Name: In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a investigar a adesão bacteriana em vasos sanguíneos sob estresse de cisalhamento usando modelos in vitro e in vivo com Staphylococcus aureus. Este método permite visualizar em tempo real as interações patógeno-hospedeiro.

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Este trabalho foi financiado pelo Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;Eddy Merckx Research Grant&quot; eo &quot;Sporta pesquisa Grant&quot; para Cardiologia Pediátrica, UZ Leuven, Bélgica (JC); o Center for Molecular e Biologia Vascular é suportado pelo KU Leuven Programmafinanciering (PF / 10/014), pela &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13), da Universidade de Leuven e uma bolsa de investigação da Boehringer Ingelheim-.

As experiências com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da KU Leuven. 1. Bactérias Preparando in vitro perfusões e in vivo <ol><li> Nós usamos S. aureus estirpe Newman para todas as experiências descritas neste manuscrito. S. aureus Newman foi armazenado em Brain Heart Infusion (BHI) com 10% de glicerol a -80 ° C. </li><li> Usar uma ansa estéril para raspar as bactérias congeladas fora e inocular em 5 ml de Tryptic Soy Broth (TSB) O / N a 37 ° C (OD 600&gt; 3). </li><li> Lavam-se as bactérias por centrifugação (2600 g, RT, 5 minutos) e ressuspender o sedimento de bactérias em 5 ml de PBS (tampão fosfato salino). </li><li> Prepara-se uma solução de 1 mg / ml de 5 (6) éster de N-hidroxi-succinimidilo carboxi-fluoresceína (carboxi-fluoresceina) em etanol. Dilui-se a / solução 1 mg ml carboxi-f luoresceina a 150 mg / ml em água grau de laboratório (por exemplo, água MilliQ). Proteja os tubos de luzcom folha de alumínio e armazenar a -20 ° C. </li><li> Centrifugar as bactérias (2600 xg, temperatura ambiente, 5 min). Ressuspender o sedimento bacteriano em 800 ul de PBS e adicionar 200 uL (concentração final de 30 ug / ml para experiências de perfusão) ou 400 ul (concentração final 50 ug / ml para experiências in vivo) da mL / solução de carboxi-fluoresceína 150 ug. Proteger os tubos de luz com folha de alumínio e incuba-se durante 30 min à temperatura ambiente num agitador. </li><li> Após a marcação, o bloco com uma solução de 6% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS. </li><li> Dilui-se as bactérias por densitometria óptica (OD), um OD 600 de 0,65 para experiências in vitro (que corresponde a aproximadamente 3 x 10 8 unidades formadoras de colónias (CFU) / ml para S. aureus) e uma DO 600 de 1,8 para experiências in vivo ( correspondendo a cerca de 1 x 10 9 UFC / ml para S. aureus) em PBS. Proteja os tubos de luz com papel alumínio e deixe no gelo. </li></ol> 2. Experiments In Vitro Perfusão <ol><li> O revestimento de lamelas de vidro <ol><li> Dilui-se o factor von Willebrand (VWF) (Haemate P, a concentração de estoque de 2.400 ug / ml) em grau de laboratório água (desionizada destilada) a uma concentração final de 50 ug / ml. </li><li> Dilui-se o colagénio em solução isotónica de glucose (solução a SKF, pH 2,7-2,9, tal como é fornecido pelo fabricante) para uma concentração final de 160 ug / ml. </li><li> Revestimento lamelas de vidro (24 x 50 mm) com VWF ou colagénio, largando 200 ul do revestimento em parafilme e colocar a lamela por cima da gotícula. A gotícula irá espalhar ao longo da superfície da lamela. </li><li> Incubar a lamela em um recipiente de humidif içado, durante 4 horas à temperatura ambiente. Levante cuidadosamente as lamelas do parafilm com uma agulha sem corte. Colocar a tampa na parte inferior da câmara de escoamento. </li></ol></li><li> Revestimento de plástico desliza com células endoteliais <ol><li> Deslizamentos Brasão de plástico(1-bem câmara de cultura de células APC, Sarstedt, Alemanha) com 1 ml de uma solução de gelatina a 1% em PBS e incubar durante 30 min a 37 ° C. Semear as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) sobre as folhas de plástico revestidos com gelatina e crescê-las a 70-80% de confluência. Montar o deslizamento de plástico na parte inferior da câmara de escoamento. </li></ol></li><li> Perfusão Experiment NOTA: Uma vista geral esquemática do sistema de perfusão em vitro é representado na Figura 1. <ol><li> Realiza-se em estudos in vitro a aderência de bactérias numa câmara de fluxo de placa de micro-paralela a uma tensão de cisalhamento laminar entre 2,5 dine / cm2 e 20 dine / cm 2 para simular diferentes condições de fluxo fisiológicas. </li><li> O (in-house design) câmara de fluxo consiste numa estrutura de metal e uma câmara de perfusão feito de plexiglas (poli (metil) metacrilato (PMMA)). Ao ligá-lo a uma bomba de infusão de alta precisão (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, EUA), podemos gerar ra fluxotes entre 0,0001 mL / min e 220,82 mL / min. </li><li> Ligue o tubo para a parte superior da câmara de fluxo e injectar meio no tubo. Suavemente colocar a parte superior da câmara de fluxo na parte superior da parte de fundo e montar a câmara de escoamento. Tenha cuidado para evitar bolhas de ar. Injectar 1 mL de meio através da câmara para se certificar de que a câmara não tem fugas e para remover o excesso de solução de revestimento. Evitar bolhas de ar. </li><li> Colocar o rato sobre uma almofada de aquecimento controlado por termo a 37 ° C num tabuleiro de microscópio. Como este é um processo terminal, não há necessidade de procedimentos asceptic rigorosos. Realizar uma incisão perto da veia jugular, remover suavemente o lado direito do músculo do colo do útero e isolar a veia jugular a partir do tecido circundante. </li><li> Configure a bomba de infusão e microscópio de fluorescência. Configurações de bomba de infusão depende do diâmetro de uma seringa e a vazão desejada (ver secção 2.4). A partir de agora, trabalhar em um quarto escuro. </li><li> Revestimento de VWF: <ol><li> Encha uma seringa com bactérias fluorescente etiquetado e conectá-lo ao tubo de entrada. Evitar bolhas de ar. Iniciar a bomba de infusão durante 10 min. O tempo de infusão depende da velocidade de corte e do revestimento, as bactérias e meio utilizado e deve representar o estado estacionário de adesão. </li><li> Após 10 minutos, lavar as bactérias não ligadas por ligação de uma seringa com PBS para o tubo de entrada e a partir da bomba de infusão. </li><li> Tome pelo menos 15 imagens ou filmes em diferentes locais após o processo de lavagem. As bactérias são pequenos e potencialmente difícil de focar. Antes do experimento de fluxo in vitro, o plano focal apropriada pode ser obtida por colocação de uma gota de bactérias marcadas com fluorescência numa lamela e colocando a lamela na câmara de escoamento. Em seguida, procure o plano focal apropriado e salvar as configurações. Nota: Durante a experiência de fluxo in vitro, as imagens foram capturadas durante o passo de lavagem (± 5 minutos após o início) garante que apenas osinal para as bactérias aderentes é capturado. </li></ol></li><li> O colagénio de revestimento: <ol><li> Adicionar 60 ug / ml de VWF para as bactérias marcadas com fluorescência imediatamente antes do início da perfusão. Encha uma seringa com bactérias fluorescente etiquetado ou bactérias fluorescente etiquetado suplementadas com 60 ug / ml VWF e conectá-lo ao tubo de entrada. Evitar bolhas de ar. Repita os passos 2.3.5.2 para 2.3.5.3 </li></ol></li><li> As células endoteliais: <ol><li> Activa as células endoteliais por perfusão com uma solução 0,1 mM de Ca2 + A23187 -ionophore (solução de reserva 10 mM dissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO)) em DMEM com a mesma taxa de cisalhamento como a perfusão bacteriana durante 10 minutos por perfusão com um 0,1 mm. Repita os passos 2.3.5.2 a 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Calcule a taxa de deformação e tensão de cisalhamento como se segue. Taxa de corte = 6Q / wh 2 Onde: Q: taxa em ml / min, fluxo w: largura em cm, h: altura em cm A tensão de cisalhamento (τ) = rato cisalhamentoex viscosidade (μ) Onde μ: média: 0,01 dines x sec / cm 2, o sangue total: 0,04 dinas x sec / cm 2 </li><li> Análise de imagem <ol><li> Obter imagens ao vivo usando um microscópio de fluorescência invertido com uma câmera preto e branco e desenvolver usando software de imagem. Use o tempo de exposição de 1,5 s. Tome vários instantâneos (pelo menos 15) distribuídas aleatoriamente sobre a superfície revestida da câmara de fluxo e salvá-los no formato de arquivo apropriado. </li><li> Realizar análise de imagem com ImageJ. Subtrair o plano para remover fundos contínuos suaves de imagem (Processo - Fundo substrato) e definir o limite para definir valores de limite inferior e superior, a segmentação de imagens em escala de cinza em características de interesse. Medir a área limitada ao limiar. </li><li> Comparar a adesão bacteriana, expressa como a área de fluorescência, por exemplo, utilizando software de análise estatística. Comparar os grupos utilizando ANOVA one-way ou two-atado teste t de Student. Assinalar todos os valores como média ± erro padrão da média (SEM). Considere-se um valor de p &lt;0,05 significativo (* p &lt;0,05; ** p &lt;0,01; *** p &lt;0,001). </li></ol></li></ol> 3. In Vivo Modelo de perfusão mesentérica <ol><li> Preparação / cirurgia do mouse <ol><li> Jejuar o mouse na noite antes do experimento, a fim de limitar o movimento do intestino. </li><li> Dê um com 6-8 semanas de idade ratinho (C57BL / 6) analgesia pré-operatória de uma injecção subcutânea de buprenorfina (0,1 mg / kg de peso corporal (PC)) 20-30 minutos antes da cirurgia. </li><li> Anestesiar o rato por injecção intra-peritoneal de cetamina (125 mg / kg de peso corporal) e xilazina (12,5 mg / kg de peso corporal). Verifique por pedal reflexo. Aplicar veterinário pomada para evitar o ressecamento. </li><li> Colocar o rato sobre uma almofada de aquecimento controlado por termo a 37 ° C num tabuleiro de microscópio. Uma vez que este é um procedimento de terminais, não há necessidade de estrita asceptic procedimentos. Realizar uma incisão perto da veia jugular, remover suavemente o lado direito do músculo do colo do útero e isolar a veia jugular a partir do tecido circundante. </li><li> Inserir um cateter 2 French intravenosa na veia jugular direita para a infusão de bactérias marcadas com fluorescência ou outras soluções. Abra a cavidade peritoneal através de uma incisão na linha média abdominal e usar cotonetes para espalhar o mesentério e visualizar a arteriolar mesentérica e circulação venular. </li><li> Posicione o mouse no lado direito em uma placa transparente e segurar a cânula com fita adesiva. Use um pacote quente para evitar a hipotermia. Para prevenir a desidratação do tecido, gota 500 ul de NaCl a 0,9% sobre os intestinos. </li></ol></li><li> A microscopia de fluorescência de adesão bacteriana à circulação mesentérica <ol><li> Trabalhar em um quarto escuro. Use cotonetes para imobilizar os navios e visualizá-los sob um microscópio invertido. </li><li> Topicamente aplicar 5 ul de uma solução 10 mM de Of o Ca2 + A23187 -ionophore dissolvido em DMSO. Após 10 s, injectar 100 ul bactérias marcadas (veja o passo 1) através do cateter jugular. Tome imagens de lapso de tempo. Após o experimento for concluída, a eutanásia o mouse de acordo com as directrizes aprovadas institucionais. </li></ol></li><li> Análise de Imagem <ol><li> Obter imagens ao vivo usando um microscópio de fluorescência invertido, capturado usando uma câmera preto e branco e desenvolvido usando qualquer software de imagem. Aplicar o tempo de exposição automática e optimização de contraste específico para o equipamento utilizado. </li><li> Adquirir imagens de lapso de tempo usando a ferramenta &#39;Aquisição&#39; na barra de ferramentas (Aquisições multidimensionais - Time) utilizando 40 ciclos de 1.000 imagens / seg. Salve as imagens em um formato de arquivo de imagem apropriado. </li><li> Processar imagens usando software de análise ImageJ para medir a área de sinal fluorescente por imagem. Definir o limite para definir valores de limite inferior e superior, segmentando imagens de escala de cinza para features de interesse. Identificar a região de interesse (vaso sanguíneo) e medir a área limitada para o limiar e a região de interesse. Compare a adesão bacteriana, expressa em área fluorescente usando qualquer software de estatística ou gráficos. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Cardiovasc+Ther%22%5BJournal%5D)">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li>
<li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%3A+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li>
<li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor%E2%80%93binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li>
<li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li>
<li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin%2C+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%2FFEBS%22%5BJournal%5D)">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+activated+platelets+assist+THP-1+monocytoid%2Fendothelial+cell+interaction+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress.</a> Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).</li>
<li>Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+von+Willebrand+factor-binding+protein+%28vWbp%29+of+Staphylococcus+aureus+is+a+coagulase%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase.</a> FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).</li>
<li>Friedrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylocoagulase+is+a+prototype+for+the+mechanism+of+cofactor-induced+zymogen+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation.</a> Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).</li>
<li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+formation+by+staphylothrombin+facilitates+Staphylococcus+aureus-induced+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).</li>
<li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+staphylothrombin-mediated+fibrin+deposition+in+catheter-related+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections.</a> J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Krötz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li>
<li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A tensão de cisalhamento é um fator crucial para a adesão bacteriana início à parede do vaso e para a geração subseqüente de endovascular ou vegetações endocárdicas e infecções metastáticas 4,5. Descrevemos complementar in vitro e em modelos in vivo para estudar a patogénese de infecções endovasculares sob tensão de corte fisiológicas. Estes modelos nos permitiram identificar proteína de ligação do fator de von Willebrand (vWbp) como o principal S. proteína aureus para interagir sob fluxo com uma parede vascular lesada expondo VWF 4. Infecções endovasculares, e endocardite infecciosa em particular, são motivo de preocupação não só devido à falência de órgãos induzida pela sepse e morte, mas também por causa de metastáticos (&#39;&#39;) complicações locais e distantes. Para causar endocardite infecciosa e infecções metastáticas, as bactérias têm a aderir à parede do vaso e, portanto, resistir à tensão de corte do fluxo de sangue. Maisestudos sobre factores de virulência bactérias foram realizados em condições estáticas. No entanto, essas interações estabelecidas podem não resistir a forças de cisalhamento e estudos em condições de escoamento pode revelar novos fatores, previamente desconhecidos em interação bactéria-hospedeiro. Utilizando a câmara de fluxo micro-Paralelamente, e outros mostraram a importância de VWF para adesão vascular. Sob tensão de cisalhamento, VWF desenvolve-se progressivamente a partir de sua estrutura globular de descanso, e expõe o domínio A1 que interage com as plaquetas através de seu receptor GPIb 6. Câmaras de fluxo têm sido amplamente utilizados para estudar a função plaquetária 7. Notavelmente, também S. aureus adesão sob fluxo requer VWF, e em particular o domínio A1 que está exposto em cima de cisalhamento. Identificamos vWbp para mediar a ligação VWF. vWbp é uma coagulase que contribui para S. aureus fisiopatologia pela ativação da protrombina do hospedeiro. Staphylothrombin, os resulting complexo de um coagulase bacteriana e protrombina, converte fibrinogênio em fibrina insolúvel 8,9. Os nossos estudos demonstraram que vWbp não se limita a activar a protrombina, mas provoca a formação de agregados-bactérias para a fibrina das plaquetas, o que melhora a adesão aos vasos sanguíneos sob fluxo 4,10,11. O modelo de câmara de fluxo in vitro permite estudar os diferentes intervenientes na adesão bacteriana aos componentes celulares ou matriz. Factores de virulência da bactéria pode ser estudada usando mutantes ou bactérias inofensivas que expressam proteínas de superfície específicas. Em alternativa, os inibidores farmacológicos ou anticorpos de bloqueio podem ser adicionados ao meio na câmara de escoamento. O papel dos factores do hospedeiro, tais como diferentes constituintes da matriz extracelular podem ser estudados utilizando lamelas com diferentes revestimentos. As lamelas pode também ser coberta com células endoteliais, dos quais o estado de activação podem ser modulados pela adição de estimuladores específicos. Apata a partir da parede vascular, a contribuição das células do sangue do hospedeiro e proteínas do plasma pode ser estudado através da adição destes factores para o meio que se escoa. Assim, diferentes condições de complexidade crescente podem ser estudadas em condições padronizadas de fluxo laminar para desvendar as interacções que permitem que as bactérias de aderirem à parede vascular in vivo. Interacções identificados no modelo in vitro são posteriormente estudado num modelo animal para testar a sua relevância num organismo complexo. Outros modelos in vivo para estudar interacções dinâmicas sob fluxo foram descritas, tais como a dobra cutânea câmara de hamster dorsal 12 e o modelo cremaster 13. Em comparação, o modelo de perfusão mesentérica descrito aqui oferece várias vantagens devido à sua facilidade de utilização, a possibilidade de variar acolher fundo genético dos ratos e para avaliar as intervenções farmacológicas. Em conclusão, os modelos descritosoferecer a possibilidade de estudar proteínas de superfície não só de S. aureus, mas de muitos outros microorganismos em diferentes contextos de acolhimento, para entender melhor a patogênese das infecções vasculares.

Para estabelecer infecções endovasculares, os patógenos requerem um mecanismo para aderir ao endotélio, que reveste a parede do vaso e a superfície interna do coração, e persistir e estabelecer uma infecção apesar de serem expostos ao estresse de cisalhamento do sangue que flui rapidamente. O patógeno mais frequente que causa infecções endovasculares com risco de vida e endocardite infecciosa é o Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Várias moléculas adesivas bacterianas ligadas à superfície medeiam a adesão ao tecido hospedeiro interagindo com os componentes da matriz extracelular. Esses MSCRAMMs (componentes da superfície microbiana que reconhecem moléculas da matriz adesiva) reconhecem moléculas como fibronectina, fibrinogênio, colágeno e fator de von Willebrand (VWF). Os MSCRAMMs são importantes fatores de virulência de S. aureus e estão implicados na colonização e invasão do hospedeiro2. A maioria dos estudos sobre esses fatores de virulência foi realizada em condições estáticas e, portanto, pode não ser representativa de infecções humanas em que a adesão inicial da bactéria ocorre no sangue corrente. 
No caso de infecções da corrente sanguínea, as bactérias precisam superar as forças de cisalhamento do sangue que flui para se prender à parede do vaso. Modelos que investigam a interação entre bactérias e endotélio ou subendotélio sob condições de fluxo são, portanto, de particular interesse. 
Um estudo recente mostrou que a adesão de S. aureus aos vasos sanguíneos sob estresse de cisalhamento é mediada pelo FVW3. O FVW, uma proteína operacional de estresse de cisalhamento, é liberado das células endoteliais após a ativação. O FVW circulante liga-se às fibras colágenas da matriz subendotelial exposta. Nosso grupo relatou que a proteína de ligação ao fator de von Willebrand (vWbp) de S. aureus é crucial para a adesão mediada por cisalhamento ao FVW4. 
Neste artigo, apresentamos um modelo de câmara de fluxo in vitro onde a adesão bacteriana a diferentes componentes da matriz extracelular ou a células endoteliais pode ser avaliada. Para validar os achados dos dados in vitro, desenvolvemos um modelo in vivo que visualiza e quantifica a interação direta das bactérias com a parede do vaso e a formação de trombos bactérias-plaquetas na circulação mesentérica de camundongos, usando microscopia vascular intravital em tempo real.

<table><tbody><tr><td>Infusão de Cérebro Coração (BHI)</td><td>BD Plastipak&nbsp;</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Soja Tríptico (TSB)</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td>D-PBS</td></tr><tr><td>5(6)-carboxi-fluoresceína N-hidroxisuccinimidil éster&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21878-25MG-F</td><td>rotulagem fluorescente&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro bovino Albumina Fração V (BSA)</td> <td>Roch</td><td>10 735 086 001</td><td></td></tr><tr><td>Haemate-P</td><td>CSL Behring</td><td>PL 15036/0010</td><td>VWF</td></tr><tr><td>Horm colágeno</td><td>Takeda</td><td>10500</td><td>colágeno</td></tr><tr><td>1 poço PCA câmaras de cultura de células</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td>deslizamentos de plástico</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>283716</td><td>bruprenorfina</td></tr><tr><td>Anesketin (cloridrato de cetamina 115 mg/ml (100 mg/ml de cetaminum))</td><td>)Eurovet</td><td>BE-V136516</td><td>cetamina</td></tr><tr><td>XYL-M 2% (cloridrato de xilazina 23,32 mg/ml (20 mg/ml de xilazina))</td><td>VMD Arendonk</td><td>BE-V170581</td><td>xilazina</td></tr><tr><td>2 cateter intravenoso francês verde</td><td>Portex</td><td>200/300/010</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Baxter Healthcare</td><td>W7124</td><td></td></tr><tr><td>algodão swabs</td><td>International Medical Product</td><td>300230</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+-ionóforo solução A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522-10 MG</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge 1 ml seringa&nbsp; &nbsp;</td><td>BD Plastipak&nbsp;</td><td></td><td></td>300013</tr><tr><td>seringa de calibre 26 de 1 ml com agulha</td><td>BD Plastipak&nbsp;</td><td>300015</td><td>injeção intraperitoneal</td></tr><tr><td>Centrífuga 5810-R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.320</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de cobertura de vidro (24x50)</td><td>VWR</td><td>BB02405A11</td><td>Espessura N.º, 1</td></tr><tr><td>PHD 2000 Infusão</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702100</td><td>Bomba de infusão Harvard de alta precisão</td></tr><tr><td>Axio-observer DI</td><td>Carl-Zeiss</td><td>Microscópio</td><td></td></tr> <tr><td>de fluorescência invertidaSoftware</td><td>de Análise do Instituto Nacional de Saúde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Graphpad Prism 5,0</td> Software de Análise <td>Graphpad</td><td>AxioCam</td><td></td></tr><tr><td>MRm</td><td>Carl-Zeiss&nbsp;</td>Câmera <td></td><td>em preto e branco</td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o vaso de parede em condições de escoamento

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

A fim de causar infecções endovasculares e endocardite infecciosa, bactérias necessitam de ser capaz de aderir à parede do vaso ao mesmo tempo que exposta à tensão de corte do fluxo de sangue. Para identificar os fatores bacterianos e do hospedeiro que contribuem para a adesão vascular de microorganismos, modelos apropriados que estudam essas interações em condições de cisalhamento fisiológicas são necessários. Aqui, nós descrevemos um modelo in vitro de fluxo na câmara que permite investigar a adesão bacteriana às diferentes componentes da matriz extracelular ou a células endoteliais, e um modelo de microscopia intravital que foi desenvolvido para visualizar diretamente a aderência inicial das bactérias para a circulação in vivo splanchnic . Estes métodos podem ser utilizados para identificar os factores bacterianas hospedeiras e necessárias para a adesão de bactérias sob fluxo. Nós ilustrar a relevância da tensão de cisalhamento e o papel do fator von Willebrand para a adesão de Staphylococcus aureus utilizando tanto in vitro e in vivo no modelo.

S. aureus adesão ao VWF, matriz subendotelial e células endoteliais é um fenômeno dependente tensão de cisalhamento Para enfatizar o papel da tensão de cisalhamento na interação entre S. aureus e VWF, foi realizada ao longo de VWF perfusões lamelas revestidas com diferentes taxas de corte (uma vista geral esquemática do modelo de perfusão in vitro é apresentado na Figura 1. A adesão de S. aureus para o vWF aumentou com o aumento das taxas de cisalhamento de 250 s-1 para 2000 s-1 (Figura 2), indicando que as forças de cisalhamento elevadas, mas não inibem a reforçar a adesão de bactérias a VWF. A fim de investigar a contribuição de VWF a aderência bacteriana ao colagénio, o principal componente da matriz subendotelial, que perfundido marcado fluorescentemente S. aureus ao longo do colagénio na presença ou ausência de VWF. Na ausência do vWF, adesão de S. umaUreus ao colágeno diminuiu com o aumento das taxas de cisalhamento. No entanto, quando VWF estava presente no meio, a adesão de S. aureus aumentou com o aumento da velocidade de cisalhamento (Figura 3). O modelo de fluxo in vitro também nos permite verificar a adesão das bactérias às células endoteliais sob fluxo. Nós perfundidos com HUVECs marcado fluorescentemente S. aureus a taxas de corte de 500 a 2000 s-1. Onde indicado, células HUVEC foram activadas com um Ca 2+ -ionophore, para provocar a libertação de VWF. Ativação de células endoteliais ea liberação subseqüente VWF, aumento da adesão de S. aureus (Figura 4A), que se formou padrões típicos de &quot;cadeia&quot; como-marcado por fluorescência de agregados bacterianos alinhadas na direcção da força de corte (Figura 4B), sugerindo a ligação das bactérias ao longo de uma molécula de VWF esticado linear. Inicial in vivoa aderência de bactérias nas veias splanchnic é mediada por VWF Desde S. aureus é capaz de aderir a VWF, utilizou-se ratinhos de tipo selvagem (vWF + / +) e ratinhos deficientes em VWF (vWF - / -) para investigar a aderência de bactérias à parede do vaso activadas in vivo. Videomicroscopia em tempo real de veias esplâncnicas permitiu a visualização in vivo de circular marcado fluorescentemente S. aureus (vista geral esquemática do sistema de perfusão in vivo é representado na Figura 5). Depois da activação farmacológica do endotélio por Ca 2+ -ionophore, observou-se uma rápida acumulação local de bactérias individuais e agregados das bactérias à parede do vaso de ratinhos WT (suplementar vídeos 1 e 2). Quase nenhuma aderência de bactérias foi observada na parede do vaso de vWF activado -deficient ratinhos (suplementar Vídeo 3) em comparação com a adesão em ratinhos WT (Figura 6). A ausência de VWF diminui a capacidade de S. aureus para aderir à parede do vaso activado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figura 1. Uma representação esquemática do modelo de fluxo in vitro. O modelo de fluxo em um modelo in vitro é multifuncional, que permite o estudo de diferentes mecanismos dependentes de cisalhamento, tal como a adesão bacteriana à matriz subendotelial, mas também a formação de trombos. A câmara de fluxo micro-paralelo é colocada sobre uma lamela (plástico ou vidro) com diferentes revestimentos de proteínas e células endoteliais. A adesão de bactérias diferentes (laranja e pontos cinzentos) podem ser analisados, e o impacto da presença de proteínas do plasma, plaquetas e sangue total pode ser avaliada. Marcadores fluorescentes para plaquetas (azul) ou ovais fibrinogbr (cordas azul) pode ser utilizado em combinação com inibidores de diferentes formas ovais (pretas) para distinguir factores bacterianos e hospedeiros. Imagens representativas de adesão bacteriana de S. aureus para revestimento de colágeno na presença (parte inferior) ou ausência (superior) do VWF são mostradas (barra de escala é de 100 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Figura 2. Adesão de S. aureus para VWF aumenta com o aumento da velocidade de cisalhamento. perfusão micro-câmara de fluxo paralelo através revestido de VWF (50 ug / ml) com marcado fluorescentemente S. aureus Newman a taxas de corte de 250 a 2000 s -1 (seg-1) em meio (n&gt; 5). Todos os resultados são expressos como média ± SEM. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Figura 3. Adesão de S. aureus ao subendotélio é cisalhamento e VWF dependente. perfusão câmara de fluxo Micro-paralelo sobre colágeno revestido (160 ug / ml) com fluorescente etiquetado S. aureus Newman a taxas de corte de 250 a 2000 s -1 em média (n&gt; 5). VWF (60 ug / ml) estava presente no meio onde indicado. Todos os resultados são expressos como média ± SEM. ** P &lt;0,01. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Figura 4. A adesão de S. aureus às células endoteliais activadas é perfusão câmara de fluxo de cisalhamento dependente. Micro-paralela sobre as células endoteliais. (A) As células endoteliais da veia umbilical humana foram activadas com o Ca2 + Uma -ionophore23187 (0,1 mM) seguido de uma perfusão de 10 minutos marcado por fluorescência S. aureus Newman a taxas de corte de 500 a 2000 s -1 em média (n&gt; 5). Todos os resultados são expressos como média ± SEM. * P &lt;0,05. (B) Imagem de micro-câmara de fluxo paralelo perfusão sobre HUVECs activadas com S. aureus a uma taxa de cisalhamento de 1,000 sec -2. S. aureus forma cordas de comprimento ± 200 microns, o que sugere adesão a multímeros VWF (barra de escala é de 100 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Figura 5. Uma visão esquemática do modelo de perfusão mesentérica in vivo. Um cateter na veia jugular direita (linha amarela) é inserido para a administração de fluorbactérias escently marcados (pontos laranja), anestésicos ou outros componentes adicionais tais como inibidores farmacêuticas e anticorpos. A cavidade peritoneal é aberto e o mesentério é espalhado para visualizar os vasos sanguíneos (venosas e arteriais) sob um microscópio de fluorescência. Depois da activação farmacológica do endotélio por uma -ionophore Ca2 +, o que induz a libertação de VWF, as bactérias podem ser injectados através do cateter da veia jugular. Microscopia vídeo intravascular em tempo real permite a visualização in vivo de circulação de bactérias fluorescente etiquetado e conseqüente formação de bactérias em plaquetas trombos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Figura 6. A adesão inicial de S. aureusao endotélio activado in vivo é mediada por VWF In vivo modelo de perfusão venosa mesentérica com C57Bl / 6- VWF + / + e C57Bl / 6- VWF -. / - ratos. A adesão das marcado fluorescentemente S. aureus para a parede do vaso activados localmente é significativamente mais baixa em vWF - / - ratos. Todos os resultados são expressos como média ± SEM. *** P &lt;0,001, n&gt; 7. <img alt="Vídeo Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Vídeo 1: aderência em tempo real de S. aureus à parede do vaso ativado em VWF + / + camundongos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> Vídeo 2: em tempo real a formação de agregados e embolização de S. aureus em VWF + / + camundongos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> <img alt="Figura 3 Vídeo" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Vídeo 3: adesão em tempo real de S. aureus à parede do vaso ativado em VWF - In vivo modelo de camundongos perfusão mesentérica com VWF + / + e VWF - - /. / - ratos. Cinco ul de uma Ca 2+ -ionophore (10 mM) foi aplied à região do leito vascular visualizada. Uma suspensão de carboxi-fluoresceína-rotulados S. aureus foi injectada através do cateter da jugular. A circulação mesentérica foi visualizada sob um microscópio invertido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a>

Para estudar a interação das bactérias com os vasos sanguíneos sob tensão de cisalhamento, são descritas uma câmara de fluxo e um modelo de microscopia intravital mesentérica in vivo que permite dissecar os fatores bacterianos e hospedeiros que contribuem para a adesão vascular.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar a interação entre bactérias e o endotélio e subendotélio sob estresse cisalhante. Isso é alcançado por meio da marcação fluorescente de bactérias para visualizá-las em tempo real usando microscopia de vídeo como segundo passo. Uma câmara de fluxo in vitro é utilizada para estudar os diferentes participantes envolvidos na adesão de bactérias em movimento a componentes celulares ou matriciais.Em seguida, as interações identificadas no modelo in vitro são estudadas no modelo de perfusão mesentérica in vivo para testar sua relevância em um organismo complexo; os resultados mostram que Staphylococcus aureus é capaz de aderir a células endoteliais ativadas e à subendotélio sob estresse cisalhante. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que ela inclui tanto um modelo in vitro quanto um modelo in vivo, que são complementares para estudar a patogênese de infecções endovasculares sob estresse cisalhante. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de doenças infecciosas e biologia vascular, como a forma pela qual a endocardite infecciosa e infecções metastáticas se estabelecem sob estresse cisalhante fisiológico, demonstrando um procedimento por meio de Be Malin, uma técnica especializada em trabalho com animais do nosso laboratório. Comece preparando o corante fluorescente utilizado para rastrear as bactérias.Adicione 150 microlitros de uma solução estoque fluorescente de carboxi em 850 microlitros de água grau laboratorial e misture. Armazene a solução protegida da luz a menos 20 graus Celsius até o momento do uso. Em seguida, pelletize um cultivo de cinco mililitros de S reus.Bactérias cultivadas durante a noite em caldo de soja triptica são lavadas uma vez com PBS e então ressuspendidas. Ao novo pellet em 800 microlitros de PBS, adicione 200 microlitros da solução de corante para experimentos de perfusão in vitro, ou 400 microlitros da solução de corante. Para experimentos in vivo, cubra os tubos com papel alumínio para evitar o desbotamento fotoinduzido do corante e incube em agitador durante 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione solução de albúmina sérica bovina a 6% em PBS à mistura para bloquear a ligação não específica. Verifique a concentração de células utilizando citometria óptica e dilua as bactérias em PBS em várias concentrações, dependendo da aplicação. Após a diluição, proteja os tubos da luz e coloque-os no gelo.Dilua o fator von Willebrand em água de grau laboratorial até uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Também dilua o colágeno em solução isotônica de glicose até uma concentração final de 160 microgramas por mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros de cada revestimento sobre uma tira de paraforma.Coloque as lamínulas sobre as gotas para revesti-las com as proteínas. Incube as lamínulas em um recipiente umidificado por quatro horas à temperatura ambiente. Em seguida, levante cuidadosamente as lamínulas do paraforma com uma agulha romba e monte a lamínula na parte inferior de uma câmara de fluxo para experimentos com células endoteliais; revista lamínulas plásticas com um mililitro de uma solução de gelatina a 1% em PBS e incube-as por 30 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, semeie células endoteliais de veia umbilical humana sobre lâminas de plástico revestidas com gelatina e cultive-as até atingirem 70 a 80% de confluência. Monte a lamínula revestida com proteína ou a lâmina de plástico revestida com células endoteliais na parte inferior da câmara de fluxo. Em seguida, conecte os tubos de entrada e saída à parte superior da câmara de fluxo e conecte o tubo de saída a um recipiente de resíduos.Coloque suavemente a parte superior da câmara de fluxo sobre a parte inferior e monte a câmara de fluxo, evitando a formação de bolhas de ar. Injete um mililitro de meio através da câmara para garantir que não haja vazamentos e para remover a solução de revestimento em excesso.Em seguida, configure a bomba de infusão para uma seringa de um mililitro de modo que o fluxo seja de 75 microlitros por minuto. Trabalhando em um ambiente escuro, encha uma seringa de um mililitro com um mililitro de bactérias marcadas com fluorescência e coloque-a na bomba de infusão. Conecte a saída da seringa à entrada da câmara de fluxo.Tendo cuidado para evitar bolhas de ar, inicie a bomba de infusão por 10 minutos a 75 microlitros por minuto. Após 10 minutos, remova a primeira seringa e conecte uma seringa de um mililitro contendo PBS ou DMEM ao tubo de entrada. Inicie a infusão, bombeie e lave por 10 minutos para remover quaisquer bactérias não ligadas.Após a lavagem, mantenha a bomba de infusão ligada e adquira pelo menos 15 imagens em preto e branco, utilizando um tempo de exposição de 1,5 segundos em locais aleatórios, distribuídos pela superfície revestida da câmara de fluxo. Utilizando um programa de análise de imagem como o Image J, subtraia o fundo para remover fundos contínuos e suaves da imagem e defina o limiar, ajustando os valores inferior e superior de limiarização, o que segmenta as imagens em escala de cinza em características de interesse. Em seguida, meça a área limitada ao limiar recém-criado e salve esse valor, conhecido como área fluorescente, para cada amostra.Jejue os camundongos por oito semanas na noite anterior ao experimento para reduzir o movimento intestinal. No dia do experimento, comece injetando 0,1 miligramas de buprenorfina por quilograma de peso corporal como analgésico. Em seguida, anestesie o camundongo e aplique pomada nos olhos.Coloque o camundongo sobre a placa aquecida com controle térmico sob o microscópio estereoscópico e verifique se o animal não apresenta reflexo palpebral. Faça uma incisão de um centímetro paralela à veia jugular. Remova o músculo cervical do lado direito e, em seguida, isole a veia jugular dos tecidos circundantes.Insira um cateter intravenoso de dois French na veia jugular direita e fixe-o no lugar usando pontos de sutura. Em seguida, faça uma incisão abdominal mediana para abrir a cavidade peritoneal. Coloque o camundongo sobre o lado direito em uma placa transparente e fixe a cânula com fita adesiva.Puxe suavemente os intestinos utilizando cotonetes e espalhe o mesentério. Para visualizar a circulação arteriolar e capilar mesentérica. Coloque uma bolsa térmica sobre o camundongo para prevenir hipotermia e adicione 500 microlitros de NaCl 0,9% sobre os intestinos a cada 30 minutos para evitar a desidratação do tecido.Use cotonetes para imobilizar os vasos e visualizá-los em um microscópio invertido. Em seguida, aplique topicamente cinco microlitros de uma solução de 10 milimolar de ionóforo de cálcio quatro dissolvido em DMSO. Isso ativará a liberação do fator de Von Willebrand pelas células endoteliais dos vasos.Após 10 segundos, injete 100 microlitros das bactérias marcadas com fluorescência através do cateter jugular. Neste momento, inicie a aquisição de imagens em lapso de tempo, adquirindo imagens em lapso de tempo com a ferramenta de aquisição na barra de ferramentas usando 40 ciclos de 1000 imagens por segundo. Após a conclusão da aquisição de imagens, eutanazie o camundongo de acordo com as diretrizes institucionais.Salve as imagens em um formato de arquivo de imagem apropriado e, em seguida, processe-as usando o software de análise ImageJ, conforme descrito anteriormente, para enfatizar o papel da tensão de cisalhamento na adesão bacteriana. Foram realizadas perfusões de Staphylococcus aureus em diferentes taxas de cisalhamento sobre lamínulas revestidas com fator de Von Willebrand. À medida que as taxas de cisalhamento aumentam, a adesão bacteriana também aumenta, indicando que forças de cisalhamento elevadas não inibem, mas reforçam a adesão das bactérias à proteína. Na ausência do fator de Von Willebrand, a adesão de Staphylococcus aureus ao colágeno diminuiu com o aumento das taxas de cisalhamento.No entanto, quando o fator Von Vand estava presente no meio, a adesão das bactérias aumentou com a elevação das taxas de cisalhamento; células endoteliais ativadas com um ionóforo de cálcio para liberar o fator vand mostraram adesão bacteriana significativamente maior do que as células não ativadas. Além disso, as bactérias formaram padrões típicos semelhantes a filamentos de aglomerados bacterianos marcados com fluorescência, alinhados na direção da força de cisalhamento, sugerindo a ligação das bactérias ao longo de uma molécula de VWF esticada linearmente. Para testar o efeito do fator Von Vbr in vivo, as células endoteliais da circulação mesentérica foram ativadas para liberar o fator von Vbr, e então células bacterianas marcadas com fluorescência foram introduzidas na corrente sanguínea. As bactérias aderiram localmente à parede vascular ativada e formaram agregados.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão melhor de como investigar a interação entre bactérias e a parede do vaso sob tensão de cisalhamento, marcando fluorescentemente as bactérias e visualizando-as tanto em uma câmara de fluxo in vitro quanto em um modelo de perfusão mesentérica intravital in vivo. Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de infecções cardiovasculares explorarem a interação entre patógenos e a parede do vaso na endocardite infecciosa e em infecções metastáticas.

in-vitro-vivo-model-to-study-bacterial-adhesion-to-vessel-wall-under

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este é um método para visualizar a adesão de leucócitos ao endotélio em vasos pressurizados colhidas. A técnica permite estudar de adesão vascular sob fluxo de cisalhamento com diferentes pressões intraluminal até 200 mmHg, assim, imitam-ing as condições fisiopatológicos da pressão arterial elevada.

Imagem adesão leucocitária ao endotélio vascular na pressão intraluminal de alta

Durante o processo de infecção, um passo fundamental é a adesão de patógenos com células do hospedeiro. Na maioria dos casos esta etapa de adesão ocorre na presença de estresse mecânico gerado pelo fluxo de líquido. Descrevemos uma técnica que apresenta tensão de cisalhamento como um parâmetro importante no estudo da adesão bacteriana.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

Fonte: Ditkowski, B., et al. Um modelo in vitro de um sistema de perfusão de placas paralelas para estudar a adesão bacteriana a tecidos de enxerto. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o método de usar uma câmara de fluxo de placas paralelas para perfundir bactérias marcadas fluorescentemente sobre tecidos de enxerto vascular, permitindo uma análise controlada da adesão bacteriana e da patogênese precoce sob condições de fluxo de cisalhamento.

Modelo in vitro de fluxo paralelo de placas para estudar a adesão bacteriana em biópsia de tecido

Fonte: Calatayud Arroyo, M., et al. Avaliação da Viabilidade de um Consórcio Bacteriano Sintético na Interface In Vitro Intestino-Microrganismo. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra um modelo intestino-microrganismo in vitro para estudar a viabilidade bacteriana. Uma cocultura de células Caco-2 e HT29-MTX é incubada com bactérias pré-tratadas sob condições digestivas simuladas. A integridade da barreira epitelial é avaliada usando resistência elétrica transepitelial, e frações do meio, muco...

Modelo intestinal in vitro para avaliar adesão bacteriana e internalização

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Relatamos um método in vitro que permite a quantificação do número real de células adesivas dentro de uma monocamada de células endoteliais.

A quantificação da Adesividade celular endotelial<em&gt; In Vitro</em

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Descrevemos um in-house projetado em vitro fluxo modelo de câmara, que permite a investigação de adesão bacteriana ao enxerto de tecidos.

Um modelo In Vitro de um sistema de perfusão paralelo-placa para estudar a aderência bacteriana para enxertar tecidos

Apresentamos um modelo de doença vascular in vitro para investigar interações sanguíneas inteiras com o endotélio derivado do paciente. Este sistema permite o estudo de propriedades trombogênicas das células endoteliais primárias em várias circunstâncias. O método é especialmente adequado para avaliar em trombogenicidade situ e terapia anticoagulação durante diferentes fases de coagulação.

Modelo de doença microfluida in vitro para estudar interações endoteliais de sangue inteiro e dinâmica do coágulo sanguíneo em tempo real

Aprenda a investigar a adesão bacteriana em vasos sanguíneos sob estresse de cisalhamento usando modelos in vitro e in vivo com Staphylococcus aureus. Este método permite visualizar em tempo real as interações patógeno-hospedeiro.

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