Single-channel Análise e cálcio Criação de imagem do Podócitos do recentemente isolados glomérulos

O objetivo geral deste procedimento é medir as alterações na concentração intracelular de cálcio em resposta a agentes farmacológicos. Estimar os níveis basais de cálcio e avaliar a atividade individual dos canais nos podócitos como parte do glomérulo frescamente isolado. Isso é realizado primeiramente removendo o sangue dos rins de rato por meio de lavagem pela aorta abdominal.

Em seguida, os rins são coletados e o córtex renal é isolado e picado com uma lâmina de barbear. Na terceira etapa, os glomérulos corticais são isolados por centrifugação diferencial. Posteriormente, os glomérulos destampados isolados podem ser submetidos a experimentos eletrofisiológicos ou carregados com corantes fluorescentes e utilizados para medições confocais de concentração de cálcio.

No fim das contas, esses procedimentos permitem aos pesquisadores analisar alterações agudas no manuseio do cálcio intracelular em resposta à aplicação de diversos agentes e avaliar e manipular a condutância de cálcio ao nível de canais iônicos individuais. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que ela nos permite estudar os podócitos como parte do glomérulo isolado completo. Nossa preparação mantém o potencial funcional dos podócitos.

Eles permanecem aderidos aos capilares e participam da homeostase no ambiente que, na verdade, pode conservar as principais partes do aparelho de filtração glomerular. As implicações dessa técnica ampliam nossa triagem farmacológica. Em estados normais e patológicos, o mecanismo de manuseio de cálcio pelos podócitos exerce um papel regulador essencial no desenvolvimento e na prevenção de complicações renais em doenças como nefropatia diabética, esclerose segmentar focal ou hipertensão. É de grande importância observar a resposta do influxo de cálcio nessas células a fármacos, os quais podem ser facilmente triados.

Nesta preparação, VLA Hunka demonstrará como fazer a lavagem do rim para os procedimentos seguintes. Mostrarei o isolamento de glomérulos e a eletrofisiologia com clampeamento em V, e o Dr. GaN irá orientá-lo pelo imageamento confocal de cálcio. Para iniciar este procedimento, posicione uma rata anestesiada sobre a mesa cirúrgica com controle de temperatura. Sob o microscópio, faça uma incisão mediana no abdômen para expor a veia CVA e a aorta.

Em seguida, posicione a ligadura ao redor das artérias celíaca e mesentérica superior e da aorta abdominal acima delas. Realize a dissecação romba da aorta abdominal abaixo das artérias renais. Em seguida, coloque duas ligaduras ao redor dela, mas não realize a ligadura.

Prenda a aorta acima das ligaduras e amarre o fio inferior. Em seguida, canule a aorta com um tubo de polietileno conectado a uma bomba de seringa contendo PBS abaixo da prensa e fixe o cateter com uma segunda ligadura. Depois disso, remova a prensa e faça a ligadura.

Meias artérias mesentérica e celíaca. Infunda a aorta com PBS pré-resfriado durante três minutos a uma taxa de seis mililitros por minuto. Ao mesmo tempo, faça uma incisão na veia cava próxima às veias renais para aliviar a pressão.

Após três minutos, interrompa a perfusão, excise e encapsule os rins. Coloque-os em solução de PBS sobre gelo. Agora, prepare 30 mililitros de BSA a 5% fresca em meio RPMI 1640.

Usando uma lâmina de barbear e tesoura, isole o córtex de ambos os rins e, em seguida, homogeneíze-os até ficarem uniformes. Em seguida, force o tecido picado através de uma peneira de aço inoxidável de 100 malhas que tenha sido previamente embebida em solução 5%P-S-A-R-P-M-I. Colete o filtrado e deixe-o passar por uma peneira de 140 malhas.

Em seguida, filtre o efluente coletado da peneira de malha 140 utilizando uma peneira de malha 200 previamente hidratada. Descarte o filtrado e lave a peneira superior com 10 a 15 mililitros da solução B-S-A-R-P-M-I preparada, coletando os glomérulos da superfície da peneira. A seguir, coloque a solução B-S-A-R-P-M-I contendo G Glomérulos em um tubo de 15 mililitros, sobre gelo dois bon, e deixe os glomérulos sedimentarem no fundo do tubo por até 20 minutos.

Neste procedimento, recubra lâminas de vidro de cinco por cinco milímetros com polilisina de peso molecular entre 70.000 e 150.000 e seque-as em uma placa aquecida. Em seguida, aqueça as soluções experimentais até a temperatura ambiente e preencha a câmara de grampo de patch e a pipeta. Misture suavemente a solução contendo os glomérulos. Então, aplique aproximadamente 50 microlitros dessa solução em cada lâmina de vidro recoberta com polilisina.

Em seguida, transfira as lâminas de vidro com glomérulos para a câmara de grampo de patch. A câmara pré-preenchida com a solução Beth é perfundida a uma taxa de três mililitros por minuto durante um minuto para remover quaisquer glomérulos não aderidos antes de realizar o registro convencional de grampo de patch no modo de célula aderida.

Agora, coloque 500 microlitros da fração de glomérulos em cada tubo cônico de 0,5 mililitro e adicione os corantes de cálcio Pure Red AM e Fluoh 4:00 AM. Em seguida, coloque os tubos em um agitador rotativo por até uma hora à temperatura ambiente. Então, prepare as lamínulas de vidro com polilisina e deixe-as secar na placa aquecida a 70 graus Celsius. Assim que a carga dos corantes de cálcio for concluída, aplique 100 microlitros da solução contendo glomérulos sobre as lamínulas recobertas com polilisina e deixe-as aderirem à superfície por cerca de cinco minutos.

Em seguida, monte as lamínulas com glomérulos aderidos em uma câmara de imagem e perfuse com solução de banho a uma taxa de três mililitros por minuto para remover os glomérulos não aderidos e os corantes remanescentes. Posteriormente, configure o microscópio confocal de varredura a laser para um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros. Em seguida, ajuste o software de imagem para uma frequência e resolução desejadas.

Em seguida, localize os glomérulos em campo claro. Posteriormente, ative a detecção do sinal de fluorescência. Depois disso, selecione um plano focal desejado e verifique a intensidade da fluorescência nos canais flu oh four e firo red.

Certifique-se de que o glomérulo seja claramente visível em campo claro. Em seguida, registre as alterações na intensidade de fluorescência dos sinais flu oh four e furor red. Para importar a sequência de imagens, separe os canais e utilize o modo de escala de cinza hyper stack.

No software Image J, abra uma janela do gerenciador de ROI seguindo as ferramentas de análise, caminho Gerenciador de ROI. Selecione uma ou mais regiões de interesse usando a ferramenta de seleção oval e a função adicionar T no gerenciador de ROI. Em seguida, selecione a área no fundo e salve as ROI selecionadas.

Em seguida, marque a única linha por caixa de fatia na caixa de diálogo e clique em OK nas opções do menu Resultados. Defina as medições. Selecione o valor médio de cinza e calcule os valores de intensidade dos pixels para cada ROI, que serão exibidos na janela de resultados em colunas separadas.

Para cada ROI, copie os valores de intensidade medidos do ROI para cada canal no software de análise de dados preferido e subtraia os valores de intensidade de fundo de cada ponto de dados para cada ponto temporal. Calcule a razão entre as intensidades dos canais flu oh quatro e URA vermelho e, em seguida, plote as alterações ao longo do tempo do transitório de cálcio para cada ROI. Esta imagem mostra a pipeta do patch clamp ligada ao corpo oxidado na superfície do glomérulo de rato.

Durante uma gravação eletrofisiológica, parte de um glomérulo encapsulado pode ser vista no canto inferior direito da imagem. Abaixo há um traçado de corrente representativo da atividade de canais semelhantes a tripy, obtido por meio de um registro em configuração de célula ligada realizada em um podócito para medir a concentração intracelular de cálcio. Os glomérulos são carregados com flu oh 4:00 AM para marcar o cálcio intracelular.

Este vídeo ilustra os efeitos do CIN e do cloreto de manganês na entrada de cálcio nos glomérulos. Este gráfico quantifica as alterações na intensidade do sinal flu oh four registradas em um único podócito em resposta ao CIN e ao cloreto de manganês. Como esperado, o CIN produz o máximo de fluorescência e o cloreto de manganês quencha o corante, resultando na menor intensidade de fluorescência.

A aplicação dessas drogas permite ao pesquisador definir posteriormente a concentração exata de cálcio dentro da célula. Este vídeo demonstra o efeito de 10 micromoles de TP na concentração de cálcio nos glomérulos. Observe que há um aumento na fluorescência verde do flu O quatro e uma queda na fluorescência vermelha do fu vermelho, o que indica um aumento na concentração intracelular de cálcio.

Essa técnica oferece uma oportunidade única para monitorar alterações na entrada de cálcio ao nível de canais iônicos individuais e de células isoladas após tratamentos farmacológicos ou outras manipulações. Assim, essa abordagem representa uma ferramenta muito poderosa, considerando os diversos modelos de roedores geneticamente modificados disponíveis. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar medições de influxo de cálcio nos podócitos, bem como dos experimentos eletrofisiológ游戏副本

Essas técnicas fornecem uma compreensão aprofundada e mecanicista da regulação do manuseio de cálcio com podócitos em condições normais e patológicas.