Name: Um Método para infligir Cabeça Fechada Lesão cerebral traumático em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Aprenda a induzir lesão cerebral traumática de cabeça fechada em Drosophila usando o dispositivo HIIT. Este método permite investigar mecanismos celulares e moleculares da TBI com ensaios comportamentais e moleculares.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health subvenção, R01 AG033620 (BG) e por Robert Draper Inovação Tecnológica Financiamento (DAW).

1. Construção do Dispositivo HIT <ol><li> Fixe a mola para a placa utilizando dois grampos e quatro parafusos (Figura 1A). Centralize os grampos em relação à largura da placa e Butt-los uns contra os outros com o flush braçadeira exterior com a borda da placa. Antes de fixar os grampos, dobre-os usando um alicate para caber firmemente sobre a primavera. NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter descrições dos materiais necessários para a construção do dispositivo de HIT. A extremidade apertada da mola deve ser de 1/8 de polegada (3,2 mm) a partir da borda da placa, ea extremidade livre deve estender-se sobre a placa por 3/4 de polegada (19 mm). Ajustar a mola de modo que ela se encontra em paralelo com o comprimento do bordo. </li><li> Enrole a extremidade livre da mola em torno de uma vez com a fita adesiva de loops de velcro. A borda externa do velcro deve estar nivelada com a extremidade da mola. O Velcro é importante porque é usado para proteger o frasco para a mola por CREAting um encaixe de compressão apertado. O velcro permite também uma fácil ligação e remoção de tubos de ensaio, permitindo que muitos frascos a serem processados ​​num curto período de tempo. </li><li> Coloque a tampa do balde de gelo de cabeça para baixo, centrado, apertado contra a placa de madeira. Orientar a região elevada da tampa balde de gelo de modo a que a borda é paralelo ao longo da largura do tabuleiro. Note-se que a região elevada do balde de gelo é de 1/2 polegada (13 mm) maior do que a placa de madeira, de modo que quando um frasco é ligado à mola a mola não vou mentir plana no tabuleiro. </li><li> Deslize todo o dispositivo contra um objeto fixo, como uma parede, de modo que a tampa balde de gelo está encravado entre o conselho eo objeto e não se move. </li><li> Tape o transferidor de papel para o fundo de um cartão voar bandeja frasco e coloque na borda contra a extensão do tabuleiro de modo que a marca de 90 ° está alinhado com a primavera, quando ele é puxado de volta para uma posição perfeitamente vertical. </li></ol> 2.O funcionamento do dispositivo HIT <ol><li> Lugar entre 1 e 60 CO 2 -anesthetized voa em um frasco vazio e tapar o frasco usando uma bola de algodão apertada. </li><li> Confinar as moscas para a parte inferior de 1 polegada (2,5 cm) do frasco, empurrando a bola de algodão para dentro do frasco até que seja de 1 polegada (2,5 cm) a partir do fundo. É útil para desenhar uma linha no frasco na marca de 1 polegada (2,5 cm). Note-se que as moscas para confinar regiões maiores ou menores do frasco pode afectar a gravidade dos fenótipos. </li><li> Esperar 5 min para as moscas para recuperar a mobilidade do CO 2. Note-se que não se sabe se 5 min é suficiente para eliminar completamente os efeitos de CO 2. </li><li> Inserir a extremidade da mola para dentro do frasco até que a extremidade interior do Velcro é nivelada com o topo do frasco (Figura 1B). Quando a primavera está deitado, de 1 polegada (2,5 cm) do frasco para injectáveis ​​deve sobrepor-se a região elevada da tampa do balde de gelo. Os frascos podem ser reutilizados mqualquer hora. </li><li> Ao sentar-se, mantenha o frasco a região de Velcro usando o polegar eo dedo indicador de sua mão esquerda. Segure a placa firmemente à bancada usando sua mão direita. Como alternativa, use C-braçadeiras para segurar a placa apertada para a bancada. </li><li> Puxe a mola perfeitamente em linha reta de volta para o ângulo desejado. Solte a primavera. Permitir que a primavera chegar a uma paragem completa. </li><li> Retire o recipiente da primavera e permitir que as moscas se recuperar para ≥5 min. Apresentar as moscas para outra greve ou transferir as moscas para um frasco com alimentos mosca. NOTA: Uma variedade de ensaios pode ser utilizada para avaliar os efeitos fenotípicos de ataques do dispositivo HIT. Por exemplo, os efeitos sobre a longevidade pode ser determinada através da análise da percentagem de moscas que sobrevivem às vezes após a lesão, os efeitos na morfologia do cérebro pode ser determinada por análise histológica da cabeça, e os efeitos sobre a expressão do gene pode ser determinada por análise quantitativa dos níveis de ARNm 10. </li><li> Determine efeitos do procedimento que não são devido a greves, tratando de forma idêntica moscas de controle que não são sujeitos a ataques. Usar protecção auricular, porque o impacto do frasco contra a cobertura balde de gelo produz um ruído alto. </li></ol>

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</ol>

Não temos conflitos de interesse para divulgar.

O método dispositivo HIT se distingue de outros métodos que infligem lesões traumáticas em moscas pelo fato de que ele faz com que a cabeça fechado, em vez de penetrar TBI 11. Além disso, o método de dispositivo HIT leva menos tempo, esforço e habilidade para infligir TBI em muitas moscas, por isso, o método é mais favorável do que outros métodos para telas genéticos de grande escala. Por fim, o facto de as lesões primárias infligidos pelo dispositivo HIT não estão limitados ao cérebro é ao mesmo tempo uma li...

An author's name was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52905">A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila</a>. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:
Barry Ganetky
to:
Barry Ganetzky

An author's name was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52905">A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila</a>.

Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatismo crânio-encefálico (TCE) é definida como lesão no cérebro de uma força mecânica externa. Mais vulgarmente, a partir de resultados de TCE forças de cabeça fechada, como forças rombas e aceleração inércia e forças de desaceleração que causam o cérebro para atingir o interior do crânio. Nos Estados Unidos, estima-se que 50.000 pessoas morrem a cada ano de TBI e 2,5-6.500.000 indivíduos estão a viver com as consequências do TCE, incluindo debilitante físico, cognitivo e problemas de comportamento 1,2. As conseqüências do TCE não são apenas devido a lesões mecânicas primárias para o cérebro, mas também a lesões celulares e moleculares secundários para o cérebro, bem como outros tecidos que ocorrem ao longo do tempo 3-5. O desenvolvimento de abordagens para diagnosticar e tratar o TCE tem provado ser difícil porque o TCE é um processo de doença complexa. A natureza variável de lesões primárias, fisiologia humana e fatores ambientais resulta em i secundário heterogêneonjuries e patologias. Factores variáveis ​​subjacentes incluem a gravidade da lesão primária, o tempo entre as lesões primárias repetitivas, e da idade e do genótipo do indivíduo. A compreensão de como cada fator variável contribui para as conseqüências de TBI é susceptível de ajudar no desenvolvimento de abordagens para diagnosticar e tratar TBI 6,7. Aqui nós descrevemos um método para infligir TBI cabeça fechada em Drosophila melanogaster (mosca da fruta) que pode ser usado para delinear a contribuição de fatores variáveis ​​para as consequências do TCE. O método baseia-se na observação inicial de que intensamente que bate no lado de um frasco de cultura mosca contra a palma de uma mão causada moscas do tipo selvagem para ficar temporariamente incapacitada, uma consequência provável da TBI. Assim, construímos o dispositivo High-Impact Trauma (HIT) recapitular as forças de aceleração e desaceleração a partir da ação de bater a mão. Um filme de alta velocidade mostra que um único golpe doHIT dispositivo faz com que voa para entrar em contato com a parede do frasco várias vezes com a cabeça eo corpo 8. Em certa medida, todos os contatos são susceptíveis de fazer com que o cérebro da mosca a ricochetear e deformar contra a cápsula cabeça, semelhante ao que acontece com os seres humanos em quedas e acidentes de carro 9. Assim, moscas tratados com os fenótipos visor do dispositivo HIT consistentes com lesão cerebral, incluindo a incapacidade temporária seguido por ataxia, a recuperação gradual da mobilidade, alterações de expressão gênica na cabeça, e neurodegeneração progressiva no cérebro 10. Assim, o dispositivo de HIT torna possível estudar TBI utilizando o enorme arsenal de ferramentas e técnicas desenvolvidas para moscas experimentais.

<table><tbody><tr><td>Mola de compressão zincada</td><td>A Hillman&nbsp; Grupo</td><td>540189</td><td>9 7/8 polegadas (comprimento, 2,2 cm), 15/16 polegadas (diâmetro externo, 2,4 cm), 0,12 polegadas (tamanho do fio, 0,3 cm)</td></tr><tr><td>Tábua</td><td></td><td></td> de madeira <td>9 polegadas (comprimento, 22,9 cm), 6,5 polegadas (largura, 16,5 cm), 0,75 polegadas (altura, 1,9 cm)</td></tr><tr><td>Braçadeiras</td><td>Sigma Electrical Manufacturing Corporation</td><td>49822</td><td>3,10 polegadas (comprimento, 7,9 cm), 0,68 polegadas (largura, 1,7 cm), 1,11 polegadas (altura, 2,8 cm), EMT Duas Correias de Furo, clique no tipo para 1 polegada (2,5 cm) conduíte de aço EMT</td></tr><tr><td>Laço metade de velcro</td><td></td><td></td> autoadesivo <td>3 polegadas (comprimento, 7,6 cm), (3/4 polegada largura, 1,9 cm)</td></tr> <tr><td>Tampa de balde de gelo de poliuretano</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-591-45</td><td>9 1/8 polegadas (comprimento, 23,2 cm), 9 1/8 polegadas (largura, 23,2 cm), 1 1/4 polegadas (altura, 3,2 cm)</td></tr><tr><td>Frascos de plástico para moscas</td><td>Applied Scientific</td><td>AS-510</td><td>3 11/16 polegadas (altura, 9,4 cm), 1 1/16 polegadas (diâmetro interno, 2,7 cm), 1 1/8 polegada (diâmetro externo, 2,9 cm)</td></tr><tr><td>Grandes bolas de algodão</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Transferidor</td><td></td><td></td> de papel <td>10 polegadas (diâmetro, 25,4 cm)</td></tr></tbody></table>

um método para infligir cabeça fechada lesão cerebral traumático em<em&gt; drosophila</em

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatismo crânio-encefálico (TCE) afeta milhões de pessoas a cada ano, causando comprometimento da saúde física, cognitiva e funções comportamentais e morte. Estudos utilizando Drosophila têm contribuído importantes avanços na compreensão de processos neurológicos. Assim, com o objetivo de compreender a base celular e molecular de patologias TCE em humanos, foi desenvolvido o dispositivo de Trauma de Alto Impacto (HIT) para infligir cabeça fechada TBI em moscas. Moscas submetidos aos fenótipos visor do dispositivo HIT consistentes com TBI humano, tais como incapacidade temporária e neurodegeneração progressiva. O dispositivo HIT usa um mecanismo baseado em mola para impulsionar moscas contra a parede de um tubo de ensaio, provocando danos mecânicos ao cérebro mosca. O dispositivo é barato e fácil de construir, a sua operação é simples e rápida, e que produz resultados reprodutíveis. Por conseguinte, o dispositivo de HIT pode ser combinada com as ferramentas experimentais existentes e técnicas de moscas para tratar fundamentaisdúvidas sobre TCE que podem levar ao desenvolvimento de diagnósticos e tratamentos para o TCE. Em particular, o dispositivo HIT pode ser usado para realizar telas genéticos em grande escala para compreender a base genética de patologias TBI.

Estamos interessados ​​em entender por que as moscas morrem logo após a lesão primária. Para quantificar a morte, determinou-se o Índice de mortalidade às 24 horas (MI 24), que é a percentagem de moscas que morreram dentro de 24 horas da lesão primária. Moscas sujeitos a ataques do dispositivo HIT foram incubadas a 25 ° C num frasco com comida mosca, e o número de moscas mortas foi contado após 24 horas. Utilizou-se esta abordagem para identificar os factores que afectam a MI 24 e descobriram que o...

Aqui nós descrevemos um método para infligir a cabeça fechado traumatismo crânio-encefálico (TCE) em Drosophila. Este método oferece um portal para investigar os mecanismos celulares e moleculares que estão na base patologias TCE, utilizando a vasta gama de ferramentas experimentais e técnicas disponíveis para as moscas.

Um Método para infligir Cabeça Fechada Lesão cerebral traumático em<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

O objetivo geral deste procedimento é provocar uma lesão cerebral traumática de crânio fechado em moscas. Isso é realizado primeiramente colocando as moscas em um tubo a uma polegada do fundo.O segundo passo é fixar o frasco ao dispositivo HIIT. Em seguida, a mola é desviada até um determinado ângulo e o frasco é liberado, permanecendo em repouso completo. Por fim, uma variedade de ensaios comportamentais, morfológicos e moleculares pode ser utilizada para caracterizar as consequências do trauma cerebral resultante.A principal vantagem deste método em relação aos métodos existentes, como o método de queda de peso em roedores, é que muitos animais podem ser estudados em um curto período de tempo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de lesão cerebral traumática, como por que as consequências da lesão cerebral traumática variam entre diferentes indivíduos. Para começar, monte os materiais brutos listados na tabela um do protocolo de texto complementar.Dobre as braçadeiras com um alicate para que se ajustem firmemente à mola. Em seguida, posicione as braçadeiras centralizadas em relação à largura da tábua e encoste-as uma na outra, com a braçadeira extern

a-method-to-inflict-closed-head-traumatic-brain-injury-in-drosophila

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Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um procedimento para infligir uma lesão traumática de cabeça fechada em moscas Drosophila anestesiadas usando um dispositivo de ataque com um impactador movido a gás. A lesão afeta a função neuronal e prejudica a capacidade de caminhar.

Uma técnica para infligir lesão cerebral traumática de cabeça fechada em moscas Drosophila

Este vídeo demonstra um método para induzir lesão neuronal direcionada em larvas de Drosophila usando um laser de alta potência. Depois de posicionar a larva sob um microscópio, um laser de baixa potência procura neurônios fluorescentes e, em seguida, a potência do laser é aumentada para induzir danos localizados. A lesão é confirmada pelo aumento da fluorescência e uma cratera no local da lesão.

Induzindo lesão neuronal direcionada usando um laser de alta potência em uma larva de Drosophila

O vídeo demonstra o uso de um dispositivo de trauma de alto impacto (HIT) para induzir traumatismo cranioencefálico (TCE) de cabeça fechada em Drosophila. O TCE causa trauma cerebral mecânico que afeta a função neuronal, o que, com o tempo, leva à neurodegeneração e mortalidade.

Um método para infligir traumatismo cranioencefálico fechado na cabeça em Drosophila

Este vídeo demonstra a indução de lesão cerebral traumática penetrante no cérebro da drosófila. As moscas recém-emergidas são selecionadas, anestesiadas e posicionadas sob um microscópio estéreo equipado com fluorescência. O corpo do cogumelo que expressa GFP é identificado e um pino Minutien é inserido para causar ferimentos. As moscas podem se recuperar para estudos posteriores.

Induzindo Lesão Cerebral Traumática Penetrante em Moscas Drosophila Adultas

Fonte: Logsdon, A. F., et al. Modelo de onda de choque de baixa intensidade para avaliação pré-clínica de lesão cerebral traumática leve de cabeça fechada em roedores. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a indução de lesão cerebral traumática leve na cabeça fechada em um modelo de camundongo usando uma configuração de tubo de choque de gás pressurizado. A onda de pressão gerada rompe a membrana de poliéster, entregando uma onda de choque na cabeça do camundongo que resulta em um rápido...

Gerando um Traumatismo Cranioencefálico Leve de Cabeça Fechada em um Modelo Murino

Aqui, descrevemos uma nova abordagem para infligir lesões cerebrais traumáticas de cabeça fechada em Drosophila melanogaster . Nosso método tem a vantagem de entregar diretamente impactos repetitivos com força ajustável para a cabeça sozinho. Uma maior exploração do sistema de invertebrados ajudará a iluminar a patogênese da encefalopatia traumática crônica.

Um novo método para modelar a encefalopatia traumática crônica em<em&gt; Drosophila</em

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando a drosófila neurônio sensorial - modelo de lesão do neurônio arborização dendrítica (da), que combina na vivo ao vivo de imagens, dois fotões do laser axotomy/dendriotomy e poderoso toolbox genético mosca, como uma plataforma para a seleção de potenciais promotores e inibidores de Epilepsias.

Um modelo de lesão in vivo em Drosophila para estudar a neuroregeneração do sistema nervoso periférico e central

Aqui, fornecemos protocolos para realizar três ensaios simples de degeneração de axôntoinduzidos induzidos por lesões (morte de axônto) em Drosophila melanogaster para avaliar a preservação morfológica e funcional de axôntos cortados e suas sinapses.

Avaliação morfológica e funcional de Axons e suas sinapses durante a morte de Axon em Drosophila melanogaster

Este artigo fornece protocolos detalhados para infligir Lesão Cerebral Traumática Penetrante (PTBI) à Drosophila adulta e examinar a neurogênese resultante.

Estimulando e analisando neurogênese adulta no cérebro central de Drosophila

Este protocolo apresenta um modelo de camundongo modificado de lesão cerebral traumática leve repetitiva (rmTBI) induzida por um método de traumatismo cranioencefálico fechado (CHI). A abordagem apresenta uma janela de crânio afinado e percussão de fluido para reduzir a inflamação comumente causada pela exposição às meninges, juntamente com melhor reprodutibilidade e precisão na modelagem de rmTBI em roedores.

Modelo de camundongo modificado de lesão cerebral traumática leve repetitiva incorporando janela de crânio afinado e percussão fluida

Este estudo apresenta um protocolo simplificado para processamento de tecidos envolvendo decapitação, fixação, criosecção, coloração de fluorescência, imunocoloração e imagem, que pode ser estendido para imagens confocais e multifotônicas. O método mantém uma eficácia comparável a dissecções complexas, ignorando a necessidade de habilidades motoras avançadas. A análise quantitativa de imagens fornece amplo potencial investigativo.

Crioseccionamento direto de cabeças de Drosophila para coloração e imunocoloração aprimoradas de fluorescência cerebral

Aprenda a induzir lesão cerebral traumática de cabeça fechada em Drosophila usando o dispositivo HIIT. Este método permite investigar mecanismos celulares e moleculares da TBI com ensaios comportamentais e moleculares.

Um Método para infligir Cabeça Fechada Lesão cerebral traumático em

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