Single-channel Análise e cálcio Criação de imagem do Podócitos do recentemente isolados glomérulos

O objetivo geral deste procedimento é medir as alterações na concentração intracelular de cálcio em resposta a agentes farmacológicos. Estimar os níveis basais de cálcio e avaliar a atividade do canal individual nos podócitos como parte de todo o glomérulo recém-isolado. Isso é feito primeiro limpando o sangue dos rins de ratos pela lavagem através da aorta abdominal.

Em seguida, os rins são colhidos e o córtex renal é isolado e picado com uma lâmina de barbear. Na terceira etapa, os glomérulos corticais são isolados por diferencial. Posteriormente, os glomérulos decapitados isolados podem ser submetidos a experimentos eletrofisiológicos ou carregados com corantes fluorescentes e levados para medições confocais de concentração de cálcio.

Em última análise, esses procedimentos permitem que os pesquisadores resolvam alterações agudas no manuseio de cálcio intracelular em resposta a aplicações de vários agentes e avaliem e manipulem a condutância de cálcio no nível de canais iônicos únicos. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que ela nos permite estudar os podócitos como parte de todo o glomérulo isolado. Nossa preparação mantém o potencial funcional dos podócitos.

Eles permanecem ligados aos capilares e participam da homeostase no ambiente que realmente pode conservar a maior parte do aparelho de filtração dos glomérulos. A implicação desta técnica estende nossa triagem farmacológica Em estados normais e patológicos, o mecanismo de manipulação do cálcio pelos podócitos desempenha um papel regulador essencial no desenvolvimento e prevenção de complicações renais em doenças como nefropatia diabética, esclerose do omero do segmento focal ou hipertensão. É de grande importância observar a capacidade de resposta do influxo de cálcio nessas células aos medicamentos, que podem ser facilmente rastreados.

Nesta preparação, o VLA Hunka demonstrará como lavar o rim para os seguintes procedimentos. Mostrarei o isolamento dos glomérulos e a eletrofisiologia do grampo V, e o Dr.GaN o guiará através da imagem confocal de cálcio. Para iniciar este procedimento, coloque um rato anestesiado na mesa cirúrgica com temperatura controlada Sob o microscópio, faça uma incisão na linha média do abdômen para descobrir o AVC da veia e a aorta.

Em seguida, insira a ligadura ao redor das artérias celíaca e mesentérica superior e a aorta abdominal acima delas. Sem corte, disseque a aorta abdominal abaixo das artérias renais. Em seguida, coloque duas ligaduras ao redor dele, mas não ligue.

Prenda a aorta acima das ligaduras e amarre o fio inferior. Em seguida, cateterize a aorta com um tubo de polietileno que é conectado a uma bomba de seringa cheia de PBS abaixo da pinça e fixe o cateter com uma segunda ligadura. Em seguida, remova o grampo e ligue-os.

Me artérias entéricas e celíacas. Infundir a aorta com PBS pré-resfriado por três minutos a uma taxa de seis mililitros por minuto. Ao mesmo tempo, faça uma incisão na veia da cava perto das veias renais para aliviar a pressão.

Após três minutos, pare a perfusão, excise e encapsule os rins. Coloque-os em solução PBS no gelo. Agora prepare 30 mililitros de 5% BSA fresco em meio RPMI 1640.

Usando uma lâmina de barbear e uma tesoura, isole o córtex de ambos os rins e, em seguida, faça o MIT até ficar homogêneo. Em seguida, empurre o tecido picado através de uma peneira de aço inoxidável de 100 mesh que foi pré-embebida em solução 5%P-S-A-R-P-M-I. Colete o fluxo e deixe-o passar por um siv de 140 mesh.

Em seguida, filtrar o fluxo coletado da peneira de 140 mesh usando um siv de 200 mesh pré-embebido. Rejeitar o filtrado e lavar o peneiro superior com 10 a 15 ml da solução preparada de B-S-A-R-P-M-I e recolher os glomérulos do topo do passador. Em seguida, coloque a solução B-S-A-R-P-M-I contendo G Glomérulos em um gelo de 15 mililitros e dois bon e deixe os glomérulos sedimentarem no fundo do tubo por até 20 minutos.

Neste procedimento, cubra lascas de vidro de cobertura de cinco por cinco milímetros com peso molecular, 70.000 a 150.000 polilisina e seque-as em uma placa aquecida. Em seguida, aqueça as soluções experimentais à temperatura ambiente e encha a câmara de grampo de remendo e pipeta Misture suavemente a solução contendo glomérulos. Em seguida, aplique aproximadamente 50 microlitros em cada chip de vidro de cobertura revestido de polilisina.

Depois disso, mova as lascas de vidro com glomérulos para a câmara do patch clamp. Pré-preenchido com a solução Beth. Perfunda a câmara a uma taxa de três mililitros por minuto por um minuto para remover quaisquer glomérulos soltos antes de realizar a gravação convencional do patch clamp em um modo conectado à célula.

Agora coloque 500 microlitros da fração glomérulos em cada tubo cônico de 0,5 mililitro e adicione corantes de cálcio vermelho puro am e gripe oh 4:00 AM. Em seguida, coloque os tubos em um agitador rotativo por até uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, prepare as lamínulas de vidro com polilisina e deixe-as secar na placa aquecida a 70 graus Celsius. Quando o carregamento das matrizes de cálcio estiver concluído, aplique 100 microlitros da solução contendo glomérulos nas lamínulas revestidas de polilisina e deixe-as grudar na superfície por cerca de cinco minutos.

Em seguida, monte as lamínulas anexadas aos glomérulos em uma câmara de imagem e perfunda-as com solução de banho a uma taxa de três mililitros por minuto para remover os glomérulos soltos e os corantes restantes. Em seguida, defina o microscópio confocal de varredura a laser para um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros. Em seguida, defina o software de imagem para uma frequência e resolução desejadas.

Em seguida, encontre os glomérulos em campo claro. Em seguida, ligue a detecção do sinal de fluorescência. Depois disso, selecione um plano focal desejado e verifique a intensidade da fluorescência nos canais flu oh four e firo red.

Certifique-se de que o glomérulo seja claramente visto em campo claro. Em seguida, registre as mudanças na intensidade da fluorescência para os sinais de gripe oh quatro e furor vermelho. Para importar a sequência de imagens, divida os canais e use o modo de escala de cinza de hiperpilha.

No software Image J, abra uma janela do gerenciador de ROI seguindo as ferramentas de análise, o caminho do ROI Manager. Selecione uma ou mais regiões de interesse usando uma ferramenta de seleção oval e a função adicionar T no gerenciador de ROI. Em seguida, selecione a área em segundo plano e salve os ROIs selecionados.

Em seguida, marque a caixa de uma linha por fatia na caixa de diálogo e clique em OK nos resultados das opções do menu. Defina medidas. Selecione o valor médio de cinza e calcule os valores de intensidade de pixel para cada ROI, que serão exibidos na janela de resultados em colunas separadas.

Para cada ROI, copie os valores de intensidade de ROI medidos para cada canal no software de análise de dados preferido e subtraia os valores de intensidade de fundo de cada ponto de dados para cada ponto de tempo. Calcule a proporção de intensidades da gripe oh quatro para os canais vermelhos URA após esse gráfico, as mudanças de tempo de ponto de transiente de cálcio para cada ROI. Esta imagem mostra a pipeta de grampo de remendo presa ao corpo de óxido na superfície do glomérulo de rato.

Durante um registro eletrofisiológico, uma parte do glomérulo encapsulado pode ser vista no canto inferior direito da imagem. Aqui está um traço atual representativo da atividade dos canais tripy like de um patch ligado à célula feito no podócito para medir a concentração de cálcio intracelular. Os glomérulos são carregados com gripe às 4:00 da manhã para rotular o cálcio intracelular.

Este vídeo ilustra os efeitos da NIC e do cloreto de manganês no influxo de cálcio nos glomérulos. Este gráfico quantifica as mudanças na intensidade do sinal de gripe ou quatro registradas de um único podócito em resposta à NIC e ao cloreto de manganês. Como esperado, o CIN produz o máximo de fluorescência e o cloreto de manganês extingue o corante e resulta na menor intensidade de fluorescência.

A aplicação dessas drogas permite que o pesquisador defina posteriormente a concentração exata de cálcio dentro da célula. Este vídeo demonstra o efeito de 10 micromoles a TP na concentração de cálcio nos glomérulos. Observe que há um aumento na fluorescência da gripe verde O quatro e uma queda na fluorescência vermelha e vermelha, que são responsáveis por um aumento da concentração de cálcio intracelular.

Esta técnica oferece uma oportunidade única para monitorar as mudanças no influxo de cálcio no canal iônico único e no nível das células individuais após tratamentos farmacológicos ou outras manipulações. Assim, essa abordagem representa uma ferramenta muito poderosa, considerando vários modelos de roedores geneticamente modificados disponíveis. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar medições de cálcio nos podócitos do, bem como o eletrofisiológico, que experimentos de pinça usados juntos por conta própria.

Essas técnicas fornecem uma visão aprofundada e mecanicista da regulação do manuseio do cálcio com podócitos em condições normais e patológicas.