Name: Um In Vitro Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a medir respostas imunes inatas à malária em indivíduos com HIV usando Plasmodium falciparum e análise de citometria de fluxo. Este modelo in vitro ajuda a compreender a co-infecção e desenvolver estratégias terapêuticas.

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C.A.M.F. e L.S. participaram da concepção do protocolo, aquisição e análise dos dados e redação do artigo. 
Os autores desejam agradecer ao Dr. Kain, Dr. Loutfy, Dr. Wasmuth e Dr. Ayi por suas contribuições.
C.F. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN). L.S. é apoiado por um Prêmio de Desenvolvimento de Investigador Júnior da OHTN. O presente trabalho foi apoiado por uma bolsa operacional do Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-13721 e 115160) e uma bolsa CIHR New Investigator Catalyst.

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<li>Venkataraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+immune+responses.+X.+Decrease+in+interleukin-12+production+by+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+by+the+endogenously+hypersecreted+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10.</a> Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nosso protocolo foi optimizado, a fim de estudar mais realisticamente co-infecção com HIV-malária in vitro. Em primeiro lugar, os glóbulos vermelhos humanos frescos e soro são necessários para a cultura parasita da malária. Isso é vital para obter uma população saudável de parasitas da malária. Os lisados ​​de parasitas não pode ser substituído por parasitas vivos como a produção de citoquinas é muito mais rápida e intensa quando se utiliza vivo P. RBC infectados falciparum (PfRBC) 17,18....

Co-infecção, a infecção com múltiplas infecções simultâneas, é a norma em ambientes naturais. A co-infecção pode ter um impacto importante na patologia da doença e na gestão clínica de cada infecção. No contexto da co-infecção, vacina e a eficácia do fármaco, bem como os testes de diagnóstico, podem ser influenciadas negativamente (revisto em 1). No entanto, apesar da sua importância, a maioria das pesquisas patógeno considera infecções única individuais. Malária e HIV-1 (HIV) são as principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Áreas de malária e HIV endemicidade compartilhar uma ampla sobreposição geográfica, colocando milhões de pessoas em risco de co-infecção e, conseqüentemente, em risco de doença clínica mais grave 2-10. As duas doenças interagir negativamente. Em indivíduos infectados pelo HIV, a carga viral mais elevados e diminuições temporárias em + contagem de células T CD4 pode ser visto durante uma infecção por malária, enquantoencargos parasita da malária e risco de malária clínica e grave são mais elevados em indivíduos co-infectados 2,3,5,7,8,10. Os mecanismos pelos quais o HIV aumenta a gravidade da malária não são totalmente compreendidas e garante uma investigação mais aprofundada. Aqui, descrevemos um método pelo qual a malária e a co-infecção com HIV pode ser estudado in vitro. Mais especificamente, este método permite a análise das respostas imunes específicas para a malária no contexto da infecção pelo HIV. Nosso protocolo descreve um sistema versátil de co-cultura utilizando células mononucleares do sangue periférico isoladas recentemente (PBMC) isoladas a partir de dadores cronicamente infectadas pelo VIH e cultivados in vitro P. falciparum parasitados eritrócitos (PfRBC). O impacto da terapia anti-retroviral HIV sobre estas respostas também podem ser examinados usando PBMCs prospectivamente coletados de VIH (+) doadores pré e pós-tratamento. Temos utilizado este sistema para investigar o impacto da infecção pelo HIVna resposta imune inata específicas para a malária 11,12, e foram capazes de determinar que IFN-y e TNF respostas específicas para a malária são prejudicados nas células NK, células NKT, γδ células T de HIV (+) doadores pré e pós-terapia anti-retroviral HIV . Além disso, fomos capazes de utilizar este sistema para determinar que funções monocï¿½icas também são prejudicados em HIV (+) doadores, mas recuperar pós-HIV terapia anti-retroviral.

<table><tbody><tr><td>alanina</td><td>Sigma</td><td>A7377</td><td></td></tr><tr><td>anticorpos (ver outra tabela)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm com BD GolgiPlug</td><td>BD</td><td>555028</td><td>inclui brefeldina A, tampão citofix/cytoperm e tampão perm/wash</td></tr><tr><td>BD Vacutainer ACD Solution A</td><td>BD</td><td>364506</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Heparina sódica</td><td>BD</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (sem cálcio, sem magnésio)</td> <td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td>inativar o calor antes do uso</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina (10 mg/ml)</td> <td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Coloração Hema3</td><td>Fisher</td><td>122-911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>hipoxantina</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos não essenciais (10 mM)</td> <td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 pó</td><td>Life-Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 com L-glutamina e HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30255.01</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sódio (pó, cultura de células)</td> <td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td> <td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Tris (base Trizma)</td> <td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0,4%)</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead</td><td>BD</td><td>552843, 552845</td><td>depende dos anticorpos usados</td></tr><tr><td>Mistura de Gás Parasita</td><td>Por ordem</td><td></td> especial <td>3% CO2, 1% O2, equilíbrio N2</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 &#956; m unidade</td><td></td><td></td><td></td>de filtro</tr><tr><td>Lâminas de vidro Balões</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>T25</td></tr><tr>Balões <td></td><td></td><td></td><td>T75 Tubos</td></tr> de <tr><td>50 ml</td> Placas <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>cultura de 24 poços</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>desconectadas Pipetas Pasteur</td></tr><tr><td>entupidas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>pipetas <td></td><td></td><td></td><td>de transferência estéreis</td></tr><tr><td>hemocitômetro citômetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de fluxo (3 laser)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos usados para citometria de fluxo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-TNF</td><td>eBiosciences</td><td>551487</td><td>FITC (fluoróforo)
2 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-IFN&#947;</td><td>Biolegend</td><td>506507</td><td>PE (fluoróforo) 
20 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD8</td><td>Biolegend</td><td>300914</td><td>PE-Cy7 (fluoróforo) 
1 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD14</td><td>Biolegend; BD Biosciences</td><td>325624; 551487</td><td>Biotina (fluoróforo) 
0,5 &#956; l
Estreptavina PE-TR (fluoróforo) 
0,1 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD56</td><td>Biolegend</td><td>318322</td><td>PerCP/Cy5.5 (fluoróforo) 
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-&#947; &#948;</td><td>Biolegend</td><td>331212</td><td>APC (fluoróforo)
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>Biolegend</td><td>300426</td><td>APC-Cy7 (fluoróforo) 
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>Biolegend</td><td>317424</td><td>Pacific Blue (fluoróforo)
1 &#956; l</td></tr></tbody></table>

um<em&gt; in vitro</em&gt; modelo para medição de respostas imunes a malária no contexto do hiv co-infecção

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

A coinfecção por malária e HIV é uma prioridade crescente de saúde. No entanto, a maioria das pesquisas sobre malária ou HIV atualmente se concentra em cada infecção individualmente. Embora seja vital entender a dinâmica da doença para cada um desses patógenos de forma independente, também é importante que as interações entre esses patógenos sejam investigadas e compreendidas. 
Desenvolvemos um modelo in vitro versátil de coinfecção HIV-malária para estudar as respostas imunes do hospedeiro à malária no contexto da infecção pelo HIV. Nosso modelo permite o estudo de fatores secretados em sobrenadantes celulares, marcadores de superfície celular e proteínas intracelulares, bem como níveis de expressão de RNA. O desenho experimental e os métodos utilizados limitam a variabilidade e promovem a confiabilidade e reprodutibilidade dos dados. 
Todos os patógenos usados neste modelo são patógenos humanos naturais (Plasmodium falciparum e HIV-1), e todas as células infectadas são naturalmente infectadas e usadas frescas. Utilizamos eritrócitos humanos parasitados com P. falciparum e mantidos em cultura in vitro contínua. Obtemos células mononucleares do sangue periférico recém-isoladas de voluntários cronicamente infectados pelo HIV. Cada condição usada tem um controle apropriado (P. falciparum parasitado vs. eritrócitos normais), e cada doador infectado pelo HIV tem um controle não infectado pelo HIV, do qual as células são colhidas no mesmo dia. Este modelo fornece um ambiente realista para estudar as interações entre parasitas da malária e células imunes humanas no contexto da infecção pelo HIV.

Os gráficos apresentam os níveis de produção de IFN-y a partir de células NKT (Figura 2), usando CD56 + CD3 + γδ- portas para obtenção de uma população de células NKT (dados não mostrados). As células foram cultivadas durante 72 horas antes da coloração. Depois de coradas, 100.000 células CD3 + foram adquiridos no citómetro de fluxo para obter grandes populações suficientes de NK, células NKT e γδ (células de interesse). Um mínimo de 5.600 células NKT são exibidas em cada gráfico. A produção de TNF é ob...

A coinfecção humana é difícil de replicar in vitro. No entanto, os parasitas da malária humana podem ser facilmente cultivados in vitro, assim como as células mononucleares do sangue periférico humano recém-isoladas naturalmente infectadas com o HIV. Isso fornece um excelente modelo para estudar as respostas imunes precoces aos parasitas da malária no contexto da coinfecção pelo HIV.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

O objetivo geral do experimento a seguir é observar a resposta imune inata contra a malária em um contexto de infecção crônica por HIV. Isso é alcançado primeiramente cultivando parasitas vivos de P. falciparum em hemácias humanas; em um segundo passo, células mononucleares do sangue periférico obtidas de doadores positivos para HIV e não infectados são co-cultivadas com hemácias infectadas pelo parasita da malária.Por fim, a análise por citometria de fluxo é utilizada para avaliar a atividade de citocinas em células do sistema imune inato de pessoas vivendo com HIV em comparação com controles não infectados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de coinfecção. Por exemplo, como a presença de uma infecção como o HIV impacta a resposta imunológica frente a uma segunda infecção, como a malária? Para sincronizar os parasitas, centrifugue a cultura de parasitas e lise os parasitas na fase de trofozoítas no pellet com 19 volumes de solução de alanina a 37 graus Celsius, à temperatura ambiente. Após 15 minutos, centrifugue as células no meio RPMI zero duas vezes.Ajuste o hematócrito para 3% em R-P-M-I-A após a segunda lavagem. Em seguida, borbulhe gás no fras

an-vitro-model-for-measuring-immune-responses-to-malaria-context-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Este vídeo demonstra a infecção ex vivo do tecido da mucosa uterina humana com o vírus da imunodeficiência humana tipo 1, HIV-1, e sua manutenção em cima de esponjas de gelatina na interface ar-líquido. Este método permite o monitoramento da replicação e patogênese do HIV-1 nos tecidos humanos.

Um modelo de infecção da mucosa cervical humana para estudar a patogênese do HIV em condições ex vivo

Este vídeo demonstra a geração de um modelo de cultura de células de coinfecção malária-HIV in vitro. Células mononucleares do sangue periférico infectadas pelo HIV co-cultivadas com eritrócitos parasitados por Plasmodium falciparum potencialmente apoiam o crescimento uns dos outros e fornecem informações sobre as respostas imunes e a progressão da doença nas coinfecções por HIV e malária.

Geração de um modelo de cultura de células in vitro de coinfecção malária-HIV

Foi desenvolvido um ensaio in vitro para investigar o papel das vias de imunorreguladores na regulação da secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV.

In Vitro Ensaio para avaliar o impacto da imunorreguladora Pathways on específica para o HIV CD4 T efetoras celular Função

Tuberculose e malária são duas das infecções mais prevalentes em seres humanos e as principais causas de morbidade e mortalidade em populações empobrecidas nos trópicos. Nós estabelecemos um sistema de modelo experimental para estudar resultado de malária tuberculose co-infecção em camundongos após o desafio com ambos os patógenos através de sua rota natural de infecção.

Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Ao contrário de partículas de HIV-1 livre de células, as células T CD4 + infectadas são eficazmente detectada pelas células dendríticas plasmocitoides (PDCs). Este manuscrito descreve um método em que as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou pDCs isoladas são co-cultivadas com o HIV-1 de células T infectadas para avaliar a detecção inata por pDCs como avaliada por libertação de IFN tipo I.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

Os invade parasita da malária e repetições dentro das células vermelhas do sangue. A avaliação precisa da invasão merozoite e parasitemia é fundamental para avaliar o curso da infecção da malária. Aqui nós descrevemos um protocolo de citometria de fluxo com base para a medição desses parâmetros em um modelo de rato da malária.

A avaliação in vivo de Rodent Plasmodium parasitemia e Merozoito Invasion por citometria de fluxo

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

Descrevemos um modelo de camundongo de malária cerebral experimental e mostramos como a patologia inflamatória e microvascular pode ser rastreada in vivo usando ressonância magnética.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

O objetivo geral deste protocolo é fornecer instruções sobre como medir a capacidade dos anticorpos presentes no soro ou plasma de indivíduos, naturalmente expostos à infecção por Plasmodium falciparum, para opsonizar e induzir fagocitose dos eritrócitos infectados por parasitas (IEs).

Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo

Aqui descrevemos um novo método para ajudar a elucidar os mecanismos de imunidade celular ao Plasmodium durante a fase sanguínea da infecção. Este é um ensaio in vitro que mede a morte de hemácias infectadas por linfócitos citotóxicos.

In vitro Ensaio de Morte de Hemácias Infectadas por Plasmodium por Linfócitos Citotóxicos

Aprenda a medir respostas imunes inatas à malária em indivíduos com HIV usando Plasmodium falciparum e análise de citometria de fluxo. Este modelo in vitro ajuda a compreender a co-infecção e desenvolver estratégias terapêuticas.

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