Name: Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células mononucleares de sangue periférico de buffy coats congelados usando plasmídeos epissomais não integrativos. Este método livre de vírus é econômico e seguro para aplicações clínicas.

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O estudo foi apoiado pelo Ministério da Saúde e Departamento de Assistência Educacional, Universidade e Pesquisa da Província Autônoma de Bolzano e pela Fundação Sparkasse do Tirol do Sul.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells).</a> Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li>
<li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune%2C+a+non-integrating+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA.</a> Sci. Rep. 2, 657(2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotency%3A+history%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).</li>
<li>Chou, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Streckfuss-Bomeke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+bone+marrow+cells%2C+hair+keratinocytes%2C+and+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts.</a> Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).</li>
<li>Miyoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+and+human+cells+to+pluripotency+using+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs.</a> Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+human+hair+follicle+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).</li>
<li>Beltrao-Braga, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+immature+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells.</a> Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).</li>
<li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+efficient+cellular+substrate+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+adults%3A+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).</li>
<li>Hasegawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+reprogramming+efficiency+between+transduction+of+reprogramming+factors%2C+cell-cell+fusion%2C+and+cytoplast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion.</a> Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), 2565(2010).</li>
<li>Fleige, S., Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+and+the+effect+on+the+real-time+qRT-PCR+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).</li>
<li>Meraviglia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chorionic+villus+mesenchymal+stromal+cells+reveal+strong+endothelial+conversion+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties.</a> Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).</li>
<li>Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+metaphase+chromosome+set+by+aid+of+DNA-binding+fluorescent+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents.</a> Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).</li>
<li>Alikani, M., Munne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviable+human+pre-implantation+embryos+as+a+source+of+stem+cells+for+research+and+potential+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy.</a> Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).</li>
<li>Tropel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+following+pre-implantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+reprogramming+is+a+stochastic+process+amenable+to+acceleration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration.</a> Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ink4%2FArf+locus+is+a+barrier+for+iPS+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming.</a> Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Lindner, S. E., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmid+replicon+of+Epstein-Barr+virus%3A+mechanistic+insights+into+efficient%2C+licensed%2C+extrachromosomal+replication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells.</a> Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

No passado, a única forma de obter células-tronco pluripotentes humanas portadores de uma mutação genética particular foi recrutar pais submetidos a um diagnóstico genético pré-implantação e gerar células-tronco embrionárias a partir de suas blastocistos descartados 31,32. Usando uma abordagem de reprogramação, os pesquisadores podem agora gerar iPSCs de pacientes portadores de virtualmente qualquer genótipo. A possibilidade de iniciar a partir de uma linha de células específica para cada paciente e uma fonte...

Em 2006, o grupo de Shinya Yamanaka 1 demonstraram pela primeira vez que as células somáticas de ratos e seres humanos adultos pode ser convertido para um estado pluripotente pela expressão ectópica de quatro factores de reprogramação (Oct-4, Sox-2, 4-Klf, e c-Myc), gerando as chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) 2. IPSCs específica para cada paciente se assemelham células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em termos de morfologia, proliferação e capacidade de se diferenciarem em tipos de células germinativas (três mesoderme, endoderme e da ectoderme), enquanto falta as preocupações de ordem ética associados à utilização de hESCs e ignorando possível rejeição imunológica 3. Assim, iPSCs aparecer como uma das mais importantes fontes de células específicas do paciente para a pesquisa básica, a seleção da droga, modelagem de doença, avaliação de toxicidade e efeitos de medicina regenerativa 4. Várias abordagens têm sido utilizadas para a geração de iPSC: vectores de integração virais(Retrovírus 5, lentivírus 6), viral não-integração de vetores (adenovírus 7), Sendai-vírus 8, 9 BAC transposons, vetores epissomais 10, proteínas 11 ou 12 RNA entrega. Embora o uso de métodos mediada por vírus pode levar a uma alta eficiência de reprogramação, os vectores virais integrar-se no genoma das células hospedeiras e, por conseguinte, mutagénese de inserção aleatória potencial, alteração permanente da expressão do gene, e reactivação de transgenes silenciados durante a diferenciação não pode ser excluído 13. Para fazer iPSCs mais seguro para a medicina regenerativa, foram feitos esforços para derivar iPSCs sem a integração de DNA exógeno em genomas celulares. Embora os vectores virais ele sujeitos e transposões foram desenvolvidos, ainda não é claro se as sequências de vector, o que inevitavelmente curtas permanecem nas células transduzidas após excisão, e expressão de transposase, poderia induzir alteração na célulaular funcionar 13. Apesar da sua alta eficiência de reprogramação, vírus Sendai representa uma abordagem caro e preocupações atingem-through de licenciamento com a empresa que desenvolveu este sistema tem o potencial de limitar a sua aplicação em estudos translacionais. Além disso, a necessidade de introdução directa de proteínas e RNA requer entrega múltiplo de reprogramação moléculas com as limitações técnicas inerentes Isso introduz e eficiência global de reprogramação é muito baixa 14. De nota, métodos virais livres e não-integração eficaz em termos de custos com base no uso de plasmídeos epissómicos têm sido relatadas com sucesso para a reprogramação de fibroblastos da pele 15. Especificamente, no presente trabalho, decidimos usar plasmídeos epissomais livre de integração disponíveis comerciais, conforme relatado anteriormente 10,15. Até à data, os fibroblastos da pele representam o mais popular tipo de célula doadora 5. No entanto, outras fontes de células foram successfully reprogramado em iPSCs incluindo queratinócitos 16, medula óssea células-tronco mesenquimais, células do estroma 17 adiposo 18, 19 folículos pilosos e as células da Polpa Dentária 20. O isolamento destas células requer procedimentos cirúrgicos, e várias semanas são necessários para a expansão in vitro de células, a fim de estabelecer uma cultura de células primárias. Neste contexto, a selecção do tipo de células de partida é crítica e é igualmente importante ser capaz de produzir a partir de tecidos iPSCs facilmente acessíveis e menos invasivas, tais como sangue. Ambas as células mononucleares do sangue do cordão umbilical (CBMNCs 21,22) e células mononucleares de sangue periférico (14,22-24) PBMNCs representam fontes adequadas de células para a derivação de iPSCs. Embora a eficiência do adulto PBMNC reprogramação é 20-50 vezes mais baixa do que a de CBMNCs 22, eles continuam a ser o tipo de célula mais conveniente para efeitos de amostragem. Emfato, a amostragem PBMNC tem a vantagem de ser minimamente invasivo, e, além disso, estas células não necessitam de grande expansão in vitro antes de experiências de reprogramação. Até à data, os protocolos diferentes têm relatado que PBMNCs após separação por gradiente de densidade pode ser congelado e descongelado dias a vários meses após a congelação e expandido por poucos dias antes de reprogramação em iPSCs 22,23. No entanto, tanto quanto nós estamos cientes há relatos têm descrito a reprogramação da PBMNCs de crostas inflamatórias congelados. Importante, cremes leucocitários congelados recolhidos sem separação por gradiente de densidade representam as amostras de sangue mais comuns armazenadas em bancos de recursos biológicos de grande escala a partir de estudos populacionais, representando, assim, uma piscina facilmente acessível de material para a produção iPSC que evita ainda a coleta de amostras. Aqui nós relatamos pela primeira vez a geração de iPSCs virais-livre de cremes leucocitários humanos congelados, com base em um protocolo previamente descrito 22. EmAdicionalmente, foram gerados a partir iPSCs PBMNCs congelados obtidos após separação por gradiente de densidade, tal como um protocolo de controlo para os resultados PBMNC gradiente de densidade não-purificadas.

<table><tbody><tr><td>Tubo de plástico Venosafe tamponado com citrato de sódio</td><td>Terumo</td><td>VF-054SBCS07</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>EDTA pó dissódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>0.5 M solução</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5442-02</td><td>Solução de polissacarose para centrifugação com gradiente de densidade</td></tr><tr><td>Iscove modificou o meio de Dulbecco (IMDM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>Sem fenol vermelho</td></tr><tr><td>Presunto F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selênio-Etanolamina (ITS -X)</td><td>Gibco</td><td>51500-056&nbsp;</td><td>1X (Estoque: 100X)</td></tr><tr><td>Concentrado lipídico quimicamente definido</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td>1X (Estoque: 100X)</td></tr> <tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnésio sal hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>1-Tioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Concentração final a 200 &micro; </td></tr><tr><td>M Fator de Células-Tronco Humanas Recombinantes (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml (Estoque:100 &micro; g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>Interleucina-3 Humana Recombinante (IL-3)</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>10 ng/ml (Estoque: 10 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>Fator de crescimento semelhante à insulina humana recombinante (IGF-1)</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td>40 ng/ml (Estoque: 40 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>Eritropoietina Humana Recombinante (EPO)</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>287-TC-500</td><td>2 U/ml (Estoque: 50 U/ml)</td></tr><tr><td>Dexametasona&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td>1 &mu; M (Estoque: 1 mM)</td></tr><tr><td>Holo-Transferrina Humana</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>2914-HT</td><td>100 &mu; g/ml (Estoque: 20 mg/ml)</td></tr><tr><td>Amniomax II</td><td>Gibco</td><td>11269016</td><td>Meio para análise citogenética</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>Meio para cultura sem alimentador iPSC</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>0.1 mM (Estoque: 50 mM)</td></tr><tr><td>Butirato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>0.25 mM (Estoque: 0.5 M)</td></tr><tr><td>FGF humano recombinante básico, 145 aa&nbsp;</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>4114-TC</td><td>10 ng/ml (Estoque: 10 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503&nbsp;</td><td>10 &micro; M (Estoque: 10 mM)</td></tr><tr><td>Soro bovino definido fetal</td><td>Hyclone</td><td>SH 30070.03</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% Solução de gelatina</td><td>Merck-Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matriz de membrana basal Fator de crescimento reduzido</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Colgenase, Tipo IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>1 mg/ml (Estoque: 10 mg/ml)</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>L11-007</td><td>Solução de desprendimento de células</td></tr><tr><td>Fibroblasto embrionário de camundongo (CF1)</td><td>Global Stem</td><td>GSC-6201G</td><td>1*106 cells/6 placa de poço</td></tr><tr><td>Plasmídeo pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27077</td><td>1 &micro; g (Estoque: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr> <tr><td>Plasmídeo pCXLE-hSK</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27078</td><td>1 &micro; g (Estoque: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr> <tr><td>Plasmídeo pCXLE-hUL</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27080</td><td>1 &micro; g (Estoque: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr> <tr><td>Plasmídeo pCXLE-EGFP</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27082</td><td>1 &micro; g (Estoque: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr> <tr><td>Kit de coloração de fosfatase alcalina</td><td>Stemgent</td><td>00-0009</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-antígeno embrionário específico do estágio-4 (SSEA-4)</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4304</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Anticorpo</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4360</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 Anticorpo</td><td></td><td></td><td></td>Merck-Millipore MAB4381 1/250</tr><tr><td>Anti-Oct-3/4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9081</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-33759</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Troponina I Anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15368</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-&alfa;-Actinina (Sarcômera) Anticorpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7732</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Neuronal Classe III &szlig;-Tubulina (TUJ1)</td><td>Anticorpo Covance Produtos de Pesquisa Inc&nbsp;</td><td>MMS-435P-100</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Tirosina Hidroxilase (TH) Anticorpo</td><td>Calbiochem</td><td>657012</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse&nbsp;</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A-11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21429</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment Cell Culture Placa de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Ambion</td><td>15596-018&nbsp;</td><td>reagente para extração de RNA</td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA SuperScript VILO</td> Kit <td>de</td><td>transcriptase reversa</td><td>Invitrogen</td> 11754050</tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5124</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Sistema de detecção de PCR em tempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5195</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese automatizado Experion</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7000</td><td>Instrumento para verificar a integridade do RNA</td></tr><tr><td>Experion RNA Kit de análise Highsense</td><td>Bio-Rad</td><td>7007105</td><td>Kit de reagentes para verificar a integridade do RNA</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação (SteREO Discovery V12)</td> <td>Zeiss</td><td>495007</td><td></td></tr><tr><td>NeonTransfection System 100 &micro; l Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10025</td><td>Kit de reagentes para eletroporação</td></tr><tr><td>Sistema de transfecção de néon</td> Instrumento <td>de MPK5000</td><td>Invitrogen</td><td>usado para eletroporação</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop UV/Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Instrumento para quantificação de DNA/RNA</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Kit de purificação de plasmídeo</td></tr></tbody></table>

geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco congelado buffy coats usando não-integração epissomais plasmids

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Células somáticas pode ser reprogramada em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), forçando a expressão de quatro fatores de transcrição (Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-Myc), normalmente expressa por células-tronco embrionárias humanas (hESCs) . Devido à sua semelhança com hESCs, iPSCs tornaram-se uma ferramenta importante para o potencial de medicina regenerativa específica para cada paciente, evitando questões éticas associadas com hESCs. De modo a obter células adequadas para a aplicação clínica, iPSCs livre de transgenes precisam de ser gerado para evitar a reactivação do transgene, a expressão do gene alterada e diferenciação errada. Além disso, um método de reprogramação altamente eficiente e de baixo custo é necessário derivar iPSCs suficientes para fins terapêuticos. Tendo em conta esta necessidade, uma abordagem eficiente não-integração episomal plasmídeo é a melhor escolha para iPSC derivação. Actualmente, o tipo celular mais comum utilizado para fins de reprogramação são fibroblastos, o que requer o isolamento de biopsia de tecido, um invasive procedimento cirúrgico para o paciente. Portanto, sangue periférico humano representa o tecido mais acessível e menos invasivo para a geração da IPSC. Neste estudo, um protocolo eficaz e viral livre usando não integrando plasmídeos epissomais é relatado para a geração de iPSCs a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados após a centrifugação de sangue total e sem separação de gradiente de densidade.

Neste estudo, um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs-virais livre por reprogramação da PBMNCs isoladas a partir de crostas inflamatórias congelados após a centrifugação de sangue total e comparação com a reprogramação da PBMNCs obtidos após separação por gradiente de densidade é relatado. A Figura 1A mostra uma representação esquemática de o protocolo detalhado. Após a descongelação, os PBMNCs isolado, que mostram uma forma típica arredondada, são expandidas em meio de cultura de sangue e...

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células mononucleares do sangue periférico humano obtidas de camadas leucocitárias congeladas, utilizando um protocolo livre de vírus e economicamente eficiente. Isso é realizado primeiramente pelo isolamento de PB MNCs a partir das camadas leucocitárias após centrifugação do sangue total, sem uso de gradiente de densidade, seguido pela expansão em um meio de cultura sanguínea específico. O segundo passo consiste em transfectar as PB MNCs provenientes da camada leucocitária com plasmídeos episomais por eletroporação.As PB MNCs transfectadas são então semeadas sobre células alimentadoras de fibroblastos embrionários de camundongo frescos. O passo final consiste em selecionar manualmente as células-tronco pluripotentes induzidas do cultivo e transferi-las para novas placas de células alimentadoras para expansão. Em última análise, a reprogramação eficiente de PB MNCs em células-tronco pluripotentes induzidas com morfologia humana típica pode ser demonstrada por imunofluorescência e pela medição da expressão gênica.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que a degeneração de IPCs livres de vírus a partir de OTs congelados reduz o custo, o tempo de trabalho e os passos manuais para os operadores durante o processamento da amostra. Outra vantagem desta técnica é que ela permite o uso de OTs congelados armazenados em biobancos em larga escala, coletados a partir de estudos populacionais, como material de origem para a produção de IPS. Inicie coletando oito mililitros de sangue periférico venoso em um tubo plástico tamponado com citrato de sódio.Armazene o sangue a 25 graus Celsius e processe-o dentro de 12 horas. O primeiro passo do processamento é centrifugar o sangue a 2000 Gs por 15 minutos a quatro graus Celsius. Utilize um rotor de rotor oscilante e não aplique os freios centrífugos durante a separação.Colete o estrato esbranquiçado e turvo, conhecido como camada de interface. Esta é a camada entre a fase superior, o plasma, e a fase inferior. O estrato de interface corresponde à fração enriquecida de PBMNCs; transfira cerca de 500 microlitros de cada amostra de oito mililitros para um tubo criogênico.Agora, ressuspenda o coágulo leucocitário adicionando um volume igual de meio de congelação 2x e, em seguida, congele o frasco em recipiente de congelação com taxa controlada a menos 80 graus Celsius por até uma semana. Para armazenamento mais longo, as células podem ser armazenadas em nitrogênio líquido. Inicie o descongelamento de uma suspensão congelada de um mililitro de PBMCs obtida de coágulos leucocitários congelados em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, dilua as células para dois mililitros com PBS.Em seguida, transfira a diluição para um tubo de 50 mililitros e adicione 10 mililitros de tampão de lise de células vermelhas. Incube essa mistura à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. Após 10 minutos, aumente o volume total para 50 mililitros com PBS estéril.Em seguida, centrifugue as células a 300 Gs durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e lave o pellet com 50 mililitros de PBS. Agora, centrifugue as células novamente e re-suspenda-as em um mililitro de meio PBM e C.Retire uma alíquota das células ressuspendidas e meça a densidade celular utilizando uma câmara de contagem. Em seguida, ajuste-a para 2 milhões de células por mililitro. Agora, estabeleça um cultivo em suspensão.Carregue as células em um poço de uma placa-padrão de 12 poços e incube-as por 48 horas. Troque o meio a cada dois dias, aspire as células usando uma pipeta e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue o tubo carregado a 300 ×g por 10 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de meio fresco de P-B-M-N-C. Uma contaminação por hemácias é comum durante os primeiros dias de cultura de PB MNC. Antes de devolver as células a um novo frasco, verifique-as em um microscópio invertido quando atingirem cerca de 80% de confluência, dividindo a cultura durante a transferência.Duas semanas após o início do cultivo de MNCs de PB, as células devem estar prontas para transfeção. Prepare quatro plasmídeos: um carregando T três quatro e S-H-R-N-A contra P 53, um carregando SOX dois e KLF quatro, um carregando lmic e lin 28 e um plasmídeo carregando EGFP. Para começar, colete os MNCs de PB em um tubo cônico de 15 mililitros e conte o número de células viáveis utilizando triam blue.Em seguida, prepare 2 milhões de células viáveis, centrifugue-as e re-suspenda as células em uma mistura de transfeção contendo 100 microlitros do tampão de re-suspensão T e um micrograma de cada um dos quatro plasmídeos. Agora, complete o recipiente de transfeção com três mililitros de tampão eletrolítico. E dois, aspire a mistura de transfeção em uma ponteira de 100 microlitros e ejeite a amostra verticalmente no tubo de eletroporação preparado.Em seguida, eletroporou as células usando três pulsos. Após a eletroporação, re-suspenda as células em dois mililitros de meio PBM e C pré-aquecido contendo butirato de sódio 0,25 milimolar. Em seguida, conte o número de células viáveis como antes e transfira a suspensão para um poço de uma placa de seis poços não revestida. Incube a placa com agitação suave por 24 horas.Mantenha as células transfectadas sem dividi-las por três dias a partir do dia da transfeção em dias alternados. Substitua o meio por dois mililitros de meio P-B-M-N-C recém-preparado com 0,25 milimolar de butirato de sódio um dia antes de estabelecer o co-cultivo, prepare primeiro o revestimento de MES, as cavidades de uma placa de seis poços com um mililitro de matriz da membrana basal e deixe as placas incubarem a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, aspire a matriz da membrana basal e plaque 200.000 MEFs em cada poço com dois mililitros de DMEM contendo 10% de FBS no dia seguinte, colete os PB MNCs em uma ponteira de um mililitro.Transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio fresco. Em seguida, plaque as células nas placas revestidas com metano e incube a placa após dois dias.Substitua o meio por dois mililitros de meio IPSC com butirato de sódio 0,25 milimolar e continue substituindo o meio IPSC a cada dois dias. Após cerca de 22 a 25 dias, as primeiras colônias de IPSCs devem ser visíveis até os 30 a 35 dias. As colônias devem estar prontas para serem selecionadas e replantadas no dia anterior ao empacotamento da placa de colônias de IPSCs com células alimentadoras metiladas em uma placa de 12 poços.Plaqueie em placa de poços com 125.000 células por poço e incube-as durante a noite. No dia seguinte, substitua o meio nas células meth por um mililitro de meio IPSC suplementado. Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, use uma agulha para selecionar uma colônia de cada vez, especialmente para colônias maiores que formam pequenos agregados.Transfira-os individualmente com pipeta, transferindo uma colônia para cada poço da placa revestida com metionina e incube a placa para passagem. As colônias de iPSC inicialmente utilizam a mesma técnica de seleção, mas após duas ou três passagens, utiliza-se o procedimento baseado em enzimas. Os MNCs do PB isolados, que apresentavam formato arredondado típico, foram expandidos em meio de cultura sanguínea específico por 14 dias e, em seguida, transfectados com plasmídeos episomais. De 10 a 15 dias após a transfeção, começaram a surgir pequenas colônias arredondadas, brilhantes, com margens definidas e morfologia semelhante à de células-tronco embrionárias, cerca de 20 a 30 dias após a transfeção.Colônias altamente compactas de CIPS com bordas definidas surgiram e aumentaram de tamanho até ficarem grandes o suficiente para serem selecionadas nas primeiras etapas de envasamento. As colônias de CIPS mantiveram seu estado indiferenciado e exibiram uma morfologia típica de células-tronco embrionárias humanas. O aumento da magnificação mostra as células individuais dentro das colônias e a alta razão núcleo-citoplasma.Os clones de IPSE selecionados foram passados cerca de 10 a 15 vezes adicionais. Cerca de 20 metáfases de várias culturas independentes foram analisadas quanto à estabilidade genética. Todas as amostras apresentaram cariótipo normal após cinco a 10 expansões in vitro.Esses clones foram caracterizados quanto à sua capacidade de auto-renovação e pluripotência. Os clones apresentaram positividade para a coloração de fosfatase alcalina. A R-T-P-C-R quantitativa confirmou que os clones expressavam genes pluripotentes endógenos em níveis muito mais altos do que as PBMNCs iniciais.Embora os níveis de cmic e KLA endógenos tenham permanecido mais ou menos os mesmos, a expressão do transgene episomal exógeno não pôde ser detectada nas CIPs, indicando, assim, a ativação bem-sucedida dos genes pluripotentes endógenos. Por fim, a análise por imunofluorescência revelou que as CIPs expressavam marcadores de pluripotência, tais como OC34, SSEA4, TRA-1-80, SOX2 e TRA-1-60. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar CIPs a partir de células do sangue periférico humano, de maneira economicamente viável e utilizando plasmídeos episomais não integrativos.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-frozen-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós demonstramos o protocolo para a geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células somáticas humanas usando lentivírus mediada entrega dos fatores humanos Oct4, Sox2, Nanog e Lin28. Pluripotência foi confirmado pela morfologia e pela presença de tronco embrionárias (ES) de células específicas marcadores.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem a partir do sangue periférico usando uma estratégia de reprogramação episome base e inibidores da histona deacetilase.

Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

Este manuscrito fornece um procedimento passo a passo para a derivação e manutenção de queratinócitos humanos a partir de cabelos arrancados e subsequente geração de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de integração (hiPSCs) por vetores epissómicos.

Geração de Integração Induced-livre Human células estaminais pluripotentes usando o cabelo derivado queratinócitos

Este protocolo descreve como gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas em condições livres de alimentador usando uma combinação de vetores de vírus matrigel e Sendai contendo fatores de reprogramação.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

Propomos um protocolo para reprogramação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Ao plaquear as células sanguíneas transduzidas em placas revestidas com matriz com centrifugação, as iPSCs são induzidas com sucesso a partir de células flutuantes. Esta técnica sugere um protocolo de reprogramação simples e eficaz para células como PBMCs e CBMCs.

Induzida Geração Stem Cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus Sendai e centrifugação

Este protocolo descreve um método detalhado para a geração eficiente de iPSCs livres de integração a partir de células sanguíneas periféricas adultas humanas. Com o uso de quatro vetores epissómicos baseados em oriP/EBNA para expressar os fatores de reprogramação, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 e SOX2, milhares de colônias de iPSC podem ser obtidas a partir de 1 mL de sangue periférico.

Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando epissï¿½ica Vectors

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

O protocolo atual detalha etapas para a resolução de problemas na derivação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de amostras de pacientes que têm sido difíceis de reprogramar seguindo as instruções do fabricante. Esse protocolo é específico para amostras congeladas de camada buffy, mas também pode ser aplicado à reprogramação de PBMCs purificados.

Reprogramação de Linhagens de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas a partir de Amostras de Buffy Coat Congeladas

Aqui nós descrevemos um protocolo para a geração de células-tronco humanas pluripotentes induzidas por a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos derivados de pacientes, utilizando um sistema lentiviral sem células alimentadoras.

Geração de células-tronco pluripotentes induzida por Usando sinoviócitos semelhantes a fibroblastos Isolado de articulações de pacientes com artrite reumatóide

Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células mononucleares de sangue periférico de buffy coats congelados usando plasmídeos epissomais não integrativos. Este método livre de vírus é econômico e seguro para aplicações clínicas.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

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