Name: Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica In Vivo A exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a medir danos e reparo de DNA em esplenócitos de camundongo após exposição crônica a radiação beta e gama de baixa dose usando citometria de fluxo e marcação de H2AX.

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Os autores gostariam de agradecer a contribuição de nossos colegas Sandrine Roch-Lefevre e Eric Gregoire do Instituto de Radioproteção e Segurança Nuclear (Paris, França). Este trabalho foi apoiado pelo programa de Ciência e Tecnologia do Governo do Canadá nos Laboratórios Nucleares Canadenses (Chalk River, Ontário, Canadá), pelo Grupo de Proprietários CANDU (Toronto, Ontário, Canadá), pela Comissão Canadense de Segurança Nuclear e pelo Instituto de Radioproteção e Segurança Nuclear (Paris, França).

Todos os procedimentos de manuseio e tratamento do mouse devem aderir a regras estabelecidas pelos programas legislativo e / ou de cuidados de animais e aprovados por um comitê de cuidados com os animais local. Todos os métodos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care com a aprovação do comitê de cuidados com os animais local. ATENÇÃO: Todos os trabalhos com radioatividade (incluindo, mas não limitado a manipulação do trítio, γ-irradiação externa, manipulação de tecidos animais, resíduos radioativos cama) devem aderir a regras estabelecidas pelas autoridades legislatura e / ou protecção contra as radiações e ser executada por pessoal autorizado pessoal em um laboratório e / ou instalação de certificado. 1. Trabalho animal <ol><li> Agrupamento animal <ol><li> Se os ratos estiver chegando de uma organização externa, aclimatar os animais durante pelo menos 10 dias na unidade animal. Se o estudo inclui vários grupos de tratamento, garantir que o fornecedor animal pode enviar all animais como um único lote. </li><li> Alocar aleatoriamente ratinhos em grupos de tratamento de 10 ratinhos por grupo. Se estiver usando ratos machos da estirpe C57BL / 6, temos o fornecedor de animais pré-organizar randomização de muito jovens C57BL / 6 do sexo masculino em suas instalações para mitigar problemas de agressão. </li></ol></li><li> A exposição crônica de ratos para Internal Radiation β- <ol><li> Prepare as concentrações de trabalho de trítio (10 kBq / L e um MBq / l) em água potável rato diluindo o estoque original da HTO e OBT (uma mistura de prolina tritiada, alanina e glicina ácidos aminados) soluções. </li><li> Validar as concentrações finais de trítio na água de beber, medindo a radioactividade utilizando um contador de cintilação líquida. Ajuste concentrações, se necessário. </li><li> Tratar os animais durante um mês, fornecendo ad libitum acesso à água trítio. Se a água de tratamento fica baixa durante o período de duas semanas, adicione mais água. De outro modo, alterar garrafas em duas semanas. </li><li> Tratar sham irradiado controleratos de forma idêntica. Mantê-los em uma sala &quot;limpa&quot; em separado ou em um rack &quot;limpa&quot; em separado sob pressão de ar positiva para evitar a contaminação cruzada trítio a partir do ar. </li></ol></li><li> A exposição crônica de ratos para External γ-Radiação Nota: facilidade γ-irradiação / equipamento irá variar dependendo da localização. </li><li> Usando os métodos disponíveis de dosimetria, determinar as distâncias de uma fonte de radiação-γ que têm campos de radiação que produzem as doses desejadas. Assegurar a homogeneidade dos campos de radiação dentro das áreas que abrangem as gaiolas dos animais. Nota: 1,7 Gy / h é equivalente a uma taxa de dosagem produzida por um MBq / L trítio no corpo. </li><li> Expor ratinhos por gaiolas colocação do rato a distâncias determinadas no passo 1.3.1, durante um mês. Minimizar interrupção diária de γ-irradiação de 30 min. Use dosímetros termoluminescentes para medir doses totais absorvidas. </li></ol> 2. Sacrifícios e Amostragem <ol&gt; <li> Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis, 60 milímetros pratos de petri com inseridos filtros celulares de 70 micron, 15 ml e 1,5 ml tubos, meio RPMI suplementado com soro fetal bovino a 5% (FBS) e coloque tudo dentro de uma cabine de segurança biológica. Garantindo a esterilidade do trabalho é crucial. </li><li> Pipetar 5 ml de meio RPMI em cada placa de 60 mm de petri. </li><li> Sacrifício camundongos, usando um método aprovado pelo comitê de cuidados com os animais local. Luxação cervical é uma boa escolha para o trabalho esplenï¿½ito descrito neste protocolo. No entanto, se são necessárias amostras de sangue para outros ensaios (por exemplo, para o mFISH, o bloco de micronúcleos citocalasina ou outros ensaios genetoxicity comum), use punção intra-cardíaca após anestesia com isoflurano. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal, com a cabeça apontando para longe de você. Pulverizar o mouse para baixo com etanol 70%. Utilizando uma pinça, pegue a pele anteriormente à abertura da uretra e fazer uma pequena incisão com tesoura na região perineal. <ol&gt; <li> A partir dessa incisão, cortada ao longo da linha média ventral para a cavidade torácica, tendo o cuidado de corte apenas a pele e não a parede muscular debaixo. Dissecar a pele longe da linha média. </li><li> Agarrar a parede abdominal com uma pinça e cortar ao longo do eixo mediano da parede muscular para abrir a cavidade abdominal. </li></ol></li><li> Extirpar o baço levemente segurando-o com uma pinça estéril e delicadamente puxando-o, ao mesmo tempo cortando o tecido conjuntivo com uma tesoura. </li><li> Corte um pequeno pedaço do baço (aproximadamente 1/10 do baço) e coloque em um tubo de 1,5 ml. Pressão congelar em azoto líquido para posterior armazenamento a -80 ° C para ensaios suplementares. </li><li> Inserir o restante do baço em um filtro de células dentro de uma placa de petri de 60 milímetros com 5 ml de meio RPMI pré-dispensada. </li><li> Prossiga para a próxima mouse. Nota: Extraído baços podem ser mantidos em placas de 60 mm com meio (por até 2 horas), enquanto o resto dos ratos são sacrificed. Dependendo do número de pessoas que participam, entre 5 e 15 ratos podem ser processados ​​no mesmo dia. </li></ol> 3. Preparação das Culturas esplenócitos <ol><li> Homogeneizar o baço por picados dentro de um filtro de células com pinça estéril com uma extremidade curva. </li><li> Remover o filtro celular e recolher a suspensão de células filtradas da placa de 60 mm para um tubo de 15 ml. </li><li> Lavar o filtro de células com 5 ml de meios para recolher o restante das células. </li><li> Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min à TA. </li><li> Decantar o sobrenadante e re-suspensão da pelota em 10 ml de RPMI. </li><li> Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min à TA. </li><li> Decantar o sobrenadante e re-suspensão da pelota em 5 ml de meio RPMI. </li><li> Transferência de 4 ml de suspensão de células para um frasco de cultura de tecido de 25 ml e remover para um incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO2, 80% de humidade) </li></ol> 4. Desafiando irradiação e Fixação <ol><li> Transferir orestante 1 ml de suspensão de células a partir do passo 3.8 em um tubo de 1,5 ml em gelo e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Danos no ADN medido na amostra irá representar tanto o dano induzido por tratamento e t = 0 ponto de dados para a construção de uma curva de reparação do ADN. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante através de uma bomba de vácuo. Gentilmente re-suspender sedimento em 1 ml de tampão TBS (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM). </li><li> Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante através de uma bomba de vácuo. Delicadamente ressuspender sedimento em 300 mL de TBS. </li><li> Enquanto se mistura num vórtice a baixa velocidade, adiciona 700 ul de etanol a -20 ° C, 100%. Fechar a tampa e inverter algumas vezes para misturar. </li><li> Armazenar as amostras a -20 ° C. Os esplenócitos fixos em etanol podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos 12 meses sem qualquer perda perceptível no sinal γH2AX. </li><li> Irradiar as culturas de esplenócitos a partir do passo 3.8 com um desafio γ-Rad<html> dose de iation de 2 Gy em uma taxa de dose ≥ 200 mGy / min usando disponível dispositivo de irradiação. Nota: O objetivo desta irradiação é induzir DNA DSB para desafiar a maquinaria de reparo. Raios-X também pode ser utilizado para este fim. </li><li> Retornar imediatamente as culturas para uma incubadora de CO 2. </li><li> 1 hora após o desafio 2 Gy irradiação, retire as culturas da incubadora para uma cabine de segurança biológica. Para recolher uma alíquota de amostra representativa, gentilmente re-suspender as células utilizando um pipetador e transferir 1 ml da suspensão de células para um tubo de 1,5 ml em gelo. Retorno das culturas de células para uma incubadora de CO 2. </li><li> Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante através de uma bomba de vácuo. Gentilmente re-suspender sedimento em 1 ml de TBS. </li><li> Repita os passos 4,3-4,5. </li><li> 24 horas após o desafio 2 Gy γ-irradiação, a colheita e fixar a amostra = 24 horas, tal como descrito no passo 4,8-4,10. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. Labeling Immunofluorescent com Anti-γH2AX Antibody Nota: Normalmente, 15-30 amostras por dia pode ser rotulada imunofluorescência e analisadas por citometria de fluxo em uma única corrida. Para garantir uma comparação rigorosa entre os grupos de tratamento, incluem a amostra (s) a partir de cada grupo. Consulte também Referência 16 para mais detalhes. <ol><li> Preparar um conjunto rotulada de tubos para o número de amostras a serem processadas e colocar no gelo. Use 12 x 75 milímetros tubos de vidro não niveladas. A esterilidade não é necessário para este trabalho. Incluir uma amostra de controlo histórico adicional para marcação com anticorpo secundário somente (&quot;unicamente segundo Ab&quot;). Utilize esta amostra de controlo histórico em todos os citometria de fluxo executado dentro de um estudo. </li><li> Adicionar 0,5 ml de TBS arrefecida em gelo a cada tubo. </li><li> Remover esplenócitos fixos de -20 ° C, de vórtice durante 5 segundos e transferir uma alíquota de 0,5 ml para tubos preparados com TBS. Inserir o restante das amostras de volta para -20 ° C e armazenagemmanter como uma amostra de backup. </li><li> Esplenócitos centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de TBS gelado contendo 1% de FBS </li><li> Células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de tampão TE (0,05% de Triton X-100, 2% de FBS em TBS). Incubar durante 20 min em gelo. </li><li> Células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 200 ul de anticorpo anti-γH2AX primário diluído 1: 150 em tampão TST. Use 200 mL de TST para o &quot;único 2 Ab&quot; amostra de controlo. </li><li> Tubos de posição sobre um agitador rotativo com um ângulo de 45-60 ° e agitar durante 1,5 horas a 300 xg à temperatura ambiente. </li><li> Enquanto os tubos são a incubação, preparar um volume suficiente (200 ul / amostra) de cabra anti-ratinho anticorpo secundário conjugado com Alexa-488 a uma diluição de 1: 200 em tampão TST. Nota: Todo o trabalho envolvendo Alexa-488anticorpo conjugado (passos 5,10-5,16 abaixo) deve ser feita sob condições de pouca luz e amostras marcadas deve ser protegido da luz por envolvimento tubos em papel de alumínio. </li><li> Uma vez que a incubação de 1,5 horas está completado, adicionar 1 ml de TBS gelado contendo 2% de FBS a cada um dos tubos e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de TBS contendo 2% de FBS. </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 200 ul de solução de anticorpo secundário a partir do passo 5.8. </li><li> Incubar as amostras em uma plataforma de agitação durante 1 hora como no passo 5.7. </li><li> Adicionar 1 ml de TBS gelado contendo 1% de FBS. </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de TBS arrefecida em gelo. </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 0,5 ml de TBS contendo 50 ug / mliodeto de propídio. </li><li> Incubar durante 5 min à temperatura ambiente protegida da luz. </li><li> Analisar amostras em um citômetro de fluxo, utilizando protocolos específicos do aparelho 16. Ler, pelo menos, 10.000 células por amostra. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não há interesses financeiros concorrentes conhecidos.

O protocolo apresentado neste artigo é útil para a realização de rato grande escala estudos in vivo que examinam os efeitos genotóxicos de baixos níveis de vários agentes químicos e físicos, incluindo a radiação ionizante. Nossa biotério livre de patógenos específicos único equipado com um irradiador Gammabeam 150 e um salão de 30 metros de comprimento irradiação permite a realização de estudos ao longo da vida que envolvem irradiações baixa ou muito baixa taxa de dose em centenas ou mesmo milhares de ratos. Pe...

Controvérsia significativa sobre os potenciais efeitos nocivos, tanto de doses baixas ou muito baixas de radiação e medo do público de radiação, impulsionado por imagens dos bombardeios atômicos de Hiroshima e Nagasaki e de acidentes em usinas nucleares raros ionizante (exacerbada pelos meios de comunicação de massa), tem levado a muito estrita regulação protecção contra as radiações e padrões que não são potencialmente justificada cientificamente. Nas últimas três décadas, numerosos relatórios têm documentado tanto a falta de nocivos e a presença de efeitos biológicos potencialmente benéficos induzidos pela baixa dose de radiação 1-4. O principal fator de risco para a saúde da radiação é a probabilidade de câncer, estimado com base em estudos epidemiológicos de sobreviventes da bomba atômica que receberam doses elevadas ou médias de radiação. Extrapolação linear destes dados (os chamados linear não-limiar ou modelo LNT) é utilizada para estimar os riscos de cancro em doses baixas. No entanto, esta abordagem não tem recebido aceitação científica mundiale é fortemente debatido 5. É evidente que mais estudos são necessários para esclarecer esta questão e, eventualmente, melhorar os padrões de protecção contra as radiações. Esses estudos devem envolver tratamentos crônicos (melhor aproximação das exposições ambientais e ocupacionais), em modelos animais in vivo (melhor para efeitos para a saúde humana) e extrapolar esses pontos finais como taxas de danos no DNA, reparo do DNA e mutagênese. Sabe-se que o DNA é o alvo principal para efeitos de radiação prejudicial e incompleta ou mis-reparação pode levar a mutagênese e câncer desenvolvimento 6. ADN quebras de cadeias duplas (DSB) são um dos tipos mais deletérios de lesões do ADN e podem levar a morte celular e a tumorigénese 7. É, portanto, importante ser capaz de medir com segurança e precisão o nível de ORL após a exposição à radiação de baixa dose e / ou outros factores de stress, tais como poluentes químicos. Um dos marcadores mais sensíveis e específicosde DSB de ADN é fosforilado histona H2AX, chamado γH2AX 8, ainda outros marcadores e métodos têm sido sugeridos 9,10. Estima-se que milhares de moléculas de H2AX, na vizinhança de uma DSB induzidos, estão envolvidos na formação de γH2AX possibilitando a detecção de ORL indivíduo por marcação imunofluorescente com um anticorpo e microscopia de fluorescência de anti-γH2AX 11. A resposta é muito rápido, atingindo um máximo entre 30 e 60 min. Existem evidências de que γH2AX facilita o reparo de DNA DSB, atraindo outros fatores de reparação para os sites de pausas e modificando a estrutura da cromatina para ancorar as extremidades do DNA quebrados e fornecer acesso para outras proteínas de reparo (revisto em 12). Após a conclusão do reparo de DNA DSB, γH2AX fica de-fosforilada e / ou sofre degradação, e moléculas H2AX recentemente sintetizadas substituir γH2AX nas áreas afetadas da cromatina 10. Formação e perda de γH2AX Monitoramento pode,portanto, fornecer uma estimativa precisa da cinética de reparo de DNA DSB. Esta abordagem tem sido utilizada para estudar a reparação de DSB em várias linhas celulares tumorais humanas irradiadas com doses elevadas de radiação e a sua taxa de DSB e níveis residuais foram mostrados para correlacionar com radiossensibilidade 13-15. Nós modificamos essa abordagem experimental e aplicou-a a um estudo de rato in vivo para examinar os efeitos de baixas doses de γ- crônica e β-irradiação sobre os níveis de ADN DSB e reparação (Figura 1). Em primeiro lugar, nós demonstramos um método para executar uma exposição crónica a longo prazo de ratinhos para β-radiação emitida pela ou trítio (hidrogénio-3) sob a forma de água tritiada (HTO) ou como trítio ligado organicamente (OBT) dissolvido na água potável . As duas formas são de esperar a acumulação e / ou distribuir de forma diferente no corpo e, por conseguinte, produzir diferentes efeitos biológicos. Ambas as formas são possíveis riscos na indústria nuclear. Este tratamentoé comparada com a exposição crónica à radiação-γ a uma taxa de dosagem equivalente a permitir uma comparação correcta dos dois tipos de radiação, que é fundamental para a avaliação da sua eficácia biológica relativa. -Radiação Beta é composto de electrões, tornando-se muito diferente da radiação γ, fotões de alta energia. Devido a esta diferença, Β-radiação representa perigo para a saúde na maior parte interna e pode produzir diferentes efeitos biológicos em comparação com γ-radiação. Esta complicação resultou em controvérsias significativas sobre a regulação da exposição a β-radiação emitida pelo HTO. Assim, os níveis regulatórios de HTO na água potável para o público variam de 100 Bq / L na Europa para 75.000 Bq / L na Austrália. É, portanto, importante para comparar os efeitos biológicos de HTO a doses equivalentes de γ-radiação. Em segundo lugar, a taxa de DNA DSB é medido em esplenócitos isolados após a conclusão de exposições crônicas usando imunofluorescência marcado γH2AX detectared por citometria de fluxo. Isto permite a avaliação da extensão do dano do ADN infligido por as exposições in vivo. No entanto, é sensato esperar que tais exposições de baixo nível pode não produzir quaisquer taxas detectáveis ​​de DNA DSB; em vez disso, algumas alterações ocultas / respostas pode-se esperar que afetariam a capacidade das células para reparar danos no DNA. Estas alterações, quando detectado, pode ser ou estimulador (a produção de um efeito benéfico) ou inibidor (que produz um efeito deletério). O protocolo proposto permite revelar tais alterações por desafiar os esplenócitos extraídos com uma dose elevada de radiação que produza uma quantidade significativa de danos (por exemplo, 2 Gy produzindo aproximadamente 50 DSB de ADN por célula ou um 3 -. Aumento de 5 vezes no nível γH2AX total) . Subsequentemente, a formação e a perda de γH2AX, reflectindo o início e conclusão de reparação de DSB, é monitorizada por citometria de fluxo. Desta forma, não só os níveis basais e induzida por tratamento de DSB de ADN pode ser medido, mastambém o seu efeito potencial sobre a capacidade das células para responder e reparar danos ao DNA induzidos por níveis muito mais elevados estressores.

<table><tbody><tr><td>HTO: água tritiada, [3H]</td><td>obtida localmente de um reator nuclear&nbsp;</td><td></td><td>atividade de estoque 3,7 GBq/mL;&nbsp; pode ser substituído por HTO da Perkin Elmer</td></tr><tr><td>OBT: Alanina, L-[3-3H]: trítio ligado organicamente (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET348005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Glicina, [2-3H]: trítio ligado organicamente</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET004005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Prolina, L-[2,3-3H]: trítio ligado organicamente (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET323005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>água tritiada, [3H] (HTO)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET001B005MC</td><td>substituto para HTO de origem local&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>O irradiador GammaBeam 150</td><td>Atomic Energy of Canada Limited</td><td>fabricado localmente</td><td>pode ser substituído por outra fonte de radiação g de atividade suficientemente baixa&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td>Hyclone RPMI 1640 com L-Glutamina e HEPES 500mL</td></tr><tr><td>soro fetal bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051-100ML</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-gH2AX, clone JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 anticorpo anti-camundongo de cabra</td><td>Life Technologies (anteriormente Invitrogen)</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>iodo propídio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Álcoois Comerciais</td><td>P006-EAAN Garrafas de</td><td>500 ml Etanol Absoluto</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml</td> Tubos <td>de</td><td>microcentrífuga</td>2682550 <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml Tubos</td> de <td>centrífuga de polipropileno estéreis</td> <td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td></tr><tr><td>nitrogênio líquido</td><td>Linde</td><td>P110403</td><td></td></tr><tr><td>tubos de vidro sem tampa de 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>K60B1496126</td><td>tubos de vidro borossilicato descartáveis com extremidade lisa</td></tr><tr><td>Frascos T25</td><td>VWR</td><td>CA15708-120</td><td>nunc tisue cultura Frasco de 25ml (fornecedor nº 156340)</td></tr> <tr><td></td><td>Tesoura Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td>Tesoura Wagner 12 cm pinça afiada/afiada</td></tr><tr><td>, reto</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>Semken fórceps 13 cm,</td></tr><tr><td>fórceps reto, curvo</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>Narrow Pattern fórceps 12 cm, curvo</td></tr><tr><td>60 mm placas de Petri</td><td>VWR</td><td>CA25382-100</td><td>BD Falcon Placa de cultura de tecidos 60 x 15 mm</td></tr><tr><td>filtros de células, 70 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Filtros de células Falcon 50/caixa</td></tr><tr><td>Receita PBS: 1 comprimido dissolvido em 200 ml de água deionizada, ajuste o pH para 7,4 se necessário.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Comprimidos de Solução Salina Tamponada com Fosfato</td></tr><tr><td>TBS receita: para fazer 10x estoque</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 g TRIS HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-1KG</td><td>Cloridrato de Trizma</td></tr><tr><td>88 g</td><td>NaCl Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Cloreto de Sódio</td></tr><tr><td>2 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500 Cloreto de</td><td>Potássio</td></tr><tr><td>Dissolva em 1 L de água deionizada, ajuste o pH para 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medindo danos dna e reparar no mouse esplenócitos depois crônica<em&gt; in vivo</em&gt; a exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Exposição à radiação de dose baixa pode produzir uma variedade de efeitos biológicos, que são diferentes em quantidade e qualidade dos efeitos produzidos por doses elevadas de radiação. Abordar questões relacionadas com a segurança da saúde ambiental, ocupacional e público de uma forma adequada e cientificamente justificada depende fortemente a capacidade de medir com precisão os efeitos biológicos de poluentes doses baixas, como as substâncias químicas e radiação ionizante. Danos e reparação do ADN são os mais importantes indicadores precoces de riscos para a saúde devido às suas potenciais consequências a longo prazo, como o cancro. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar o efeito da crônica exposição in vivo a doses baixas de radiação β γ- e sobre os danos e reparação do ADN em células de baço de ratinho. Usando um marcador geralmente aceite de quebras de ADN de cadeia dupla, histona H2AX fosforilada chamado γH2AX, demonstramos como ele pode ser usado para avaliar não só os níveis de danos no DNA, mas também mudana capacidade de reparo do DNA potencialmente produzido por dose baixa em exposições in vivo. A citometria de fluxo permite a medição rápida, precisa e fiável de imunofluorescência marcado γH2AX em um grande número de amostras. ADN de cadeia dupla reparação de quebras pode ser avaliada por exposição esplenócitos extraídos a uma dose desafiadora de 2 Gy de produzir um número suficiente de ADN para provocar quebra reparação e medindo o induzido (1 h pós-irradiação) e danos no ADN residual (24 hrs pós-irradiação). Danos no ADN residual seria indicativo de reparação incompleta e o risco de instabilidade genómica longo prazo e cancro. Combinado com outros ensaios e de pontos finais que podem ser facilmente obtidos em tais estudos in vivo (por exemplo, as aberrações cromossômicas, freqüências de micronúcleos em reticulócitos de medula óssea, a expressão do gene, etc.), esta abordagem permite uma avaliação precisa e contextual dos efeitos biológicos estressores de baixo nível.

A Figura 2 mostra exemplos de citometria de fluxo gráficos esperados para os esplenócitos preparados utilizando o método descrito aqui. As células são primeiro fechado com base na &lt;eletrônico dispersão volume-lateral&gt; gráfico de dispersão (Figura 2A e 2D, volume eletrônico é equivalente a dispersão para a frente). FL3 / propidium histogramas de iodo (Figura 2B e 2E) confirmar distribuição normal do ciclo celular. Sinal γH2AX calcu...

Um protocolo para avaliar alterações nos níveis de dano ao DNA e na capacidade de reparo do DNA que podem ser induzidas por irradiação crônica in vivo de baixa dose em linfócitos do baço de camundongo, medindo a histona fosforilada H2AX, um marcador de quebras de fita dupla de DNA, usando citometria de fluxo é apresentado.

Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica<em&gt; In Vivo</em&gt; A exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir os danos ao DNA e sua reparação induzidos em células do baço de camundongos pela exposição crônica in vivo a baixas doses de radiação beta ou gama. Isso é alcançado primeiramente expondo os camundongos à irradiação beta interna ou gama externa para desencadear possíveis alterações nos danos ao DNA e na sua reparação. Como segundo passo, os linfócitos PLE são isolados e irradiados com uma dose elevada de desafio de radiação gama, induzindo danos ao DNA detectáveis, o que permite o monitoramento da reparação do DNA.Com o tempo, as células do baço são então marcadas imunofluorescentemente contra a gama H2A.x para permitir a quantificação dos danos ao DNA. Em última análise, os danos ao DNA produzidos por doses de radiação gama aguda tão baixas quanto 10 centigray podem ser medidos por citometria de fluxo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da radioproteção, como, por exemplo, se doses baixas de radiação tipicamente encontradas em ambientes ocupacionais, médicos ou públicos realmente aumentam a probabilidade de efeitos adversos à saúde, tais como o câncer.As principais vantagens da nossa técnica em compar

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

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Biology

Biologia

Quantificação de DNA dupla fita-breaks, com base em γH2AX focos tem se tornado uma ferramenta valiosa, especialmente na biologia da radiação, para a avaliação da radiossensibilidade de tecidos e os efeitos de compostos de radiação modificando. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para quantificação de γH2AX focos em amostras de tecido.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

Descrevemos aqui uma plataforma que permite a detecção de teste do cometa de danos no DNA, com taxa de transferência sem precedentes. Os padrões de dispositivos de células de mamíferos para um microarranjo e permite o processamento em paralelo de amostras 96. A abordagem facilita a análise de danos ao DNA nível base, danos ao DNA induzidos por exposição e reparo do DNA cinética.

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

Descrevemos aqui um ensaio in vivo de mutagénese para pequenos números de células hematopoiéticas purificados utilizando o modelo de ratinho transgénico Lacl. O gene LacI pode ser isolado para determinar a frequência, a localização eo tipo de mutantes de DNA espontaneamente surgido ou após a exposição ao genotoxinas.

A identificação de DNA Mutações em Purificada-Tronco Hematopoéticas / células progenitoras

A administração de dois análogos de timidina, EdU e BrdU, em ratinhas grávidas permite a análise da progressão do ciclo celular em células progenitoras neurais e no cérebro do rato embrionário. Este método é útil para determinar os efeitos do stress genotóxico, incluindo a radiação ionizante, durante o desenvolvimento do cérebro.

Avaliando a progressão do ciclo celular de tronco neurais e as células progenitoras no desenvolvimento do cérebro do rato após estresse genotóxico

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

Fluorescência confocal laser e microscopia microirradiação oferta ferramentas para indução de dano do ADN e monitoramento da resposta das proteínas de reparo de DNA em áreas selecionadas do sub nucleares. Esta técnica tem significativamente nosso conhecimento avançado de detecção de danos, sinalização e recrutamento. Este manuscrito demonstra essas tecnologias para examinar reparação simples e dupla vertente.

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Este protocolo descreve vários procedimentos para a preparação de amostras de tecido congelado de alta qualidade no momento da necropsia para uso no ensaio do cometa para avaliar danos no DNA: 1) tecido picado, 2) células epiteliais raspadas do trato gastrointestinal e 3) tecido em cubos amostras, necessitando de homogeneização usando um dispositivo de picar tecido.

Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

O trato gastrointestinal é um dos órgãos mais sensíveis à lesão no tratamento radioterápico do câncer. É simultaneamente um sistema orgânico com uma das mais altas capacidades regenerativas após tais insultos. O protocolo apresentado descreve um método eficiente para estudar a capacidade regenerativa do epitélio intestinal.

Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante

A manutenção da integridade do genoma do ovócito é necessária para garantir a fidelidade genética no embrião resultante. Aqui, apresentamos um protocolo preciso para detectar quebras de fita dupla de DNA em células germinativas femininas de mamíferos.

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

O protocolo descreve um estudo dos efeitos sistêmicos e locais da exposição ao ultravioleta B na pele em camundongos.

Estudando a exposição crônica de camundongos à radiação ultravioleta B 

Aprenda a medir danos e reparo de DNA em esplenócitos de camundongo após exposição crônica a radiação beta e gama de baixa dose usando citometria de fluxo e marcação de H2AX.

Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica In Vivo A exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação (Vídeo) | JoVE Journal

Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica

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