Imagens ao vivo da ependimária Cilia nas laterais ventrículos do cérebro do rato

O objetivo geral deste procedimento é proporcionar uma observação ex vivo das batidas dos cílios móveis localizados nos ventrículos cerebrais de camundongos. Isso é conseguido primeiramente pela coleta de todo o cérebro e, em seguida, pela obtenção de cortes finos através dos ventrículos laterais. Em seguida, as fatias são incubadas em uma placa personalizada com fundo de vidro contendo meio rico em glicose, mantido à temperatura corporal, para manter o tecido vivo durante o experimento.

Por fim, a batida dos cílios é registrada utilizando um microscópio de contraste de interferência diferencial de alta resolução. Em última instância, a estrutura e a localização proteica dos cílios podem ser visualizadas por meio de imagem de imunofluorescência. A principal vantagem desta técnica em relação ao nosso método existente é que ela é a primeira técnica a permitir a classificação das células epidérmicas em três grupos distintos com base em suas frequências e ângulos únicos de repetição ciliar.

Isso é bom. A implicação desta técnica estende-se à terapia da hidrocefalia. Uma vez que a função anormal do CLIA epidérmico leva ao acúmulo de líquido cefalorraquidiano no cérebro.

Ventrículos Demonstrando o procedimento estarão a Sra. Zaha Alam e a Srta. Hannah, alunas muito talentosas do nosso laboratório. Comece limpando a cabeça de um camundongo adulto com etanol 70%. Em seguida, a partir do topo da cabeça, use tesoura e pinça estéreis para remover a pele e expor o crânio.

Em seguida, cure o osso pedaço a pedaço, começando pelo lado posterior e avançando em direção ao lado anterior. Para remover o crânio, selecione todo o cérebro e coloque-o em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo meio com alta concentração de glicose a 37 graus Celsius. Usando uma lâmina afiada, corte o cérebro no plano sagital mediano para obter a primeira seção de 100 a 200 mícrons de cada metade.

Em seguida, lave as seções com PBS a 37 graus Celsius e coloque imediatamente o tecido em meio de glicose para olho a 37 graus Celsius. Para imagens das seções, coloque as fatias cerebrais em placas de cultura com fundo de vidro de 30 milímetros contendo um mililitro de meio com alta concentração de glicose e ajuste o ambiente da câmara do microscópio a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono utilizando uma objetiva de imersão em óleo de 60 x. Em seguida, foque as células com luz transmitida DIC regular.

Em seguida, siga a direção do movimento da bolha de DMEM como guia para localizar os clios móveis. Use o filtro DIC para selecionar uma área contendo células saudáveis com clios móveis no ventrículo lateral do cérebro. Após identificar os clios móveis, ajuste a luz e o foco para obter uma imagem satisfatória.

Em seguida, defina os parâmetros de imagem em tempo real no software de aquisição. Por exemplo, aqui, imagens de 24 bits estão sendo adquiridas com o binning da câmera configurado em um por um, combinado com a objetiva de 60x e um tempo de exposição de cinco a 10 milissegundos. Abra a abertura do microscópio ao nível ideal para um tempo de exposição mínimo e colete as imagens de contraste de interferência diferencial (DIC).

Observe as imagens em tempo real transmitidas para a câmera para obter aquisição de imagem rápida e imediata, sem atraso. A velocidade das contrações cardíacas pode então ser calculada com base no requisito de tempos mínimos de exposição para obter um contraste de imagem suficiente para registrar o sinal de cálcio. Após cortar o cérebro, enxágue brevemente o tecido em PBS e incube imediatamente as seções em 20 microgramas por mililitro de lu O2 recém-preparado em uma placa com fundo de vidro.

Após 30 minutos a 37 graus Celsius, registre a oscilação de cálcio com uma taxa de captura de cinco milissegundos por um mínimo de um segundo. Primeiro em um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros, depois em um comprimento de onda de emissão de 515 nanômetros. Para visualizar os marcadores celulares de interesse por microscopia de imunofluorescência, fixe as amostras em paraformaldeído 4% e sacarose 2% em PBS por 10 minutos.

Lave o tecido três vezes em PBS, durante cinco minutos cada lavagem. Em seguida, incube as fatias cerebrais em Triton X 0,1% por cinco minutos. Após enxaguar as amostras conforme demonstrado anteriormente, incube-as com anticorpo primário de camundongo anti alfa tubulina acetilada.

Após uma nova lavagem com PBS, incubar as amostras com IgG anti-US marcada com fluoresceína por uma hora à temperatura ambiente. Por fim, contracolorir os cortes com DPI por cinco minutos e imaginar imediatamente as células com o tempo de exposição mínimo possível. A presença de um CLIA peniano é confirmada com o marcador de cílios alfa-tubulina acetilada, com contracoloração por DPI. Para identificar os núcleos, a análise do movimento de um CLIA peniano é realizada contando a frequência de batimento e o padrão angular das células em movimento.

A CLIA pode então ser dividida em um dos três grupos com base nesses dados. Importante, a exposição da CLIA ao etanol 0,25% reprimi significativamente a frequência de batimento da CLIA, independentemente do seu tipo. A flexão adicional da CLIA desencadeia um sinal de cálcio intracelular dependente de cílios, o que permite a medição do sinal de cálcio intracelular dentro dos ventrículos cerebrais. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em uma hora, se realizada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular o tecido cerebral com delicadeza e eficiência, a fim de não destruir os ventrículos cerebrais após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de neurociência explorassem a função da CLIA de apêndice e o tecido cerebral de camundongo vivo.