Name: Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a realizar co-imunoprecipitação para estudar a interação entre a proteína antiviral Mx1 e a nucleoproteína do vírus influenza A em células humanas. Este método revela mecanismos de resistência viral essenciais para pesquisas em virologia.

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Este trabalho foi apoiado por FWO-Vlaanderen, o projeto IOF IOF10 / StarTT / 027 e da Universidade de Ghent Especial Research Grant BOF12 / GOA / 014.

Nota: O seguinte protocolo de transfecção e co-imunoprecipitação é estabelecida para um formato de placa de Petri 9 cm. Outros formatos também são possíveis após a escala do protocolo. 1. Sementeira do rim embrionário humano (HEK) Células 293T <ol><li> Semente da células HEK293T um dia antes da transfecção a 1,2 x 10 6 culas por 9 centímetros de Petri em 12 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 2 mM de L-glutamina, 0,4 mM de Na-piruvato, 0,1 aminoácidos não essenciais mM, 100 U / ml de penicilina e 0,1 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Crescer as células 16 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Inspeccione visualmente a morfologia e a viabilidade das células com um microscópio de luz invertida antes da transfecção. As células necessitam de ser sub-confluente para a eficiência de transfecção óptima. </li></ol> 2. O cálcio-fosfato de transfecção de células HEK293T Nota: Use 0,5-1 mg de pCAXL-NP ou vazio plasmídeo pCAXL em combinação com 1-3 mg de pCAXL-Mx1 por 9 centímetros prato. Use uma quantidade igual de DNA total plasmídeo em todas as amostras; ajustar com plasmídeo vazio, se necessário. <ol><li> Preparar os seguintes tampões de transfecção: <ol><li> Prepare de Tris-EDTA (TE) com concentrações de 1,0 mM de Tris-HCl, pH 8,0 e EDTA 0,1 mM, pH 8,0. </li><li> Prepare BS / HEPES com concentrações de 25 mM de HEPES (5,96 g / L, 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico), NaCl 274 mM (16 g / l), KCl 10 mM (0,74 g / L), NaHPO 4 1,5 mM · 12H 2 O (0,5 g / L) e 11,1 mM de dextrose (2 g / L). Ajustar o pH a 7,05. </li><li> Prepare CaCl2 / com as concentrações de HEPES 1,25 M CaCl 2 2H 2 O (183,8 g / L) e tampão HEPES 125 mM (29,79 g / L). Ajustar o pH a 7,05 com NaOH. </li></ol></li><li> Aquecer os buffers de transfecção, a 37 ° C antes da utilização. </li><li> Preparar as amostras diluindo o plasmídeo de ADN de plasmídeo em 600 ul de TE.Preparar estas misturas em poços de uma placa de 6 poços. </li><li> Adicionar 150 mL de CaCl2 / HEPES de forma sábia soltar para as amostras de plasmídeos e misture pipetando três vezes para cima e para baixo. </li><li> Preparar a solução de transfecção por adição gota a gota, a solução de plasmídeo (DNA TE + + CaCl 2 / HEPES; 750 ul) a 750 ul de tampão de BS / HEPES fornecidos em uma nova placa de 6 poços. Distribuir a solução de plasmídeo uniformemente sobre o poço de tampão contendo completa BS / HEPES. </li><li> Agitar a solução de transfecção sobre um agitador de placas durante 90 segundos a 1000 RPM. </li><li> Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar a solução de transfecção (1,5 ml) gota a gota às células. Usar uma micropipeta P1000 a escorrer a solução de transfecção nas células. Dispersar a mistura sobre a completa nove centímetros de Petri e agitar a placa muito suavemente. </li><li> Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 6 h. Em seguida, retire o meio por aspiração e substitua imediatamente with 12 ml de meio fresco, pré-aquecido. Adicionar cuidadosamente a meio fresco às células para evitar a separação de células. Para isto, segurar a ponta da pipeta contra o lado do poço e suavemente empurrar para fora do meio. </li><li> Incubar as células durante mais 16 horas adicionais a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 3. Co-imunoprecipitação Nota: Execute o co-imunoprecipitação 24 horas após a transfecção. <ol><li> Preparação do tampão de baixo lise sal e tampão de lavagem de alta sal. <ol><li> Prepara-se uma solução estoque de 2 M de N-etilmaleimida (NEM) pesando a quantidade de NEM e dissolvendo-o em etanol absoluto. Preparar a solução estoque NEM fresco antes de usar. CUIDADO: NEM é muito tóxico, preparar e usar esta solução estoque em um exaustor. </li><li> Preparar tampão de lise de sal baixo a concentrações de 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM de NaCl, 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1% de NP40 e um cocktail de inibidores de protease (1 dissolver mesat em 50 ml de tampão de lise). Adicionar NEM até uma concentração final de 25 mM (isto é, diluir 1:80). Mantenha no gelo após a adição dos inibidores da protease e NEM. Nota: Sempre adicionar os inibidores da protease e NEM imediatamente antes da utilização. </li><li> Preparar um tampão de lavagem de alto teor salino a concentrações de 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM e 1% de NP40. Note-se que o tampão de lavagem de alto teor salino não contém NEM. </li></ol></li><li> Preparação de lisados ​​celulares. <ol><li> Remover o meio e lava-se as células com 2 ml de fosfato de gelo frio tamponado salino (PBS). Adicionar muito suavemente o tampão de lavagem, como células HEK293T desprendem facilmente. </li><li> Retire o PBS e adicionar 600 mL de tampão de lise sal baixo gelada por 9 centímetros de Petri. </li><li> Incubar as placas durante 20 min em gelo. Certifique-se de que as placas são mantidas horizontal, para assegurar a cobertura completa da superfície da placa com tampão de lise. Agitar suavemente as placas a cada 5 minutos. </li><li> Recolhe-se o lisado celular numa microcentrífuga de 1,5 mltubo e centrifuga-se durante 3 min a 4 ° C e 16.000 xg para sedimentar a fracção insolúvel. </li><li> Transferir a fracção solúvel, isto é, o lisado de células para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e manter em gelo. Imediatamente continuar com o protocolo de co-imunoprecipitação, para evitar a dissociação das proteínas que interagem. Executar todas as etapas seguintes, tanto quanto possível em gelo ou a 4 ° C para limitar a actividade proteolítica nos lisados. </li></ol></li><li> Geração de complexos imunes. Nota: Neste passo, a proteína de interesse está ligado pelo anticorpo apropriado. Para estudar a interacção NP-Mx1, utilizar um anticorpo monoclonal anti-NP do rato. <ol><li> Para cada amostra, misturar 135 ul de lisado com 2 ul de anticorpo monoclonal anti-NP e 113 ul de tampão de lise de sal baixo (volume total de 250 uL). Armazenar o lisado remanescente à temperatura de -20 ° C para posterior análise, tais como Western blotting, para documentar os níveis de expressão da intera supôsparceiros ction nas células transfectadas. Nota: Em alternativa, medir a concentração de proteína do ligado (por exemplo, com o reagente de Bradford) e utilizar uma quantidade fixa de proteína total, por exemplo, 400 ug, para cada lisado. </li><li> Incubar a mistura de anticorpo-lisado durante 3 horas numa roda giratória a 4 ° C. Este passo pode ser estendido para uma incubação de um dia para o outro. </li></ol></li><li> Preparação dos grânulos de proteína G. Nota: As esferas de proteína G são transportados e armazenados em etanol a 20% para a preservação. O grânulo-lama é normalmente constituída por 50% de partículas e estes grânulos têm de ser lavadas antes de serem usadas para imunoprecipitar os complexos imunes. <ol><li> Utilizar 50 ul de pérolas, isto é, 100 ul de talão-lama, para cada amostra. Lava-se a quantidade de esferas necessárias para todas as amostras do ensaio de co-imunoprecipitação de um tubo. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 ml para facilitar a pipetagem do grânulo-lama. </li><li> Centrifugar a proteína G talão-lama em 8.000 xg e 4 ° C durante 30 seg. Remover a solução de etanol e adicionar um volume igual de tampão de lise de baixa sal. Centrifugar a proteína G do grânulo-suspensão a 8000 xg e 4 ° C durante 30 seg e o sobrenadante remover suavemente. Repita este passo de lavagem 3 vezes. Nota: O tampão de lise de baixa sal usado para lavar as pérolas não necessitam de conter inibidores da protease ou NEM. </li><li> Estimar o volume de proteína G pérolas e adicione um volume igual de tampão baixo lise sal para fazer um novo 50% grânulo-lama em tampão baixo lise sal. </li><li> Para cada amostra, transferir 100 ul de talão-suspensão em um tubo de 1,5 ml fresco microcentrífuga e armazenar em gelo até à utilização. Ter cuidado para voltar a suspender o grânulo-lama antes de se dividir, como estas pérolas sedimentam rapidamente para o fundo do tubo. </li></ol></li><li> Immunoprecipitation dos complexos imunes pela proteína G pérolas e sua eluição. <ol><li> Antes de utilizar as esferas de proteína G para a imunoprecipitação, todos os tubos de centrifugação de 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C everificar, por inspecção visual de que existe uma quantidade igual de pérolas presente em todas as amostras. Se for necessário ajustar a quantidade de grânulos em algumas das amostras e centrifugar novamente. Descartar o sobrenadante. Tenha cuidado para não perturbar as proteínas G perla peletizadas. </li><li> Resumidamente, centrifugar os complexos imunes (isto é., Os lisados ​​com anticorpo, 250 ul) durante 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C para recolher a amostra completa, na parte inferior do tubo. Transferir os complexos imunes para as esferas de proteína G (50 uL). </li><li> Incubar 60 min sobre uma roda giratória a 4 ° C. Não incubar estes complexos imunitários mais do que 75 minutos com os grânulos para reduzir a ligação não específica de proteínas para as esferas de proteína G. </li><li> Centrifuga-se as esferas de proteína G (com complexos imunes ligados) durante 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C e remove-se os sobrenadantes. Tenha cuidado para não perturbar as proteínas G perla peletizadas. Opcional: armazenar estes sobrenadantes a 4 ° C ou -20 ° C para posterior análise,por exemplo, para estimar a quantidade de proteína não ligada. </li><li> Lavam-se as esferas de proteína G para aproximadamente 5 min com 900 ul de tampão de lise de sal elevado. Certifique-se de que as pérolas são completamente ressuspenso no tampão de lavagem para a lavagem óptima. Centrifuga-se as esferas de proteína G durante 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Repita este passo de lavagem 4 vezes. Tenha cuidado para não perturbar as esferas de proteína G peletizadas para evitar a perda de material imunoprecipitado. </li><li> Após o último passo de lavagem, adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x para os grânulos e aquecer a suspensão durante 10 min a 95 ° C para eluir as (co) proteínas imunoprecipitadas. <ol><li> Preparar 10 ml de tampão de Laemmli 6x com 1 g de dodecil sulfato de sódio, 3,5 ml de glicerol, 3,5 ml de 1 M de Tris-HCl a pH 6,8 e 420 ul de β-mercaptoetanol. Ajustar para um volume total de 10 ml por adição de água destilada. Dilui-se 3 vezes em água destilada para obter tampão Laemmli 2x. CUIDADO: &amp;# 946; mercaptoetanol é tóxico, preparar e usar tampão Laemmli em um exaustor. </li></ol></li><li> Após o aquecimento, centrifugar os grânulos de proteína G durante 30 segundos a 8000 xg e armazenar as amostras a 4 ° C (a curto prazo) ou -20 ° C (a longo prazo). </li></ol></li></ol> 4. Analisar o (co-) imunoprecipitou Proteínas <ol><li> Visualizar as proteínas presentes no ligado celular e o eluato de co-imunoprecipitação por SDS-PAGE e western blotting 20 21,22. Tipicamente carregar metade do eluato em gel de Laemmli. Tenha cuidado para não perturbar as esferas proteína G peletizadas quando recolha de amostras para carregamento de gel. Mx1 e expressão NP foram revelados com um anti-Mx1 e anticorpo anti-NP, respectivamente 14. As bandas foram detectadas com base quimioluminescência-HRP e um programador de película de raios-X. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O estudo da interacção entre proteínas antivirais e seus alvos virais é muito importante para compreender os detalhes do mecanismo antiviral destas proteínas. Isso pode dar novos insights sobre como os vírus e seus hospedeiros co-evoluído e ser a base para o desenvolvimento de novas estratégias antivirais. O protocolo de co-imunoprecipitação optimizado descrito aqui permite o estudo da interacção entre a proteína de rato e a sua Mx1 alvo viral, a proteína NP da gripe. O aspecto mais importante deste protocolo é a adição...

Resistência myxovirus (Mx) proteínas são uma parte importante da defesa imune inata contra patógenos virais. Estas proteínas são grandes GTPases dinamina-like que são induzidos por tipo I e tipo III interferons. Os genes Mx correspondentes estão presentes em quase todos os vertebrados em uma ou várias cópias e dos seus produtos de genes inibir uma vasta variedade de vírus, incluindo Orthomyxoviridae (por exemplo., O vírus da gripe), Rhabdoviridae (por exemplo., O vírus da estomatite vesicular), Bunyaviridae (por exemplo. , La Crosse vírus) e Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana-1) 1-4. Não está claro como estas proteínas reconhecer uma ampla gama de vírus tais, sem qualquer sequência primária compartilhada aparente motivos na estes vírus. Analisando a interação de proteínas Mx com seus alvos virais, potencialmente envolvendo complexos de ordem superior com outros fatores de célula hospedeira, irá ajudar a compreender os mecanismos moleculares tchapéu evoluíram na corrida armamentista entre os vírus e seus hospedeiros. A interação entre as proteínas de mamíferos e Mx alvos virais tem sido estudado mais extensivamente para MxA humano. MxA humano pode inibir a replicação de muitos vírus, incluindo o vírus influenza A orthomyxovirus e vírus Thogoto. MxA liga os complexos de ribonucleoproteína vírus Thogoto (vRNPs), impedindo assim a sua entrada nuclear, o que resulta no bloqueio da infecção 5. Esta interacção entre MXA e Thogoto vRNPs vírus tem sido demonstrado com a co-sedimentação e de co-imunoprecipitação experiências 6-9. Como proteínas Mx dificultar vírus da gripe A é menos clara. Um problema principal é que não é fácil de demonstrar uma interacção entre uma proteína Mx e um produto de gene da influenza. Um relatório demonstrou uma interação entre MxA humana e da proteína NP em influenza A células infectadas pelo vírus 10. Essa interação só poderia ser demonstrado por co-immunoprecipitation se as células terem sido tratadas com as de reticulação reagentes ditiobis (propionato de succinimidilo), antes de lise, sugerindo que a interacção é transitória e / ou fraco. Estudos mais recentes têm mostrado que a sensibilidade diferencial Mx de estirpes diferentes de influenza A é determinado pela origem da proteína NP 11,12. Em linha com esta, os vírus da gripe A pode escapar do controle, em parte, Mx por mutação resíduos específicos na proteína NP 13. Isto sugere que o principal alvo dos vírus influenza para acolhimento Mx é a proteína NP, provavelmente NP montados em complexos vRNP. No entanto, nenhum desses estudos mais recentes demonstraram uma interacção entre a gripe NP ou vRNP e MxA quer humano ou de ratinho Mx1. Recentemente, demonstrou, pela primeira vez, uma interacção entre o NP de influenza e da proteína Mx1 rato com um protocolo de co-imunoprecipitação optimizado 14, a qual é descrita aqui em detalhe. Em geral, a co-immunoprecipitation é uma das abordagens bioquímicas mais freqüentemente utilizados para investigar as interações proteína-proteína. Esta técnica é muitas vezes preferido ao longo técnicas alternativas, por exemplo, de leveduras duplamente híbrido, uma vez que permite investigar interacções proteína-proteína no seu ambiente natural. Co-imunoprecipitação pode ser levada a cabo em proteínas expressas endogenamente, se os anticorpos contra as proteínas de interesse estão disponíveis. Alternativamente, as proteínas de interesse podem ser expressos na célula através de transfecção ou infecção e um tag de afinidade pode ser usado. Além das vantagens acima mencionadas, o protocolo de co-imunoprecipitação descrita permite a detecção de interacções proteína fracos e / ou transientes. O principal componente neste protocolo optimizado é a adição de N-etilmaleimida (NEM) em tampão de lise celular. NEM é um reagente de alquilação, que reage com grupos tiol livres tais como presentes em cisteínas, a um pH de 6,5-7,5, para formar uma tio-éster estável(Figura 1). A pH mais elevado, a NEM também pode reagir com grupos amino ou sofrer hidrólise 15. NEM é normalmente utilizado para bloquear os grupos tiol livres, a fim de evitar a formação de ligações dissulfureto ou inibir a actividade enzimática. Por exemplo, a NEM é muitas vezes usado para bloquear enzimas desumoylating, que são proteases de cisteína. No protocolo de co-imunoprecipitação descrita, NEM foi inicialmente incluído no tampão de lise, porque tinha sido relatado que o sumoilação de proteínas de influenza podem influenciar a interacção entre as proteínas virais 16. Inesperadamente, a adição de NEM provou ser a chave para documentar a interacção entre NP de influenza e rato Mx1 por co-imunoprecipitação. Não está claro porque a adição de NEM é crucial para detectar a interacção NP-Mx1. Possivelmente, a interacção é muito transiente e / ou fraco. NEM poderia estabilizar a interacção, por exemplo, ao preservar uma conformação específica de Mx1, uma proteína viral, ou ainda um terceiro compo desconhecidonente. Tal efeito estabilizante de NEM foi observada antes, por exemplo, para a interacção entre a ribonucleótido-redutase M1 e o seu inibidor gemcitabina (F2dC) 17. Mx1 e NP ambos contêm múltiplos resíduos de cisteína que poderiam ser modificados por NEM. Por exemplo, um estudo recente da Rennie et al. Demonstraram que uma stalkless MxA variante contém três resíduos de cisteína expostos solventes que podem ser modificados por iodoacetamide. Mutação destes resíduos para serines não influenciou a atividade enzimática da MxA, mas impediu a agregação mediada por dissulfeto 18. À medida que estas cisteínas são conservadas em Mx1, isto sugere que os análogos em cisteínas Mx1 pode ser modificada por NEM e, como tal influência sua conformação ou solubilidade. Além disso, a NEM também pode afectar a actividade de GTPase de Mx1, que é essencial para a actividade anti-gripe de Mx1, e assim estabilizar a interacção entre Mx1 e NP. No entanto, um efeito directo de NEM na GTPase actividade de Mx1 é improvável, como NEM também é necessária para detectar a interação entre a gripe NP e GTPase mutantes inativos da proteína Mx1 14. Claramente, é necessária mais investigação para desvendar o efeito de NEM na interação NP-Mx1. Em resumo, o protocolo de co-imunoprecipitação descrita permite estudar a interacção entre a proteína antiviral Mx1 e seu alvo viral, a proteína NP da gripe. Este protocolo poderia também ser utilizada para estudar outras interacções fracas ou transientes que dependem da estabilização de conformações de proteínas específicas. Interacção proteína-proteína que dependem conformações específicos têm sido descritos antes, por exemplo, para as proteínas de ligação ao cálcio, tais como a calmodulina 19. Finalmente, o papel benéfico de NEM também pode ser usado noutros métodos que detectam interacções proteína-proteína, tais como ensaios de co-sedimentação.

<table><tbody><tr><td>DMEM alta glicose</td><td>Gibco</td><td>52100-047</td><td></td></tr><tr><td>N-Etilmaleimida</td><td>Sigma</td><td>E-3876</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma</td><td>I-30212</td><td>também conhecido como NP40</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de protease</td><td>Roche</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal anti-NP</td><td>NIH Biodefesa e Infecções Emergentes Repositório</td> <td>de Recursos de PesquisaNR-4282</td><td>ascite mistura de clones A1 e A3 soro</td></tr><tr><td>policlonal anti-RNP</td><td>NIH Biodefesa e Infecções Emergentes Repositório de Recursos de Pesquisa</td><td>NR-3133</td><td>dirigido contra A/Scotland/840/74 (H3N2)</td></tr><tr><td>Proteína G Sepharose 4FF</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Hiperfilme ECL 18 x 24 cm</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9068-36</td><td></td></tr><tr><td>ECL substrato de western blotting</td><td>Pierce</td><td>Rolamento 32106</td><td></td></tr></tbody></table>

co-imunoprecipitação da proteína do rato mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe a

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Estudar a interação entre proteínas é fundamental para entender sua(s) função(ões). Um método muito poderoso que é frequentemente usado para estudar interações de proteínas com outras macromoléculas em uma amostra complexa é chamado de co-imunoprecipitação. O protocolo de co-imunoprecipitação descrito permite demonstrar e investigar ainda mais a interação entre a proteína 1 de resistência ao mixovírus antiviral (Mx1) e um de seus alvos virais, a nucleoproteína (NP) do vírus influenza A. O protocolo começa com células de mamíferos transfectadas, mas também é possível usar células infectadas pelo vírus influenza A como material de partida. Após a lise celular, a proteína NP viral é puxada para baixo com um anticorpo específico e os complexos imunológicos resultantes são precipitados com grânulos de proteína G. A redução bem-sucedida de NP e a co-imunoprecipitação da proteína antiviral Mx1 são subsequentemente reveladas por western blotting. Um pré-requisito para a co-imunoprecipitação bem-sucedida de Mx1 com NP é a presença de N-etilmaleimida (NEM) no tampão de lise celular. Os alquilados NEM liberam grupos tióis. Presumivelmente, essa reação estabiliza a interação NP-Mx1 fraca e / ou transitória, preservando uma conformação específica de Mx1, seu alvo viral ou um terceiro componente desconhecido. Uma limitação importante dos experimentos de co-imunoprecipitação é a redução inadvertida de proteínas contaminantes, causada pela ligação inespecífica de proteínas às esferas de proteína G ou anticorpos. Portanto, é muito importante incluir configurações de controle para excluir resultados falsos positivos. O protocolo de co-imunoprecipitação descrito pode ser usado para estudar a interação de proteínas Mx de diferentes espécies de vertebrados com proteínas virais, qualquer par de proteínas ou de uma proteína com outras macromoléculas. O papel benéfico do NEM para estabilizar interações fracas e/ou transitórias precisa ser testado para cada par de interações individualmente.

N-etilmaleimida é um composto orgânico que pode ser utilizado para modificar irreversivelmente grupos tiol livres, por exemplo, para inibir as proteases de cisteína (Figura 1). A proteína antiviral Mx1 inibe a replicação do vírus da gripe A, interagindo com a nucleoproteína virai. O protocolo de co-imunoprecipitação otimizado aqui descrito permite estudar essa interação NP-Mx1. Células HEK293T foram transfectadas com vectores de expressão para a proteína Mx1 antivir...

Este protocolo de co-imunoprecipitação permite estudar a interação entre a nucleoproteína do vírus influenza A e a proteína antiviral Mx1 em células humanas. O protocolo enfatiza a importância da N-etilmaleimida para a co-imunoprecipitação bem-sucedida da nucleoproteína Mx1 e do vírus influenza A.

Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a interação entre a proteína antiviral MX1 e seu alvo viral, a proteína nucleocapsídeo da influenza, por meio de coimunoprecipitação. Isso é realizado primeiramente lisando células transfectadas que contêm ambas as proteínas na presença de ide. O segundo passo consiste em adicionar um anticorpo específico para a proteína nucleocapsídeo da influenza, de modo a ligar-se à proteína nucleocapsídeo e à proteína MX1 interagente.Em seguida, os complexos imunes resultantes são precipitados com perlas de proteína G e as proteínas contaminantes são removidas por meio de lavagens extensivas. O passo final consiste em eluir a proteína nuclear da influenza e a proteína MX1 co-precipitada das perlas de proteína G. Por fim, a técnica de western blot é utilizada para demonstrar a interação entre a proteína nuclear da influenza e a proteína antiviral MX1.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes como esses dois híbridos é que as proteínas interagentes estão situadas em seu ambiente natural, que é a célula humana. Este método pode fornecer informações sobre a interação entre a proteína nuclear do vírus da gripe e a proteína antiviral AMX1, mas também pode ser modificado para estudar outras interações proteína-proteína fracas ou transitórias. A técnica será demonstrada por meio de uma figura por um colega do meu laboratório. Prepare todos os tampões de transfeção conforme descrito no protocolo textual complementar.Dilua o DNA plasmático em 600 microlitros de tampão tris-EDTA. Em seguida, adicione 150 microlitros de cloreto de cálcio tamponado heaps de forma gota a gota às amostras de plasmídeo e misture pipetando para cima e para baixo três vezes. Adicione o resultado em 750 microlitros de solução de plasmídeo, de forma gota a gota, a 750 microlitros de solução salina tamponada heaps colocada em uma placa fresca de seis poços.Certifique-se de distribuir a solução do plasmídeo uniformemente por toda a cavidade. Em seguida, coloque a solução de transfeção em um agitador de placa durante 90 segundos a 1000 RPM e, depois, incube a mistura à temperatura ambiente por cinco minutos. Pegue uma placa de Petri revestida para cultura de tecidos de nove centímetros com células HEC 2 9 3 T que estejam subconfluentes no dia da transfeção.Usando uma micropipeta P1000, adicione a solução de transfeção gota a gota às células, certificando-se de dispersar a mistura uniformemente por toda a placa. Quando os 1,5 mililitros da solução de transfeção tiverem sido adicionados, agite suavemente a placa, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por seis horas. Em seguida, aspire o meio e substitua imediatamente por 12 mililitros de meio fresco pré-aquecido, suavemente.Para evitar a dessanexão celular. Prepare todas as soluções estoque de lise conforme descrito no protocolo textual complementar. Após o preparo, lave as células com dois mililitros de PBS frio a 4 °C. Realize a lavagem suavemente, pois as células HEK 293T se dessanexam facilmente.Em seguida, remova o PBS e adicione 600 microlitros de tampão de lise com baixo teor de sal, gelado, a cada placa e coloque-as no gelo durante 20 minutos, agitando suavemente cada placa a cada cinco minutos e certificando-se de que as placas permaneçam na posição horizontal. Colete o lisado celular em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue por três minutos a quatro graus Celsius e 16.000 ×g para obter o pellet da fração insolúvel. Transfira a fração solúvel para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro novo e coloque-o no gelo.Realize os passos restantes o máximo possível em gelo ou a quatro graus para limitar a atividade proteolítica nos lisados. Para preparar os complexos imunes, misture 135 microlitros de lisado com dois microlitros de anticorpo monoclonal anti-NP e 113 microlitros de tampão de lise com baixa concentração de sal. Para um volume total de 250 microlitros, armazene o lisado remanescente a menos 20 graus Celsius.Para análises adicionais, como o western blot, incube a mistura de lisado com o anticorpo de três a vinte e quatro horas em rotação lenta a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare as microesferas de proteína G adicionando 100 microlitros de suspensão de microesferas para cada amostra a um único tubo. Centrifugue a suspensão a 8.000 ×g e quatro graus Celsius por 30 segundos e remova a solução de etanol na qual estão armazenadas.Adicione um volume igual de tampão de lise com baixa concentração de sal gelado e misture suavemente. Centrifugue novamente a suspensão de perlas de proteína G a 8.000 × g e 4 °C por 30 segundos. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante. Estime o volume de perlas de proteína G remanescentes e adicione um volume igual de tampão de lise com baixa concentração de sal gelado para preparar uma nova suspensão de perlas a 50% no tampão de lise com baixa concentração de sal.Suspenda a suspensão e transfira 100 microlitros para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Armazene o tubo no gelo até o momento em que for necessário, antes de usar as perlas de proteína G para imunoprecipitação. Centrifugue todos os tubos por 30 segundos a 8.000 × g e 4 °C. Posteriormente, verifique por inspeção visual se há quantidades iguais de perlas presentes em todas as amostras.Se necessário, ajuste a quantidade de microesferas em algumas das amostras e centrifugue novamente. Quando todas as amostras apresentarem volume aproximadamente igual a 50 microlitros, despreze os sobrenadantes tomando cuidado para não perturbar as microesferas de proteína G sedimentadas. Em seguida, centrifugue brevemente os complexos imunes por 30 segundos a 8.000 ×g e 4 °C para recolher a amostra no fundo do tubo.Em seguida, transfira todos os complexos imunes para as microesferas de proteína G. Incube por 60 minutos em rotação a quatro graus Celsius. Não incubar os complexos imunes com as microesferas de proteína G por mais de 75 minutos. Um tempo de incubação mais longo aumenta a ligação não específica de proteínas às microesferas de proteína G.Em seguida, centrifugue as microesferas de proteína G com os complexos imunes agora ligados. Remova os sobrenadantes, mas tenha cuidado para não perturbar as microesferas de proteína G no pellet. A seguir, lave as microesferas de proteína G por aproximadamente cinco minutos com 900 microlitros de tampão de lise com alto teor de sal.Certifique-se de que as esferas estejam completamente ressuspendidas no tampão de lavagem. Para uma lavagem ideal, centrifugue as esferas de proteína G por 30 segundos a 8.000 ×g e 4 °C e descarte os sobrenadantes. Tenha cuidado para não perturbar as esferas de proteína G sedimentadas, a fim de evitar a perda do material imunoprecipitado.Após a última etapa de lavagem, adicione 50 microlitros de tampão amostral 2x com lamelina às esferas e aqueça a suspensão por 10 minutos a 95 graus Celsius. Para eluir as proteínas co-precipitadas. Após o aquecimento, centrifugue as esferas de proteína G por 30 segundos a 8.000 ×g.Em seguida, armazene as amostras a quatro graus Celsius se forem utilizadas imediatamente ou a menos 20 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. É mostrado aqui um blot ocidental de um experimento de coimunoprecipitação com duas amostras: uma contendo tanto a proteína antiviral MX1 quanto as proteínas nucleares do vírus da influenza A presentes, e um controle onde apenas a proteína MX1 está presente. Este resultado demonstra que a proteína MX1 é coimunoprecipitada somente na presença da proteína nuclear do vírus da influenza A coexpressa.Aqui pode-se observar a importância do uso do agente alquilante N ide. Ao preparar os lisados celulares na presença de N ylm, a interação NP MX one pode ser detectada, mas na sua ausência, essa interação é indetectável. Este método é muito versátil e pode ser usado para avaliar a coimunoprecipitação de MX one com a proteína nuclear do vírus da influenza, a partir de lisados derivados de células transfectadas, células infectadas ou derivados de varians.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de coimunoprecipitação. Além disso, a adição de um meio ao lisado celular permite estudar interações fracas ou transitórias entre proteínas, como a interação entre a proteína nuclear do vírus da influenza A e a proteína antiviral Amex1.

co-immunoprecipitation-mouse-mx1-protein-with-influenza-virus

Research

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