co-axial

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