Name: Phenomics fago: Abordagens fisiológicas para Caracterizar Novel Proteínas Virais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a caracterizar genes de fago de função desconhecida usando MAPs e metabolômica em E. coli. Este método permite perfis fenotípicos detalhados para estudos de biologia viral e interações hospedeiro-patógeno.

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Agradecemos a Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas e membros do consórcio Viral Dark Matter por sua ajuda e contribuição construtiva neste manuscrito. Esta pesquisa é financiada pela National Science Foundation (DEB-1046413) e faz parte do projeto Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter.

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Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, apresentamos abordagens Phenomic para a caracterização funcional de genes de fago putativos. As técnicas incluem um ensaio desenvolvido capaz de metabolismo anabólico monitorização hospedeiro, as placas multi-fenótipo de ensaio (MAPs), em adição ao método estabelecido de metaboloma, capaz de efeitos no metabolismo catabólico de medição. Nós fornecemos ferramentas adicionais para gerenciar os grandes conjuntos de dados resultantes destas tecnologias, permitindo uma alta taxa de transferência de processamento e análise 24. Por último, através da comparação de uma proteína capsídeo anotada fago, fago thioredoxin, dois genes metabólicos fagos putativos, e que a resposta experimental média propomos várias estratégias para interpretar ambos os conjuntos de dados e categorias de genes, com ênfase na identificação de tendências fenotípicas e identificação de outliers. Como mencionado, as duas abordagens medir quantitativamente apenas metade do metabolismo de acolhimento. Para interpretar a função relativa de qualquer um dosnovas proteínas sob investigação, os dados de ambos os métodos é obrigado a fornecer provas de função. Enquanto isso não é um foco de nosso manuscrito atual, saídas de dados de cada método phenomic é colocada através de análises combinatórias que se concentram em técnicas de agrupamento, como floresta aleatório e análise de componentes principais. Além disso, as hipóteses resultantes da análise combinada deve ser posteriormente validada por metodologias genéticas tradicionais. Finalmente, os métodos apresentados são fortemente influenciados pela fisiologia bacteriana e, portanto, seguir as mesmas normas. Ao proceder a qualquer método, considerações devem ser feitas para garantir grupos independentes, clonais são experimentadas; evite a contaminação; uma única variável está sendo testado; e controles apropriados estão sendo correu simultaneamente. A falha em conta para esses pontos irá resultar em resultados pouco claros, semelhante a qualquer ensaio fisiológico. Multi-placas de ensaio fenótipo(Mapas) O desenvolvimento de mapas proporciona um elevado rendimento e adaptável ensaio em comparação com as tecnologias actualmente disponíveis (Figura 5A e Tabelas 1,2). O ensaio utiliza suprimentos, equipamentos e técnicas fundamentais disponíveis em todos os laboratórios de microbiologia. A incorporação de um oleoduto computacional, PMAnalyzer 24, para posterior processamento e análise de dados assegura uma leitura de dados rápido. Além disso, ambos os aspectos experimentais e analíticas de a abordagem pode ser facilmente ajustado ou sintonizado para fins personalizados. Por exemplo, se uma grande proporção dos dados não passar de filtragem descrito no ponto 4, pode-se peneirar manualmente através das curvas de crescimento para identificar problemas. Se o problema surge devido a rigorosos parâmetros de filtro, ajustes no script pode ser feita. Em alternativa, se os problemas estão associados com o processo experimental (isto é, a condensação prolongada; imprópria transferência de cel bacterianals, etc), então repetições adicionais podem ser facilmente repetido. Conforme descrito na Cuevas et al. 24, o PMAnalyzer é um único programa festança escrito como um script que executa os certificados de análise e de análise como um gasoduto coesa, automatizado. Todos os scripts são livremente acessível a partir de um repositório Git a 25 por determinar o valor médio para cada ponto de tempo através de dados triplicado, e, posteriormente, parametriza a curva logística para obter o tempo de latência, taxa de crescimento máxima, asymptote, e um romance prazo, nível de crescimento. O valor médio foi escolhido em detrimento do significativo no nosso estudo para reduzir o efeito de grandes valores aberrantes, no entanto, o certificado pode ser facilmente adaptado para calcular a média de dados em duplicado. Devido à reduzida variação (SE) visto através de dados em duplicado (Figura 2A) que manteve o uso da mediana no PMAnalyzer para ajuste de uma curva logística. Além disso, o ponto de corte para o crescimento neste estudo (GL ≥ 0,4) foi determined comparando como dados separados entre nível de crescimento e taxa de crescimento máximo (Figura 1A, B). Dependendo do modelo de instrumentos e sistema utilizado este termo pode variar, requerendo redefinição deste cortado valor. Uma grande vantagem do nosso ensaio é a capacidade para comparar fenótipos usando um único parâmetro que caracteriza o crescimento microbiano em geral, que definimos como nível de crescimento (OG). GL é uma média harmónica, e portanto mitiga os efeitos de grandes valores extremos nos dados. A utilização de uma média harmônica com os valores-equipados logísticos deslocado para fornecer um resumo de crescimento foi formada através de tentativa e erro. Outros métodos tentou diferenciar crescimento foram: tempo que levou para chegar a parâmetros específicos de curva (meia μ max, μ max, e capacidade de carga), o coeficiente de determinação (R 2), e combinações de R 2 multiplicado por parâmetros da curva específicos. Usando uma média harmônica com deslocouvalores logística-fit para o GL proporcionou a maior gama na avaliação de crescimento, assim, tornou-se o método de escolha. Uma consideração a ser observado é que os padrões da curva de crescimento dinâmicos têm o potencial de se perder quando se utiliza um único parâmetro ou um modelo ajustado. Por exemplo, os parâmetros da curva individuais da curva logística e GL sejam incapazes de representar crescimento bifásica. Em um ambiente único de carbono, este efeito sobre o crescimento implica mediação da proteína virai em qualquer conversão do substrato ou mudança de utilização do substrato. Efeitos adicionais potencialmente perdidos ao não considerar vários parâmetros de crescimento incluem: tempo de latência prolongada, propondo um aumento da carga de máquinas ou produtos viral; rápida aceleração fase exponencial, sugerindo proteínas virais acoplados a sediar vias de produção de energia; ou níveis mais elevados de biomassa, o que implica a formação de apoio viral no hospedeiro e a absorção de nutrientes anabolismo (dados não mostrados). Assim, traçando curvas de crescimento nascentes ( <strong&gt; Figura 2A, B) fornece informações sobre as tendências ao longo do tempo enquanto o GL tem em conta as principais variáveis ​​do modelo logístico, fornecendo um único número quantitativo para representar o sucesso global de um clone. Ao considerar as diferentes respostas contribuíram por genes estruturais e metabólicas nos mapas, observa-se que as diferentes classes de substrato em questão fornece a maior evidência para a função da proteína. Por exemplo, as proteínas metabólicas são frequentemente associados com a aquisição de nutrientes limitantes, que são inespecíficos para sediar 16,32 metabolismo central. MAP experiências preliminares revelam que os clones ancorando genes de fago metabólicas putativos têm um aumento da fase de retardamento quando cultivada em fontes de carbono metabolismo central (Figura 2A). Por outro lado, os clones portadores de genes estruturais putativas, que exigem grandes proporções de piscinas de energia anfitrião e dNTP, resultar em uma resposta falso positivo no crescimento de centosubstratos metabolismo de carbono ral e de aminoácidos. Isto é provavelmente devido à acumulação de proteínas insolúveis resultantes filamentação no hospedeiro e / ou corpos de inclusão, tal como observado por microscopia (Figura 2A e dados não mostrados). Enquanto uma análise mais aprofundada é necessária para validar estes resultados preliminares, os mapas são capazes de recuperar as respostas fenotípicas que se correlacionam com a hipótese de funções das classes de genes de fagos específicos. Em adição para a elucidação das proteínas virais desconhecidos, os mapas são um romance recurso para investigar a diversidade funcional e metabólica de uma bactéria indivíduo ou uma comunidade de bactérias. MAP componentes são concebidos para alteração fácil de suportar o crescimento de uma gama de bactérias; incluindo marinho, auxotróficas, e os micróbios anaeróbicos. Para facilitar estes esforços a basal e pré-definido de crescimento media exigem espécies químicas adicionais ou ajustados antes de um género de bactérias diferentes podem ser apoiados nos mapas.Uma nota nesta uso dos mapas é manter a mídia definidas, que proíbe a utilização de ingredientes tais como triptona, extrato de levedura e peptona. Metabolomics O campo de metaboloma é dependente de bases de dados de metabolitos, que incluem metabolitos isolados identificados por espectrometria de massa. A instalação do núcleo aqui escolhido tem um dos maiores bancos de dados de metabolômica. É interessante notar que mais de metade dos metabolitos resultantes das nossas experimentações foram não identificável (~ 65%), enquanto outros nunca antes tinha sido registado na nossa hospedeiro, Escherichia coli (exemplos incluem: Indolo 3 ácido acético 33, ácido salicílico 34, e o ácido di-hidroabiético 35). Este facto pode ser atribuído a qualquer uma forte tendência no sentido da base de dados de metabolitos de planta, ou as proteínas específicas em investigação. Independentemente disso, o resultado é um número limitado de metabolitos conhecidos disponíveis para a representação de dados e análise. No future, vários métodos de metabolômica usando vários bancos de dados permitiria uma maior cobertura metabolito. Atualmente, ambos conhecidos e desconhecidos metabólitos são usados ​​quando comparando e contrastando as nossas proteínas virais novos. Usando essa abordagem, nós supor que os clones que albergam proteínas funcionalmente semelhantes compartilharão uma maior semelhança em seu perfil metabolômica completa. Análise metaboloma preliminares revelaram que enquanto que os genes estruturais e metabólicas não se separam claramente uns dos outros, os genes que exibem efeitos semelhantes no hospedeiro quando superexpresso se correlacionam (Figura 6). Por exemplo, os agrupamentos de genes Cápside anotados em estreita colaboração com os genes metabólicos putativos destaque neste estudo, EDT2440 e EDT2441. As investigações com um programa preditor topologia transmembranar e o péptido de sinal disponíveis publicamente mostrou evidência de que ambos os genes putativos metabólicas abrigar um único domínio transmembranar. Curiosamente 5 out of the nove clones no primeiro grupo de cluster (mais à esquerda da porção de dendrograma) previram domínios de transmembrana usando o mesmo programa de topologia. Investigações adicionais são necessárias, no entanto, é provável que os metabolitos presentes durante a sobre-expressão destes clones estão associados a resposta ao stress resultante da membrana celular ou cargas estruturais. Esta evidência suporta que, embora os dados de metabolômica possui uma maior quantidade de ruído, o método é capaz de destacar os sinais que diferenciam efeitos gerais de genes, dentro e através de uma classe de genes. Para determinar se o método é capaz de extrair a informação específica da função do gene, metabolitos foram agrupados em vias metabólicas específicas. O ser hipótese, se um clone afecta metabolitos específicos para um único percurso, em seguida, o gene sobre-expresso é activa em que via. Antes da criação do nosso pipeline de garantia de qualidade metabolômica, dados preliminares revelou que mais de umd metabolitos eram tipicamente sub-representados &quot;desconhecido&quot;, proporcionando pouca informação sobre os percursos que estão associados com (dados não mostrados). Metabolômica dados pré-processados, no entanto, revela que a maioria dos perfis de metabolitos são semelhantes e somente um número restrito de abundâncias metabolitos desconhecidos e conhecidos variar entre os clones, por exemplo, a putrescina e uracilo (Figura 6). Para proporcionar maior resolução de esforços a função da proteína são feitas experimentalmente para comparar os genes de fago contra novos genes de fago conhecidos, que podem ser utilizados para preencher os &quot;buracos&quot; de metabolito baseados caracterização funcional. Usando esta técnica, a função atribuída de genes virais conhecidos fornece uma referência para a função dos genes desconhecidos. No entanto, o fator limitante de análise metabolômica é o tamanho ea importância do banco de dados. Para corrigir essas limitações, bases de dados metabolômica relacionáveis ​​a esta pesquisa precisam ser desenvolvidas; talcomo uma base de dados de metabolitos e seus abundâncias especificamente a recolha de E. ASKA Os clones de E. coli, em que um único ORF 36 é sobre-expresso. Evidência para a necessidade de tais bancos de dados foi fornecido em 2013 quando pesquisadores da Lawerence Berkeley National Laboratory compilou o primeiro banco de dados abrangente de metabólitos específicos para bibliotecas inteiras de bactérias mutantes modelo 37. Esta pesquisa forneceu novos insights sobre genes necessários para a utilização de metabólitos específicos, revelando a clara conexão entre fenótipo e genótipo. Ao considerar metabolômica como uma ferramenta, é importante para definir o regime de processamento seguido na instalação do núcleo. Um artefacto de a maioria dos procedimentos experimentais é a variância do dia-a-dia, associada com os instrumentos de utilização. Até à data todas as análises GC-MS implementa a utilização de normas internas que estão incluídos em cada corrida analítica; no entanto, a adição de amostras internos específicos do projeto &lt;/ Em&gt; correu cada dia de experimentação remove variância adicional. Estas considerações devem ser abordadas com antecedência para evitar problemas de normalização e preconceitos. Outra solução é a processar todas as amostras em uma instalação de núcleo na mesma máquina e, como um único lote, uma opção disponível, em qualquer instalação de núcleo. As várias ferramentas ambos introduzidos e re-explorados neste manuscrito fornecer novos meios para rastrear e caracterizar genes de fago funcionalmente desconhecidos. A simplicidade e capacidade de adaptação das técnicas experimentais com o uso de dutos agilizar computacionais garante esses métodos são aplicáveis ​​a uma ampla gama de esforços de pesquisa e campos. Nosso objetivo é que as abordagens Phenomic apresentados aqui vai ajudar outras investigações de proteínas de fagos novos, além de sistemas que são igualmente funcionalmente indefinido.

Os vírus que infectam bactérias (aka bacteriófago ou fago) são estimados de existir em mais do que 10 31, como partículas de vírus (VLP) globalmente e ultrapassam todos os outros organismos no ambiente de um 1,2. O primeiro estudo a investigar metagenômica as comunidades virais associadas a ambientes marinhos focada na quantificação da diversidade visto dentro da fração viral 3. Além disso, Breitbart e seus colegas descobriram que mais de 65% das sequências virais da comunidade compartilhada nenhuma homologia com as seqüências disponíveis em bases de dados públicas. Metagenomic estudos posteriores encontraram evidências semelhantes: metagenomes de sedimentos marinhos em San Diego, Califórnia conter 75% desconhecidos sequências virais 4; metagenomes de lagos hipersalinas do Mar Salton conter 98% desconhecidos sequências virais 5; e metagenomes associado de corais contêm 95-98% desconhecidos sequências virais 6. Esta acumulação de informação não anotadas resultou emmaterial genético do fago ser &quot;a matéria escura do universo biológico&quot; 7. Caracterização genômica de fago se baseia na identificação de similaridade de sequência através da comparação em bases de dados de ácidos nucleicos e de proteínas existentes. Porque a informação genética codificada-fago é predominantemente desconhecido, os métodos baseados em homologia são ineficazes. Dentro do seu genoma, fagos codificam tipicamente três tipos principais de genes: genes de transcrição e de replicação, genes do metabolismo, e os genes estruturais. Os genes de transcrição e replicação (classe I / II genes 8) incluem polimerases, primases, endo / exo-nucleases, e cinases. Estes genes são altamente conservadas devido à sua importância na infecção pelo fago, transcrevendo e replicar material genético do fago. Polimerases de fago são prontamente identificados utilizando métodos tradicionais de homologia de sequência, devido à sua conservação global 9 e ter sido mostrado para servir como marcadores filogenéticos eficazes 10.Em contraste, o fago metabólica e genes estruturais (genes II / III de classe 8) estão cada vez mais frequentemente divergente e anotada como genes hipotéticos. Fago genes metabólicos afectar a capacidade metabólica do hospedeiro e não são necessariamente necessário para a replicação virai. Estes genes, muitas vezes referidos como genes metabólicos auxiliares (11), AMGs parecem modular o metabolismo de acolhimento e permitir que a progressão óptima da infecção e do sucesso da maturação do virião. AMGs têm sido associados com a utilização e absorção de nutrientes limitantes ou em vias de produção de energia. Alguns exemplos incluem genes fotossistema encontrados nos genomas de vários cyanophage 12-16, os genes ligados ao metabolismo e regulados pelo fosfato de 17,18, e a utilização da via da pentose fosfato de fago dNTP biossíntese 18,19. Em comparação, os genes estruturais estão entre os meados de genes tardios produzidos durante a infecção e variam entre diferentes fago-hosistemas de st. A produção de proteínas estruturais são dependentes da disponibilidade de dNTP viral, e piscinas de energia para a sua transcrição, tradução e montagem 8. As proteínas da cápside de fibra e cauda estrutural são considerados como os mais divergentes de todos os genes que codificam proteínas virais e são necessárias para produção de viriões de sucesso. Sua divergência é tipicamente atribuído ao papel activo que desempenham na formação vírus-anfitrião coevolução 20. Proteínas divergentes, independentemente da classe de genes, são facilmente esquecido quando usando técnicas de homologia e alinhamento de sequências tradicionais. Um esforço para corrigir as limitações observadas com os rigorosos comparações de sequência resultou em ferramentas da bioinformática capazes de utilizar as características de sequências para determinar associação, tais como redes neurais artificiais 21. Redes neurais artificiais (RNAs) permitir a predição de genes estruturais e metabólicas, no entanto, necessitam de validação experimental jusante para caracterizar diretamentea função do gene. O objetivo deste artigo é o de fornecer protocolos Phenomic capazes de monitorar tanto o metabolismo anabólico e catabólico de uma bactéria hospedeira durante a expressão de um gene fago novela, funcionalmente previu através de RNAs. O campo de phenomics, a biologia associado com fenótipos celulares, está bem estabelecida na biologia de sistemas para ajudar na investigação de proteínas com função desconhecida ou pleiotrópico. Phenomic ferramentas são usadas para conectar informação fenotípica à informação genotípica. Nossa hipótese de genes de fago putativos que a sua função (s) podem ser determinadas através da observação de acolhimento efeitos fisiológicos durante a expressão do gene fago. Para investigar essa hipótese, foram escolhidos dois métodos quantitativos. Placas de multi-fenótipo de ensaio (MAPs) foram utilizados para monitorizar a utilização do substrato de acolhimento e a formação subsequente de biomassa, enquanto metaboloma medido diversidade metabolito hospedeiro e abundância relativa durante o crescimento em Environ específicacondições mentais. Proteínas estruturais e metabólicas putativos foram sobre-expressos em Escherichia coli e os resultados representativos de ambas as experiências são comparados. Inúmeras técnicas visuais e dutos de processamento de alto rendimento são apresentados para facilitar a replicação experimental. Por último, a reprodutibilidade e a precisão dos métodos apresentados são discutidos no contexto de efeitos fisiológicos esperado para uma proteína da cãpside e anotada proteína metabólica fago, tioredoxina, mais dois AMGs putativos.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m Filtro Sterivex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVGP01050</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtros Millex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtro SteriCap</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS02RE</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtros de membrana Omnipore</td><td>Millipore</td><td>JHWP02500</td><td>Placas</td></tr><tr><td>de microtitulação de 96 poços</td><td>Millipore VWR</td><td>82050-764</td><td>Microplacas padrão F-Bottom de 96 poços</td></tr><tr><td>Placa de 2 ml de 96 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesive seal plate film</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369667</td><td></td></tr><tr><td>2 L Nalgene garrafas quadradas</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-70</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas quadradas Nalgene de 125 ml</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-50</td><td></td></tr><tr><td>1/4 pol. Porca de travamento de montagem em painel, nylon preto</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Montagem em painel de estilo de rosca Luer fêmea para Barb Série 200, 1/16 pol.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Montagem em painel de estilo de rosca Luer fêmea para barb da série 200, 1/8 pol.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-34</td><td></td></tr><tr><td>Anel de trava integral Luer macho para barb da série 500, 1/16 pol. Tubulação de identificação</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45505-31</td><td></td></tr><tr><td>Luer macho com anel de trava x acoplador Luer fêmea</td><td>Cole Parmer</td><td>T-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>Conexões de anteparo com barba, 1/4 pol. OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Sanipure, 1/16 pol. ID x 1/8 pol. OD</td><td>SaniPure</td><td>AR400002</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Sanipure, 1/4 pol. OD x 1/8 pol. ID</td><td>SaniPure</td><td>AR400007</td><td></td></tr><tr><td>Mini bomba de fluxo variável (bomba peristáltica)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>Velp Scientifica</td><td>F203A0160</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-141</td><td>Millipore* Filtro Pinça</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro multiplacas, leitor de placas</td>, <td>Molecular Devices Analyst GT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coletor de filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX10 025 02</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software:</td></tr><tr><td>Python versão 2.7.5</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.python.org/" target="_blank">http://www.python.org/</a></td></tr><tr><td>PyLab module</td><td></td><td></td><td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab" target="_blank">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td></tr><tr><td>R versão 3.0.1</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/" target="_blank">http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>reshape2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://had.co.nz/reshape" target="_blank">http://had.co.nz/reshape</a></td></tr><tr><td>ggplot2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://ggplot2.org/" target="_blank">http://ggplot2.org/</a></td></tr><tr><td>Gene Composer</td><td>PSI Tech Portal</td><td></td><td><a href="http://www.genecomposer.net" target="_blank">http://www.genecomposer.net</a></td></tr><tr><td colspan="4">Serviços:</td></tr><tr><td>Centro de Metabolômica da Costa Oeste</td><td>UC Davis</td><td></td><td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/" target="_blank">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td></tr><tr><td>DNA 2.0</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.dna20.com" target="_blank">https://www.dna20.com</a></td></tr></tbody></table>

phenomics fago: abordagens fisiológicas para caracterizar novel proteínas virais

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Investigações em curso em interações fago-hospedeiro são dependentes de extrapolar o conhecimento a partir de (meta) genomas. Curiosamente, 60-95% de todas as sequências de fagos partes sem homologia com proteínas anotados actuais. Como resultado, uma grande proporção de genes de fagos são anotados como hipotética. Esta realidade afeta fortemente a anotação dos dois genes metabólicos estruturais e auxiliares. Apresentamos aqui os métodos Phenomic concebidos para capturar a resposta fisiológica (s) de um hospedeiro seleccionado durante a expressão de um destes genes de fago desconhecidos. Multi-fenótipo placas de ensaio (MAPs) são utilizados para monitorizar a diversidade de utilização do substrato de acolhimento e formação subsequente de biomassa, enquanto fornece metaboloma análise bi-produto através da monitorização abundância e diversidade metabolito. Ambas as ferramentas são utilizadas simultaneamente para proporcionar um perfil fenotípico relacionado com a expressão de um único fago putativo enquadramento de leitura aberto (ORF). Os resultados representativos para os dois métodos são comparadas, highlighting as diferenças perfil fenotípico de uma série transportar tanto genes de fago estruturais ou metabólicas putativos. Além disso, as técnicas de visualização e de alto rendimento condutas computacionais que facilitaram a análise experimental são apresentados.

Aqui, apresentamos abordagens fenômicas para a caracterização funcional de genes de fagos putativos. As técnicas incluem um ensaio desenvolvido capaz de monitorar o metabolismo anabólico do hospedeiro, as Placas de Ensaio Multi-fenótipo (MAPs), além do método consagrado de metabolômica, capaz de medir efeitos ao metabolismo catabólico.

Phenomics fago: Abordagens fisiológicas para Caracterizar Novel Proteínas Virais

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar e caracterizar genes de fagos com funções desconhecidas. Primeiro, quadros de leitura aberta putativos de fagos virais, chamados ORFs, são expressos em e coli.Clones do fago. Orff expressando E. coli são inoculados em placas de ensaio multifenotípicas ou MAPS, que contêm meio de crescimento e várias fontes de substrato. O crescimento bacteriano é então monitorado ao longo do tempo por espectrometria como um segundo método de análise; E. coli expressando genes de fago são cultivadas em cultura contínua ou por cultivo seriado em batelada.Os metabólitos de crescimento resultantes são então coletados e enviados para análise metabolômica por cromatografia gasosa e espectrometria de massas com tempo de voo. Os dados resultantes oferecem um perfil fenotípico associado à expressão de um único quadro de leitura aberto putativo de fago. Este método foi inicialmente desenvolvido para elucidar a função de proteínas virais desconhecidas.Também pode ser aplicado a estudos que investigam a ligação entre genótipos e fenótipos, e na análise das interações entre fagos bacterianos e hospedeiros em diferentes biomas. Inicie este procedimento rotulando placas microtituladoras estéreis de 96 poços com o número de identificação do clone de e coli e o tipo de esquema de mapa, o qual indica os substratos que estão sendo testados no ensaio. Transfira assépticamente água estéril para um reservatório líquido.Em seguida, utilizando uma pipeta multicanal, transfira 60 microlitros de água para cada poço da placa de microtitulação. A seguir, transfira assépticamente três X do meio basal para um reservatório líquido. Depois, utilizando uma pipeta multicanal, transfira 50 microlitros para cada poço da placa de microtitulação.Usando a mesma técnica, pipete 50 microlitros de cada meio basal utilizado no esquema do mapa. Em seguida, transfira 30 microlitros de cada substrato para o poço apropriado. Então, utilizando um pipetador multicanal, transfira 10 microlitros de células bacterianas para cada poço.Certifique-se de trocar as ponteiras antes de reintroduzir a pipeta novamente no estoque de cultura. Cubra cada placa com um filme adesivo para placas. Pressione firmemente o filme sobre os poços da placa e ao longo das bordas para criar um selo uniforme e hermético.Usando uma lâmina de barbear estéril, remova qualquer filme em excesso das bordas da placa de microtitulação. Coloque o mapa preparado na manga de entrada de um espectrofotômetro multifrequência. Abra o software do leitor de placas e crie um protocolo para medir a absorbância a cada 30 minutos durante um total de 32 horas.Com 60 segundos de agitação entre as leituras, ajuste a temperatura no aparelho para 37 graus Celsius. Uma vez que o mapa atinja a temperatura definida, inicie o protocolo após 32 horas e remova o mapa da manga de saída do leitor de placas. Rotule cada arquivo de dados com o número de identificação do e coone, a data e o tipo de esquema do mapa.Analise os dados conforme descrito no documento complementar para avaliar o crescimento e o crescimento biologicamente relevante. A partir da análise de metabólitos, as células podem ser cultivadas por meio de passagem contínua ou em batelada com passagem serial. Para manter um estado estacionário.Aqui demonstraremos um cultivo contínuo. Esterilize os componentes de um reator de cultivo contínuo de 75 mililitros e uma garrafa de alimentação de dois litros conforme descrito no documento anexo. Após a esterilização, coloque todos os materiais autoclavados em uma cabine de segurança biológica e ligue a luz ultravioleta enquanto o meio esfria. Assim que o meio estiver frio, adicione arabinose 0,1%L e 100 microgramas por mililitro.Ampicilina até 75 mililitros de caldo 0,5 XLB e transfira-o para o reator contínuo. Desenrole a tampa do reator de cultura contínua e rosqueie-a no reator. Evite tocar no tubo de amostragem, desenrole a tampa do frasco de alimentação e rosqueie-a no frasco de alimentação.Evite tocar o tubo de amostragem, mantendo o tubo de 18 polegadas conectado à porta épsilon estéril. Desembrulhe o tubo de 18 polegadas e o tubo da bomba peristáltica. Adapte uma extremidade do tubo de 18 polegadas a uma extremidade do adaptador do tubo da bomba peristáltica; conecte a outra extremidade do adaptador do tubo da bomba peristáltica ao tubo de 18 polegadas.Conecte o filtro de 0,22 mícron à porta épsilon da tampa do frasco de alimentação e conecte unidades de filtro de 0,22 mícron às portas beta e delta do reator de cultura contínua. Conecte uma unidade de filtro de 0,22 mícron ao adaptador da porta alfa. E a essa, conecte o tubo de 45,72 cm na cabine de segurança biológica.Inocule o reator de cultura contínua com 100 microlitros de uma cultura de e coli de crescimento noturno preparada conforme descrito no documento anexo. Aperte as tampas do reator e do frasco de alimentação e, em seguida, coloque o sistema em uma incubadora a 37 graus Celsius. Equipado com uma placa de agitação magnética e uma mini bomba peristáltica, encaixe o adaptador de tubo da bomba peristáltica na bomba peristáltica.O tubo proveniente do frasco de alimentação entra na bomba e segue até o reator. Ajuste a bomba para rápido e, em seguida, ligue-a. Alterne para verificação direta para garantir que o meio comece a fluir através do tubo.Coloque o reator sobre a placa de agitação magnética e inicie a mistura. Deixe o reator de cultura contínua equilibrar por 24 horas antes de coletar a amostra no dia seguinte. Para coletar a amostra da cultura contínua, parafuse uma seringa de bloqueio de cinco mililitros na porta gama e retire 4,5 mililitros da cultura.Utilize 500 microlitros da cultura para medir a densidade óptica a 600 nanômetros. Em seguida, utilize o restante da alíquota para preparar quatro culturas de um mililitro com uma DO 600 de 0,35 e tubos microcêntrifugos de 1,7 mililitro para preparar as amostras para cromatografia gasosa, espectrometria de massas com tempo de voo ou GC to F ms. Centrifugue as células a 16.900 ×g por dois minutos para obter o pellet. Após a decantação da centrifugação, lave o sobrenadante com 500 microlitros de PBS. Realize esta lavagem. Repita o passo uma segunda vez, decante o sobrenadante pela última vez e, em seguida, submerja os tubos microfuga contendo as células em pellet em nitrogênio líquido.Até que as bolhas parem, armazene as amostras em um congelador a menos 80 graus Celsius. Repita a coleta a cada 12 horas durante quatro dias após a obtenção de todas as amostras. Envie três amostras por clone em gelo seco para uma instalação central de metabolômica para análise de processamento das amostras e normalização de GC para f ms a fim de obter os quadros de leitura abertos virais.A água do mar foi coletada da Ilha Starbuck e da AOL Caroline das Ilhas Line do Sul abaixo da camada limite do coral. O crescimento bacteriano sob 72 condições específicas de carbono foi avaliado para 47 clones utilizando mapas. Os dados resultantes foram então usados para categorizar os clones como fenótipos de crescimento esperado, ganho de função, perda de função e ausência de crescimento.Para testar a hipótese de que clones que possuem proteínas funcionalmente semelhantes apresentam perfis de metabolômica, as abundâncias medianas de metabólitos foram determinadas em 84 clones cultivados em cultura contínua por meio de GC TOF ms. Os dados resultantes foram então utilizados para agrupar hierarquicamente os clones com base em suas abundâncias relativas de metabólitos, que são indicadas por cores.Os metabólitos mais abundantes são mostrados em vermelho, enquanto os de menor abundância são mostrados em azul escuro. A análise preliminar de metabolômica revelou que, embora genes estruturais e metabólicos não se separem claramente uns dos outros, aqueles genes que exibem efeitos semelhantes sobre o hospedeiro apresentam correlação. Por exemplo, o gene anotado de capsídeo agrupa-se estreitamente com os genes metabólicos putativos destacados neste estudo EDT 24 40 e EDT 24 41. Investigações utilizando um programa público preditor de topologia transmembranar e peptídeo sinal mostraram evidências de que ambos os genes metabólicos putativos abrigam um único domínio transmembranar.Curiosamente, cinco dos nove clones no primeiro grupo de clusters apresentam domínios transmembranares preditos com a mesma topologia. Em conjunto, esses dados indicam que este método é capaz de fornecer informações sobre os perfis de metabólitos dos clones, clones potenciais com funções relacionadas e clones com metabólitos atípicos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os métodos apresentados são fortemente influenciados pela fisiologia bacteriana.É necessário levar em consideração que grupos independentes de clones sejam utilizados, garantindo que a contaminação seja evitada e que uma única variável seja testada com o uso de controles apropriados.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Genomics vírus individuais (SVG) é um método para isolar e amplificar os genomas de virons individuais. Suspensões virais de uma assembléia mista são classificados usando citometria de fluxo em uma lâmina de microscópio com poços discretos contendo agarose, capturando assim, o virion e reduzindo corte genoma durante o processamento downstream. Amplificação do genoma inteiro é conseguida usando vários amplificação por deslocamento (MDA), resultando em material genómico que é adequado para a...

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Uma nova geração de plataformas de transcrição-tradução livre de célula foi projetada para construir sistemas bioquímicos em vitro através da execução de circuitos de gene. Neste artigo, descrevemos como bacteriófagos, como MS2, ΦΧ174 e T7, são sintetizados a partir de seu genoma usando um Escherichia coli célula livre todos os sistema de TXTL.

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O objetivo do presente protocolo é especificamente tag e seletivamente isolar o DNA viral de células infectadas para caracterização de proteínas do genoma viral associada.

Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas

Os protocolos descritos permitem a construção, caracterização e seleção (contra o destino de escolha), de uma biblioteca de "domainome", feita a partir de qualquer fonte de DNA. Isto é conseguido por um pipeline de pesquisa que combina diferentes tecnologias: a exibição do fago, repórter dobrável e sequenciamento de próxima geração com uma ferramenta web para análise de dados.

Interactome-Seq: Um protocolo para a construção da biblioteca de Domainome, a validação e a seleção por Phage Display e a próxima geração de sequenciamento

Esse protocolo permite revelar o impacto dos prófagos em seus hospedeiros. As culturas bacterianas são sincronizadas usando condições que melhor suportam o estado lisogênico, limitando a indução espontânea. A RT-qPCR distingue inequivocamente os genes restritos ao prófago e aqueles desacoplados do controle do fago daqueles que são expressos durante o ciclo de replicação lítica.

Entendendo o impacto de bacteriófagos de clima temperado sobre seus lisógenos através de transcriptômica

Um método de microplacas baseado em densidade óptica é descrito para quantificar o crescimento bacteriano a longo prazo na presença de bacteriófagos, adequado para actinomicetos e outras bactérias de crescimento lento. Este método inclui modificações para reduzir a evaporação e condensação da pálpebra e código R para calcular métricas de infecção viral, incluindo a área sob a curva, o máximo de crescimento e a virulência relativa.

Um ensaio adaptado baseado em densidade óptica em microplacas para caracterizar a infecção por actinobacteriófagos

Os bacteriófagos (fagos), vírus que infectam bactérias, são um componente integral do microbioma intestinal. Embora esses habitantes simbióticos impulsionem a aptidão bacteriana e a dinâmica populacional, pouco se entende sobre como eles afetam a homeostase intestinal e a doença. Este protocolo estuda fagos isolados de T4 dentro de um modelo murino, adaptável a outros pares fago-bactérias.

Interação Bacteriófago T4 e E. coli no Intestino Murino: Um Modelo Prototípico para Estudo da Dinâmica Hospedeiro-Bacteriófago In Vivo

Aqui, descrevemos um imunoensaio fluorescente multiplex recém-desenvolvido que usa um sistema de citometria de fluxo de repórter duplo para detectar simultaneamente dois epítopos de proteína spike exclusivos em partículas virais intactas do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) que foram capturadas por microesferas magnéticas acopladas à enzima conversora de angiotensina 2.

Perfil de epítopos de proteínas de superfície em partículas virais por estratégia de repórter duplo multiplex

Aqui, descrevemos métodos de amostragem das zonas eufóticas de ecossistemas marinhos e de água doce para isolar cianofagos (e seus hospedeiros) e processos pós-amostragem que enriquecem genótipos únicos e caracterizam a dinâmica de interação vírus-hospedeiro.

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A caracterização de epítopos de células T de patógenos que causam infecções localizadas, como o papilomavírus humano, é um desafio devido ao número limitado de células T em circulação. É descrito um método no qual células T raras foram isoladas e caracterizadas a partir de um número muito pequeno de células.

O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

Aprenda a caracterizar genes de fago de função desconhecida usando MAPs e metabolômica em E. coli. Este método permite perfis fenotípicos detalhados para estudos de biologia viral e interações hospedeiro-patógeno.

Phenomics fago: Abordagens fisiológicas para Caracterizar Novel Proteínas Virais

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