In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar a interação entre bactérias e o endotélio e o subendotélio sob estresse absoluto. Isso é obtido marcando fluorescentemente as bactérias para visualizá-las em tempo real usando microscopia de vídeo como segunda etapa. Uma câmara de fluxo in vitro é usada para estudar os diferentes atores envolvidos na adesão de bactérias em fluxo a componentes celulares ou de matriz.

Em seguida, as interações identificadas no modelo in vitro são estudadas no modelo de perfusão mesentérica in vivo para testar sua relevância em um organismo complexo, os resultados mostram que o Staphylococcus reus é capaz de aderir às células endoteliais ativadas e ao subendotélio sob estresse de cisalhamento. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que ela inclui um modelo in vitro e um in vivo, que são complementares para estudar a patogênese de infecções endovasculares sob estresse absoluto. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo das doenças infecciosas e da biologia vascular, como a forma como a endocardite infecciosa infecciosa e as infecções metastáticas são estabelecidas sob estresse fisiológico absoluto, demonstrando um procedimento através de ser Malin procura um técnico especializado em trabalho com animais de nosso laboratório Comece preparando o corante fluorescente usado para rastrear as bactérias.

Adicione 150 microlitros de uma solução fluorescente carboxi padrão em 850 microlitros de água de grau laboratorial e misture. Armazene a solução protegida da luz a menos 20 graus Celsius até que seja necessária. Em seguida, uma cultura de cinco mililitros de S reus.

As bactérias cultivadas durante a noite em caldo de soja tríptico são lavadas uma vez com PBS e depois ressuspendem. O novo pellet em 800 microlitros de PBS adiciona 200 microlitros da solução de corante às células ressuspensas para experimentos de perfusão in vitro, ou 400 microlitros da solução de corante. Para experimentos in vivo, cubra os tubos com papel alumínio para evitar o fotobranqueamento do corante e incube em um agitador por 30 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione solução de albumina de soro bovino a 6% em PBS à mistura para bloquear a ligação não específica. Verifique a concentração de células usando citometria óptica e dilua as bactérias em PBS em várias concentrações, dependendo de sua aplicação. Depois de diluídos, proteja os tubos da luz e coloque-os no gelo.

Diluir o fator von Vand em água de laboratório até uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Diluir também o colágeno em solução isotônica de glicose até uma concentração final de 160 microgramas por mililitro. Em seguida, coloque 200 microlitros de cada revestimento em uma tira de paraforma.

Coloque as lamínulas em cima das gotículas para cobri-las com as proteínas. Incube a lamínula em um recipiente umidificado por quatro horas em temperatura ambiente. Em seguida, levante cuidadosamente as lamínulas do paraforme com uma agulha romba e monte a lamínula na parte inferior de uma câmara de fluxo para experimentos com células endoteliais, cubra as lamínulas plásticas com um mililitro de uma solução de gelatina a 1% em PBS e incube-as por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, semeie células endoteliais da veia umbilical humana nas tiras de plástico revestidas de gelatina e cultive-as até 70 a 80% de fluência. Monte a lamínula revestida com proteína ou a lama plástica revestida com células endoteliais na parte inferior da câmara de fluxo. Em seguida, conecte a tubulação de entrada e saída à parte superior da câmara de fluxo e conecte a tubulação de saída a um recipiente de resíduos.

Coloque delicadamente a parte superior da câmara de fluxo na parte inferior e monte a câmara de fluxo. Evitando a formação de bolhas de ar. Injete um mililitro de meio através da câmara para se certificar de que a câmara não está vazando e para remover o excesso de solução de revestimento.

Em seguida, configure a bomba de infusão para uma seringa de um mililitro para que ela flua a 75 microlitros por minuto. Trabalhando em uma sala escura, encha uma seringa de um mililitro com um mililitro de bactérias marcadas com fluorescência e coloque-a na bomba de infusão. Conecte a saída da seringa à entrada da câmara de fluxo.

Tomando cuidado para evitar bolhas de ar, ligue a bomba de infusão por 10 minutos a 75 microlitros por minuto. Após 10 minutos, remova a primeira seringa e conecte uma seringa de um mililitro contendo PBS ou DMEM ao tubo de entrada. Inicie a infusão, bombeie e enxágue por 10 minutos para remover qualquer bactéria não ligada.

Depois de enxaguada, deixe a bomba de infusão ligada e tire pelo menos 15 imagens em preto e branco usando um tempo de exposição de 1,5 segundos em locais aleatórios, espalhadas sobre a superfície revestida da câmara de fluxo. Usando um programa de análise de imagem como o Image J.Subtraia o fundo para remover fundos contínuos suaves da imagem e defina o limite para definir os valores de limite inferior e superior, que segmentam as imagens em escala de cinza em recursos de interesse. Em seguida, meça a área limitada ao limite recém-criado e salve esse valor conhecido como área fluorescente para cada amostra.

Testado rapidamente em camundongos de oito semanas de idade na noite anterior ao experimento para reduzir o movimento intestinal. O dia do experimento começa injetando 0,1 miligramas de buprenorfina por quilograma de peso corporal como analgésico. Em seguida, anestesie o mouse e aplique pomada nos olhos.

Coloque o mouse na almofada de aquecimento termocontrolada sob o escopo de dissecação e teste se o mouse não mostra reflexo de pétala. Faça uma incisão de um centímetro paralela à veia jugular. Remova o lado direito do músculo cervical e, em seguida, isole a veia jugular do tecido circundante.

Insira um cateter intravenoso de dois French na veia jugular direita e prenda-o no lugar usando pontos. Em seguida, faça uma incisão abdominal na linha média para abrir a cavidade peritoneal. Coloque o mouse do lado direito em uma placa transparente e prenda a cânula com fita adesiva.

Retire suavemente os intestinos usando cotonetes e espalhe o mesentério. Visualizar a circulação arteriolar e ular mesentérica. Coloque uma compressa quente sobre o mouse para evitar hipotermia e coloque 500 microlitros de 0,9% de NACL nos intestinos a cada 30 minutos para evitar a desidratação do tecido.

Use cotonetes para imobilizar os vasos e visualizá-los sob um microscópio invertido. Em seguida, aplique cinco microlitros de uma solução de 10 milimolares de cálcio iono quatro dissolvido em DMSO. Isso ativará a liberação de Von Villa Brandt, fator das células endoteliais nos vasos.

Após 10 segundos, injete 100 microlitros da bactéria marcada com fluorescência através do cateter jugular. Neste momento, comece a tirar imagens com lapso de tempo, adquira imagens com lapso de tempo usando a ferramenta de aquisição na barra de ferramentas usando 40 ciclos de 1000 imagens por segundo. Assim que a aquisição da imagem estiver concluída, eutanasiar o camundongo de acordo com as diretrizes institucionais.

Salve as imagens em um formato de arquivo de imagem apropriado e, em seguida, processe as imagens usando o software de análise de imagem J conforme descrito anteriormente para enfatizar o papel do estresse absoluto na adesão bacteriana, as perfusões de Staphylococcus aureus foram realizadas em diferentes taxas de cisalhamento em lamínulas revestidas com fator Von Vbr. À medida que as taxas aumentam, o mesmo acontece com a adesão bacteriana, indicando que altas forças de cisalhamento não inibem, mas reforçam a adesão das bactérias à proteína. Na ausência do fator Von Vand, a adesão do staphylococcus aureus ao colágeno diminuiu com o aumento das taxas de cisalhamento.

No entanto, quando o fator Von Vand estava presente no meio, a adesão das bactérias aumentou com o aumento das taxas de cisalhamento, as células endoteliais ativadas com um fator de cálcio iono quatro para liberar vand mostraram significativamente mais adesão bacteriana do que as células não ativadas. Além disso, as bactérias formaram padrões típicos de aglomerados bacterianos marcados com fluorescência que foram alinhados na direção da força pura, sugerindo a ligação de bactérias ao longo de uma molécula de VWF esticada linear para testar o efeito do fator Von Vbr in vivo células endoteliais da circulação mesentérica foram ativadas para liberar o fator von Vbr, e então células bacterianas marcadas com fluorescência foram introduzidas na corrente sanguínea. As bactérias aderiram localmente à parede do vaso ativado e formaram agregados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma melhor compreensão sobre como investigar a interação com as bactérias e a parede do vaso na tensão de cisalhamento, marcando fluorescentemente as bactérias e visualizando-as em uma câmara de fluxo in vitro e em um modelo de profusão mesentérica intravital in vivo. Essa técnica abre caminho para que pesquisadores da área de infecções cardiovasculares explorem a interação entre patógenos e a parede do vaso na endocardite infecciosa e nas infecções metastáticas.