Name: Preparação de Mica e silício substratos para análise do DNA Origami e Experimentação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a preparar substratos de mica e óxido de silício para experimentos de DNA origami usando técnicas de limpeza RCA e funcionalização com íons de magnésio. Estes protocolos garantem superfícies limpas para nanotecnologia.

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Os autores agradecem ao Dr. Gary Bernstein pelo uso do AFM.

1. Experiência Planejamento e preparação do material <ol><li> Determinar o desenho, a concentração, ea funcionalidade do origami de DNA que vai ser usado nas experiências 14-16. Aqui, utilizamos um design ADN origami rectângulo preparado em 1x TAE / Mg 2+ (40 mM de base Tris, 20 mM ácido acético, EDTA 2 mM e acetato de magnésio 12 mM, pH 8,0). 17 </li><li> Autoclave todas as dicas, tubos e recipientes para ser usado. Estes materiais devem ser todos autoclave compatível. </li><li> Prepare um suprimento de água esterilizada para a lavagem. Encha uma jarra estéril com cerca de 500 ml de 18 mohms x cm de água, coloque em uma chapa quente, deixe ferver por 5 minutos com a tampa fora, e tomar o pote fora do fogão e deixe esfriar com a tampa colocada no recipiente, mas não apertado . Guarde na geladeira e preparar uma nova oferta a cada mês ou quando necessário. </li></ol> 2. Preparar o Mica Substrato <ol><li> Cut substratos para o tamanho adequado (1 cm x 1 centímetro quadrados) com uma tesoura. A mica é fina e frágil. Alternativamente, compra de mica em forma de disco que não exige o corte. </li><li> Clivar o mica usando fita dupla face. Mica é composta por camadas de minerais separados por intercalando íons, cada camada pode ser retirada quando adere a fita dupla face. 18 <ol><li> Coloque os quadrados mica na fita dupla face ainda no dispensador de fita, certificando-se que é aderida firmemente à fita. Deslize cuidadosamente a pinça entre o mica e da fita, o mais alto camada serão removidos e permanecem na fita. Imediatamente após a remoção, o quadrado de mica terá o seu lado limpo virada para baixo. Certifique-se de virar a mica sobre antes de armazenar em um recipiente. </li><li> Repetir esta três a quatro vezes para assegurar a remoção completa da camada mais superior e a limpeza adequada. </li></ol></li><li> Alternativamente, a mica aderir a um recipiente ou de mesa com um pedaço de fita adesiva de dupla face e utilizar uma segunda peça de sassinale a e retire a camada mais superior mica. A mica serão adequadamente feita em ambos os casos, embora o método alternativo do depósito faz com que o ADN e lavagem e secagem da amostra difícil devido à segunda adesão ao suporte. </li></ol> 3. Depositar DNA Origami em Mica <ol><li> Resumidamente, misture o frasco de origami de DNA usando um misturador de vórtice para assegurar uma dispersão de nanoestruturas em solução. </li><li> Pipeta 4 ul de solução sobre a mica, assegurando que a ponta da pipeta não toque no substrato. Deixe o origami de DNA no mica por cerca de 10 min para garantir uma cobertura adequada. O tempo de deposição pode variar, dependendo da concentração de origami de DNA (Figuras 2 e 3) usado, bem como a cobertura desejada. <ol><li> Lavar a solução de origami de DNA fora do substrato mica utilizando 100 ml de água estéril sobre uma pia ou outro recipiente líquido. Pegue o mica, usando uma pinça. Pipeta da água nosubstrato, com o fluxo da gota para a ponta da pinça. Agitar a mica com um movimento para baixo afiadas para remover o excesso de água. Segurar a pinça na vertical de modo que a água vai fluir para as pinças para evitar a contaminação da amostra. </li></ol></li><li> Seca-se o substrato com um fluxo constante de azoto (N 2) durante 1 min. Certifique-se que o excesso de água é removido. Repetir a lavagem com um adicional de 100 ul de água estéril. Seca-se o substrato com N2 durante mais 3 minutos. Um substrato completamente seca é necessário para análise bem sucedida de microscopia de força atómica (AFM) (Figura 4). </li><li> Analisar o substrato utilizando AFM ou armazene em um recipiente fechado. </li></ol> 4. CMOS / Silicon Cleaning Set-up <ol><li> CUIDADO: Ao usar o CMOS set-up, use equipamentos de proteção individual em todos os momentos. Os reagentes incluem ácidos fortes, bases fortes, ácido fluorídrico (HF), e agentes oxidantes fortes, que cAn reagir com solventes residuais se reagentes não são devidamente eliminados. Observar as seguintes precauções de segurança: <ol><li> Casa CMOS banco em um capuz químico com nenhum outro processo ou set-ups. </li><li> Use luvas de borracha nitrílica, revestimento do laboratório, óculos de segurança, luvas de borracha nitrílica grandes industriais, um avental derramamento, e uma viseira em todos os momentos ao usar o banco CMOS. </li><li> Use banheiras de plástico como contenção secundária quando as soluções são preparadas. </li><li> Use um copo graduado fluorado polímero inerte para a manipulação do HF concentrado. </li><li> Faça cálcio gluconato de pomada disponível como primeiros socorros para qualquer exposição da pele. </li><li> Apenas permitir que o pessoal devidamente treinado para realizar o processo. </li><li> Sempre garantir um outro membro do laboratório está presente em caso de emergência. </li><li> Mantenha as informações MSDS para todos os produtos químicos perto do capô. </li><li> Estar familiarizado com derramamento de produtos químicos e de exposição das políticas da empresa ou da instituição de. Nota: HF prontamente permeia a pelee é um limpador de cálcio, afetando ossos e nervos prejudiciais se ocorrer exposição. Exposição cutânea a alguns mililitros de ácido fluorídrico concentrado pode ser perigoso e até fatal. Estabelecer as precauções necessárias para assegurar que a exposição não ocorre. </li></ol></li><li> Execute RCA1 e RCA2 em um separado 250 ml copos de vidro em placas separadas. Cada copo deve conter uma barra de agitação. Monitorar a temperatura da solução usando termómetros apertadas de modo a barra de agitação não bater no bulbo. Cobrir as provetas, utilizando um vidro de relógio para diminuir os efeitos de evaporação. </li><li> RCA1 Preparação <ol><li> Coloque 50 ml de 18 mohms x cm de água no copo RCA1 designado utilizando um copo de medição. </li><li> Adicionar 15 ml de hidróxido de amónio concentrado (NH4OH) para o copo. Lavar o copo de medição com 25 ml de água e adicionar a água da lavagem para o copo RCA1. </li><li> Ligar o agitador e calor numa placa de aquecimento e trazer o banho RCA1 a 70 ° C. </li&gt; <li> Adicionar 15 ml de 30% de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) para o copo de RCA1. Usar a solução RCA1 dentro de 1 hora após a H 2 O 2 foi adicionado. O banho pode ser utilizado várias vezes dentro do intervalo de três dias, se 15 ml de peróxido é adicionado ao banho de cada vez. </li><li> Lavar o copo de medição cuidadosamente com água e descartar a lavagem em um frasco de resíduos RCA1 apropriado. </li></ol></li><li> RCA2 Preparação <ol><li> Adicionar 70 ml de 18 mohms x cm de água para o copo RCA2 designado utilizando o copo de medição cuidadosamente lavados. </li><li> Adicionar 15 ml de ácido clorídrico concentrado (HCl). Lavar o copo de medição com 20 ml de água e adicioná-lo ao copo RCA2. </li><li> Aumentar o aquecimento e agita-se a velocidade da placa de aquecimento até a solução atingir 70 ° C. </li><li> Adicionar 15 ml de 30% de H 2 O 2. Como o banho RCA1, usar esta solução dentro de uma hora a partir de quando o H 2 O 2 é adicionado; Além disso, o banhopode ser reutilizado várias vezes dentro do intervalo de três dias, se 15 ml de H 2 O 2 é adicionada antes de cada utilização. </li></ol></li><li> IC Preparação de Solução <ol><li> Colocar 50 ml de água numa proveta de polímero fluorado inerte. </li><li> Medida 4 ml de ácido fluorídrico concentrado (49%) na proveta de plástico de medição e adicioná-lo no copo de polímero fluorado inerte. </li><li> Lave o plástico medindo copo com um total de 50 ml de água, adicionando a água da lavagem para o copo HF. Lave o copo de medição cuidadosamente com água e descartar as lavagens em um recipiente de descarte designado HF. </li></ol></li></ol> 5. Preparação e limpeza do Silício Substrato <ol><li> Corte de wafers de silício em chips <ol><li> Identificar as direcções perpendiculares e paralelas treliça sobre a superfície polida plana da bolacha de silício. Estas instruções são usadas para ajudar a tornar mais fácil clivagem quadrados. As instruções a seguir referem-se a cleaving silício &lt;110&gt; e podem não ser adequados para outras orientações cristalinas. </li><li> Coloque o wafer de silício polido-side-up em uma superfície macia, como um guardanapo. Usando a caneta com ponta de diamante escriba, suavemente do entalhe da parte inferior do disco de contacto ao longo da borda plana primário. Coloque um fio pequeno, como um clipe de papel, abaixo do nick e aplique suavemente pressão para a bolacha, colocando os dedos ou com uma pinça de cada lado do nick e empurrando para baixo. Fazendo isso irá separar o wafer em duas metades ao longo da linha de rede cristalina na direção decompor natural. </li><li> Por outro guardanapo, com um lápis e régua, medir a largura desejada dos pontos quadrados por marcação sobre a parte superior e a parte inferior do penso. Conectar esses pontos com linhas retas. Isto irá servir como um guia para formas mesmo quadrados. </li><li> Coloque uma das metades wafer ponta-primeiro entre as linhas medidas no guardanapo lavada contra a linha e repita o passo em 5.1.2 O recém quebrado perpendicular pieces deve agora ser a largura dos quadrados clivados. Rode o wafer horizontalmente no guardanapo. Coloque-o entre as linhas perpendiculares e repita o processo na etapa 5.1.2. </li><li> Armazenar os chips da bolacha recém clivada num frasco limpo cheio de água DI para evitar arranhões. Os chips de silício pode ser armazenado indefinidamente, mas deve ser limpa antes de iniciar as experiências. </li></ol></li><li> Limpeza de CMOS Silicon <ol><li> Quando a solução RCA1 atingiu a temperatura adequada, submergir oito a dez de 1 cm x 1 centímetro chips de silício na solução usando um cesto de polímero fluorado inerte com um &quot;diâmetro 2. As bolhas de oxigénio se formam sobre as fichas e as paredes da taça. Se nenhum borbulhante ocorre, o H 2 O 2 é degradado. Deixe os chips na solução por 10 a 20 min, agitando o cesto cima e para baixo a cada poucos minutos para manter os chips grudem umas nas outras. </li><li> Levante a cesta contendo os chips de silício para cima e escorra bem. Mova a cesta sobre to do copo de resíduos e enxaguar bem com 18 mohms x cm de água. Mergulhe no copo de lavagem e sacudir para cima e para baixo por 20 s. Escorra o cesto e lavar abundantemente com água sobre o copo de resíduos. Esvazie o copo de resíduos em um frasco de resíduos RCA1 designado e encher com água. </li><li> Após a limpeza RCA1 é completa, colocar o cesto na proveta 01:50 HF para de 10 a 20 seg. Use uma suave para cima e para baixo movimento de misturar as batatas fritas e HF. Levante o balde enterrada para permitir que o HF para drenar completamente. Nota: As superfícies de fichas deve ser hidrofóbico; a água não vai molhar o chip, mas em vez disso formar gotas com ângulos de contacto elevadas. Isto indica que o óxido de silício tem sido gravado distância e o chip está agora terminada por ligações Si-H. </li><li> Colocar o copo de lavagem e enxágüe copo em uma banheira de plástico, mova a cesta sobre o copo de lavagem e enxágüe com 18 mohms x cm de água. Mergulhe a cesta no copo de lavagem e agitar por 20 s. </li><li> Conclua uma segunda drenagem e rinsciclo e com 18 cm x mohms água. Despejar a água de lavagem para o copo de lavagem e encher o copo de lavagem com água. Despeje todos os resíduos em um frasco de resíduos de plástico HF designado. </li><li> Quando a solução RCA2 atingiu a temperatura adequada, submergir os chips de silício nas soluções que utilizam o cesto. Deixar na solução durante 10 a 20 min. O chip vai agora ser hidrofílico, devido ao crescimento de uma (1-2 nm) óxido de película fina. </li><li> Remover após a quantidade adequada de tempo e siga os mesmos procedimentos de lavagem como para RCA1. Eliminar os resíduos no recipiente de resíduos RCA2 apropriado. Remova cada chip da cesta com uma pinça de plástico, lave com água e seque com nitrogênio. </li><li> Armazene batatas fritas em uma caixa de plástico ou bolacha em um frasco de 18 mohms x cm de água. O silício permanecerá limpo quando armazenados em água por aproximadamente três dias após a limpeza. Certifique-se de que a área de trabalho está devidamente limpo eo exterior das luvas CMOS foram lavados. Deixe a CMLuvas OS na cobertura para secar. </li></ol></li></ol> 6. Depositar DNA Origami em Silicon APTES-funcionalizada <ol><li> Formação de auto-montados Monolayer em Silicon <ol><li> APTES aquecer à RT antes da abertura. Se a garrafa é muito frio, poderá ocorrer condensação, causando hidrólise dos APTES durante o armazenamento. Adicionar 1980 mL de 18 mohms x cm de água e 20 mL de APTES para um frasco de cintilação limpa e agite para misturar. Use esta solução imediatamente. </li><li> Coloque um chip de silício limpos reflexivo-side-up no frasco de cintilação, tampá-lo, e deixe descansar por 20 min. Remover o chip utilizando pinças e lavar com 200 mL de água e seco durante 1 minuto com uma corrente de N 2. </li></ol></li><li> Depositar origami de DNA em APTES funcionalizados Silicon Nota: Os passos para depositar origami de DNA em silício funcionalizado são análogas àquelas para depositar sobre a mica. <ol><li> Resumidamente misturar o frasco origami de DNA e pipeta de 4 ml de soluçãosobre o substrato de silício. Se necessário, aumentar o volume de solução origami de DNA usadas para cobrir todo o substrato como o silicone funcionalizado é mais hidrofóbica do que o substrato de mica. Use uma lamela de vidro para pressionar a solução de deposição para baixo e evitar a evaporação durante longos depoimentos. </li><li> Deixar a solução repousar durante a quantidade de tempo necessário para a concentração utilizada e a cobertura desejada (ver Figuras 2 e 3 para o efeito do tempo e da concentração na cobertura da superfície). Lavar o substrato com 100 ul de estéril 18 mohms x cm de água e seca com N 2 durante 1 min. </li><li> Repetir a lavagem com um adicional de 100 ul de água estéril e secar o substrato com N 2 durante 3 min. </li><li> Conservar a amostra em um recipiente limpo até que novos experimentos ou imagem pode ser realizada. Amostras começam a mostrar acumulação de partículas após cerca de uma a duas semanas de armazenamento de acordo com a forma como muCH eles são tratados. </li></ol></li></ol> Imagem 7. AFM e Análise de Imagem de Amostras de DNA de Origami <ol><li> Use AFM no modo de Tocar no ar para fins de imagem. Modo de batimento que garante um mínimo de força será aplicada às nanoestruturas frágeis, em comparação com o modo de contacto. Nota: Os parâmetros de imagem será dependente do instrumento. Todas as imagens apresentadas foram capturados usando um MultiMode Nanoscope IIIa. </li><li> Seleccione sondas AFM para não-contato / modo no ar batendo, com revestimento reflector de ouro, uma freqüência de ressonância (nominal) de ~ 300 kHz, forçar constante de 40 raio N / m, e de ponta &lt;10 nm. </li><li> Processar e analisar as imagens de AFM, utilizando Nanoscope Analysis Software. Realizar cálculos de cobertura usando ImageJ. 19 </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Há vários passos que precisam ser enfatizados para atingir resultados consistentes e ideais. Para amostras de mica, após uma lavagem rigorosa e minuciosa e que secam regime, como nos passos 3.3 e 3.4, vai assegurar que as imagens de origami de DNA indivíduo de alta qualidade pode ser alcançada usando AFM sem os vários problemas descritos na seção Resultados Representante. De primordial importância para as amostras de silício é a limpeza do substrato. Seguindo os procedimentos de limpeza descritas na etapa 5.2 cuidadosam...

Introduzido pela primeira vez em 2006, origami de DNA utiliza a natureza de auto-montagem de oligonucleótidos de DNA para produzir nanoestruturas designable e altamente ordenados. 1 Uma miríade de estruturas têm sido relatados, que vão desde as caras do smiley travada para caixas em 3 dimensões. 2 origami de DNA pode ser funcionalizada com várias biomoléculas e nanoestruturas, dando origem a aplicações de investigação no domínio da nanoelectrónica, medicina e computação quântica. 3 No entanto, a análise e muitas aplicações futuras não são apenas dependente de concepção estrutural, mas também com a adesão das nanoestruturas origami de DNA em superfícies. Os métodos descritos neste manuscrito dizem respeito à preparação de amostras de ADN origami em dois tipos de substratos: mica e óxido de silício funcionalizado. A mica é o substrato de escolha para estudos origami ADN porque é atomicamente plana, com uma altura de camada de 0,37 nm ± 0,02 nm. 4 É também easily limpo, tornando a preparação de amostras e microscopia de força atômica (AFM) estudos simples. Mica moscovite contém uma alta densidade de potássio em cada plano de clivagem, mas estes iões difundem para longe da superfície da mica quando em água. Para mediar a ligação de origami de DNA para o substrato de mica, Mg 2+ é usado para inverter a carga negativa da mica e se ligar electrostaticamente a espinha dorsal de fosfato do ADN para o substrato (Figura 1A). 5 As misturas de DNA emparelhado na presença de grande excessos de fios de grampos dar cobertura elevada e boas imagens em mica, porque a adesão de origami de DNA para Mg 2+ superfície do terminadas em é muito mais forte do que a adesão de oligonucleotídeos de cadeia simples (vertentes descontínuas). Outros iões carregados positivamente, incluindo Ni e Co 2+ 2+ pode ser utilizada para controlar a aderência de ADN em mica. 6,7 Alterar a concentração de catiões monovalentes e divalentes em solução pode mediar Adhetaxas de Sion e difusão superfície de origami de DNA. 8 No entanto, o protocolo para a preparação de substratos de mica e depositando e lavar o origami é muitas vezes não explicitamente descritos nos manuscritos publicados 9. Sem um protocolo claro, boa reprodutibilidade dos resultados pode ser difícil de obter. A mica é um isolador, para que ele não é adequado como um substrato para algumas aplicações em nanoelectrónica. Silicon passivado com um óxido nativo fina tem propriedades eletrônicas desejáveis, incluindo a compatibilidade com o processamento antes de cortesia semicondutor de óxido metálico (CMOS) para criar estruturas de entrada / saída e características topográficas. Bolachas de silício são armazenados ao ar com passivado ou um óxido térmico de espessura ou película fina de óxido nativo que é relativamente sujo, com um elevado número de partículas. Óxido de silício tem uma muito mais baixa densidade de carga de superfície do que a mica, e a densidade de carga é altamente dependente de óxido de preparação e da história. Em concentrações de íons de magnésio above 150 mM, boas coberturas (até 4 / uM 2) de origami de DNA rectangular pode ser alcançado em substratos de silício de plasma tratado de oxigénio; no entanto, esta concentração e a cobertura pode mudar dependendo do tamanho e design das nanoestruturas a ser utilizado. 10 Um protocolo alternativo para ajustar a carga de superfície é para anexar uma monocamada auto-montada catiónico de 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES) (Figura 1B) para o óxido. A amina primária na APTES pode ser protonado a valores de pH inferiores a 9, modificando a carga e hidrofobicidade do substrato. 11 Para uma monocamada completa de APTES a ser depositada com sucesso, o silício deve ser adequadamente limpo usando Radio Corporation of America (RCA) protocolos . Esses protocolos incluem tratamentos em hidróxido de amónio e soluções de peróxido de hidrogênio (RCA1) para remover resíduos orgânicos e contaminantes de partículas. Um curto etch em solução aquosa de ácido fluorídrico remove a camada de óxido nativo juntamente comquaisquer contaminantes iónicos que aderem ao óxido. Finalmente, as amostras são expostas a um ácido clorídrico e solução de peróxido de hidrogénio (RCA2) para remover o metal e contaminantes iónicos e formar uma camada fina de óxido, uniforme. 12 A maioria das salas limpas, designaram capuzes de protocolos de limpeza CMOS, com regras estritas sobre o que pode ser usada nestas áreas. Um problema comum vem sob a forma de íons tais como o sódio, o que pode perturbar as propriedades eletrônicas de estruturas CMOS criando armadilhas midbandgap. 13 íons comumente usado em origami de DNA de preparação e de deposição buffers poderia contaminar os banhos de CMOS e causar problemas para outros pesquisadores que utilizam o quarto limpo. Por esta razão, o nosso grupo utiliza um CMOS &#39;sujos&#39; limpeza banco organizados especificamente para as pequenas amostras utilizadas para a investigação origami de DNA. Este processo é uma boa alternativa para a sala limpa tradicional set-up e pode ser adequado para laboratórios que não têm acesso a um banco de CMOS de sala limpa.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf epT.I.P.S. Recargas, capacidade 2-200&nbsp; &mu; l</td><td>VWR International, LLC</td><td>22491733</td><td>bandeja de recarga de 10 tubos de</td></tr><tr><td>microcentrífuga de 96 pontas, polipropileno</td><td>VWR International, LLC</td><td>87003-290</td><td>0,65 ml, natural</td></tr><tr><td>Research Plus Pippete - Canal Único - 20-200&nbsp; &mu; l</td><td>A. Daigger & amp Companhia, Inc.</td><td>EF8960F-3120000054 CADA</td><td>Pippete de Pesquisa de Volume Ajustável</td></tr><tr><td>Plus - Canal Único - 2-20&nbsp; &mu; l</td><td>A. Daigger & amp Companhia, Inc.</td><td>EF8960D-3120000038 CADA</td><td></td></tr><tr><td>Fita Dupla Face Permanente Scotch 237 Volume Ajustável</td><td>Office Depot, Inc.</td><td>602710</td><td>3/4" x 300", Pacote de 2</td></tr><tr><td>Misturadores de Vórtice</td><td>Thermo Scientific</td><td>M37610-33Q</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente para Wafer único, 2" (50 mm), 60 mm x 11&nbsp; mm</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>64917-2</td><td>6 por pacote</td></tr><tr><td>6" Wafer, tipo P, < Orientação de 100>, com plano primário</td><td>Nova Electronic Materials, Ltd.</td><td></td><td></td>GC49266</tr><tr><td>Luvas de Exame de Nitrilo Sem Pó</td><td>VWR International, LLC</td><td>82062-428</td><td>O número de catálogo é para tamanho grande</td></tr><tr><td>Sondas sem contato de alta precisão com revestimento reflexivo de Au</td><td>K-Tek Nanotechnology, Inc.</td><td>HA_NC/15</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Pan</td><td>A. Daigger & Companhia, Inc.</td><td>NAL692-5000 EF25341C</td><td></td></tr><tr><td>Sol-Vex II Luvas Agressivas, Tamanho: 9-9.5; 15 mil, 13 polegadas - 1 dz</td><td>Spectrum Chemical Mfg. Corp.</td><td>106-15055 Antes de</td><td>usar, enxágue com água e esfregue até que não se formem bolhas nas luvas.</td></tr><tr><td>Pinças PTFE 200 mm Square</td><td>Dynalon Corp.</td><td>316504-0002</td><td></td></tr><tr><td>Folhas de Mica Muscovita V-5 Quality</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71850-01</td><td>10 por pacote</td></tr><tr><td>Disco de Mica, 10 mm</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>50</td><td>discos de mica são opcionais</td></tr><tr><td>Caneta Scriber Diamon para Vidraria</td><td>VWR International, LLC</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de Cintilação, Vidro Borosilicato, com Tampa de Rosca - 20 ml</td><td>VWR International, LLC</td><td>66022-060</td><td>Caixa de 500, com tampa de polipropileno anexada e forro de folha de celulose</td></tr><tr><td>4 x 5 polegadas Top PC-200 Placa Quente, 120 V/60 Hz</td><td>Dot Scientific, Inc.</td><td>6759-200</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro de face reta, boca larga</td><td>VWR International, LLC</td><td>89043-554</td><td>Caixa de 254, tampas com revestimento de celulose/vinil anexado</td></tr><tr><td>Copo de vidro de grau padrão, capacidade de 250 ml</td><td>VWR International, LLC</td><td>173506</td><td></td></tr><tr><td>Beakers, PTFE</td><td>VWR International, LLC</td><td>89026-022</td><td>Para uso com</td></tr><tr><td>vidro de relógio HF de forma rasa, 3"</td><td>VWR International, LLC</td><td>66112-107</td><td>Caixa de 12</td></tr><tr><td>Recipientes de Armazenamento de Plástico</td><td>VWR International, LLC</td><td>470195-354</td><td>Para recipiente secundário</td></tr><tr><td>Termómetros de Uso Geral Líquido-em-Vidro</td><td>VWR International, LLC</td><td>89095-564</td><td></td></tr><tr><td>Pinças de alta precisão e ultrafinas</td><td>Microscopia Eletrónica Sciences</td><td>78310-0</td><td></td></tr><tr><td>Viseira de Policarbonato</td><td>Fisher ScientificInc.</td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Avental de Neoprene</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>19-810-609</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato de cálcio, Calgonato</td><td>W.W Grainger, Inc.</td><td>13W861</td><td>Tubo, 25 g</td></tr><tr><td>de peróxido de hidrogênio 30% CR ACS 500 ml</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>H325 500</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropiltrietoxissilano</td> nocivo e tóxico <td>Gelest Inc.</td><td>SIA0610.0-25GM</td><td>Deixe aquecer à temperatura ambiente antes de usar.</td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio, 2,5 L</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A669-212</td><td>PREJUDICIAL, TÓXICO</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A144-212</td><td>PREJUDICIAL, TÓXICO</td></tr><tr><td>Ácido fluorídrico</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A147-1LB</td><td>PREJUDICIAL, INSTRUMENTOS TÓXICOS</td></tr><tr><td>DE Veeco do nanoscópio IIIa MultiMode</td><td>, Inc.</td><td></td><td>Qualquer AFM capaz de modo de rosqueamento é adequado para análise</td></tr><tr><td>Cesta de imersão</td><td>Feita em laboratório</td><td>Feita em laboratório</td><td>A cesta de imersão foi feita usando o fundo de uma garrafa de PTFE com furos perfurados, alça de PTFE e todos os parafusos de PTFE.</td></tr></tbody></table>

preparação de mica e silício substratos para análise do dna origami e experimentação

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

A natureza projetada e a síntese controlada de um pote de origami de DNA oferecem oportunidades interessantes em muitos campos, particularmente na nanoeletrônica. Muitas dessas aplicações requerem interação e adesão de nanoestruturas de DNA a um substrato. Devido à sua natureza atomicamente plana e facilmente limpa, a mica tem sido o substrato de escolha para experimentos de origami de DNA. No entanto, as aplicações práticas da mica são relativamente limitadas em comparação com as dos substratos semicondutores. Por esse motivo, um processo simples, estável e repetível para a adesão de origami de DNA em óxido de silício derivatizado é apresentado aqui. Para promover a adesão de nanoestruturas de DNA à superfície do óxido de silício, uma monocamada auto-montada de 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES) é depositada a partir de uma solução aquosa compatível com muitos fotorresistentes. O substrato deve ser limpo de todos os contaminantes orgânicos e metálicos usando os processos de limpeza da Radio Corporation of America (RCA) e a camada de óxido nativo deve ser gravada para garantir uma superfície plana e funcionalizável. As salas limpas são equipadas com instalações para limpeza de silicone, no entanto, muitos componentes de tampões e soluções de origami de DNA geralmente não são permitidos nelas devido a preocupações com contaminação. Este manuscrito descreve a configuração e o protocolo para limpeza de silício em pequena escala em laboratório para pesquisadores que não têm acesso a uma sala limpa ou gostariam de incorporar processos que possam causar contaminação de uma bancada limpa CMOS de sala limpa. Além disso, são discutidas variáveis para regular a cobertura e como reconhecer e evitar problemas comuns de preparação de amostras.

Duas variáveis ​​ditar a cobertura de origami de DNA sobre o substrato: concentração da solução e do tempo de exposição. As características de adsorção de origami ADN sobre mica e APTES óxido de silício funcionalizados foram anteriormente relatados. 13 A relação entre a concentração de origami de DNA na solução de deposição e as coberturas finais sobre mica estão resumidos na Tabela 1 e Figura 2, que mostra os resultados de concentração crescentes num aumento da cobertura. O ...

Processos de limpeza reprodutíveis para substratos usados na pesquisa de origami de DNA são descritos, incluindo limpeza RCA de bancada e derivatização de óxido de silício. Protocolos para preparação de superfície, deposição de origami de DNA, parâmetros de secagem e configurações experimentais simples são ilustrados.

Preparação de Mica e silício substratos para análise do DNA Origami e Experimentação

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

O objetivo geral do experimento a seguir é preparar dois tipos de substratos para experimentos com NANOSTRUTURAS DE DNA, mica e óxido de silício funcionalizado. Isso é realizado de duas maneiras diferentes para os dois substratos. A camada superior da mica é removida usando fita adesiva dupla face em um processo rápido e simples.Por outro lado, os substratos de silício devem ser limpos utilizando a limpeza RCA, que envolve a corrosão da camada de óxido e a remoção de contaminantes metálicos e orgânicos. Isso produz uma camada de óxido de silício limpa e lisa que pode ser posteriormente funcionalizada. Em seguida, a MICA é inundada com íons magnésio para criar uma superfície carregada positivamente.Uma superfície análoga é criada no substrato de óxido de silício por meio da formação de uma bicamada auto-organizada positivamente carregada, como o trietóxi (3-aminopropil). Em seguida, o substrato é exposto à solução de origami de DNA para promover a adesão do DNA negativamente carregado com os substratos positivamente carregados. A cobertura depende do tipo de substrato, concentração da solução e tempo de deposição — fatores que podem ser variados conforme o experimento realizado.A principal vantagem dessa técnica é que o APT é uma monocamada, ligada covalentemente à superfície de silício. Pode ser depositado em um padrão específico por meio de feixe de elétrons, litografia e uma técnica denominada descolamento molecular. Geralmente, indivíduos novos nesse método enfrentam dificuldades com as técnicas de manipulação únicas necessárias para os pequenos substratos, bem como em aperfeiçoar o protocolo apropriado para o manuseio da deposição e do desenho.A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos de manipulação do substrato e de limpeza e segurança da RCA são difíceis de descrever por escrito. A representação visual dessas etapas de segurança necessárias é importante para promover práticas seguras em laboratório. Primeiro, prepare o substrato cortando quadrados de um centímetro por um centímetro do substrato de MICA com tesoura.Corte a mica usando fita adesiva dupla face. Coloque o retângulo de mica sobre a fita adesiva dupla face ainda dentro do dispensador de fita. Deslize cuidadosamente a pinça entre a mica e a fita e remova a mica.A camada superior será removida e permanecerá na fita. Em seguida, pipete quatro microlitros de solução de DNA origami adequadamente vortexada sobre a mica, garantindo que a ponta da pipeta não toque o substrato. Deixe o DNA origami sobre a MICA por aproximadamente 10 minutos.Para garantir uma cobertura adequada, enxágue a solução de origami de DNA do substrato de MICA usando 100 microlitros de água estéril sobre a pia ou outro recipiente para líquidos. Para isso, segure a MICA com pinças. Pipete a água sobre o substrato com o fluxo da gota direcionado para a ponta das pinças.Seque o substrato com um fluxo constante de nitrogênio por um minuto. Repita as RINs com mais 100 microlitros de água estéril antes de secar o substrato com nitrogênio por mais três minutos. Para a preparação da solução um da Radio Corporation of America (RCA), coloque 50 mililitros de água de 18 mega ohm centímetro no béquer designado para a solução um RCA usando um béquer graduado, em seguida adicione 15 mililitros de hidróxido de amônio concentrado ao béquer.Lave o béquer com 25 mililitros de água e adicione a água de lavagem ao béquer de RCA um. Ligue o aquecimento e agite na placa aquecedora, aquecendo o banho de RCA um até 70 graus Celsius. Em seguida, adicione 15 mililitros de peróxido de hidrogênio a 30% ao béquer de RCA um.Certifique-se de usar a solução RCA um dentro de uma hora após a adição de peróxido de hidrogênio. Enxágue o béquer de medição completamente com água e descarte o enxágue em um frasco apropriado de resíduo de solução RCA um para a Radio Corporation of America. Preparação da solução RCA dois.Adicione 70 mililitros de água de 18 mega ohm centímetro ao béquer designado RCA dois usando o béquer de medição devidamente calibrado. Em seguida, adicione 15 mililitros de ácido clorídrico concentrado. Enxágue o béquer de medição com 20 mililitros de água e adicione ao béquer RCA dois.Aumente o calor e a velocidade de agitação da placa aquecedora até que a solução atinja 70 graus Celsius. Em seguida, adicione 15 mililitros de peróxido de hidrogênio a 30%. Como no banho único de RCA.Utilize a solução dentro de uma hora após a adição de peróxido de hidrogênio. Para preparar a solução de fluoreto de hidrogênio, coloque 50 mililitros de água em um béquer inerte de polímero fluorado. Meça quatro mililitros de ácido fluorídrico concentrado no béquer plástico de medição e adicione ao béquer inerte de polímero fluorado.Enxágue o béquer plástico de medição com um total de 50 mililitros de água, adicionando a água de enxágue ao béquer de ácido fluorídrico. Por fim, lave cuidadosamente o béquer de medição com água e descarte as águas residuais em um recipiente designado para resíduos de ácido fluorídrico. Corte a pastilha de silício em pedaços colocando a pastilha com a face polida voltada para cima sobre uma superfície macia, como um guardanapo.Usando a caneta de escriba com ponta de diamante, faça um pequeno corte na parte inferior da pastilha ao longo da borda plana principal. Coloque um fio fino, como um clipe de papel, abaixo do corte e aplique suavemente pressão sobre a pastilha colocando os dedos ou pinça em ambos os lados do corte e pressionando para baixo sobre um guardanapo com um lápis e uma régua. Meça a largura desejada dos quadrados marcando pontos na parte superior e inferior do guardanapo.Coloque uma das metades da pastilha com a borda voltada para baixo entre as linhas medidas no guardanapo, alinhada com a linha, e repita o procedimento de corte. Os pedaços recém-quebrados e perpendiculares devem agora ter a largura dos quadrados das sapatas. Gire a pastilha horizontalmente sobre o guardanapo e posicione-a entre as linhas perpendiculares antes de repetir novamente o procedimento de corte.Quando a solução de RCA atingir a temperatura apropriada, mergulhe oito a 10 pastilhas de silício de um centímetro por um centímetro na solução por 10 a 20 minutos; utilizando um cesto invertido de polímero fluorado com diâmetro de dois polegadas, levante o cesto contendo as pastilhas de silício e escorra. Em seguida, mova o cesto para o béquer de resíduos e enxágue abundantemente com água de 18 megacm. Mergulhe o béquer de lavagem e agite para cima e para baixo por 20 segundos.Esvazie o cesto e enxágue completamente com água sobre o béquer de resíduos. Após a conclusão da limpeza RCA, coloque o cesto no béquer contendo a solução de fluoreto de hidrogênio por 10 a 20 segundos. Utilize um movimento suave de cima para baixo para misturar os chips e o fluoreto de hidrogênio.Em seguida, levante o balde de imersão para permitir que o fluoreto de hidrogênio escorra completamente. Coloque o béquer de lavagem e enxágue o béquer em um recipiente plástico. Mova a cesta sobre o béquer de enxágue e enxágue com água de 18 mega ohm centímetro.Mergulhe o cesto na lavagem, no béquer, e agite por 20 segundos. Em seguida, realize um segundo ciclo de drenagem e enxágue com água de 18 mega ohm centímetro. Descarte a água de lavagem no béquer de enxágue e reabasteça o béquer de lavagem com água.Quando a solução RCA dois atingir a temperatura apropriada, submergir os chips de silício nas soluções utilizando o cesto. Deixar os chips na solução por 10 a 20 minutos. Remover os chips após o tempo adequado e seguir os mesmos procedimentos de enxágue.No caso da RCA, guarde chips limpos em água de alta pureza em um frasco limpo por até três dias para a formação de uma camada auto-organizada sobre silício. Adicione 1.980 microlitros de água de 18 mega ohm centímetro e 20 microlitros de APTES a um frasco de simulação limpo e agite suavemente para misturar. Utilize a solução imediatamente. Coloque um chip de silício limpo com a face reflexiva voltada para cima no frasco cintilador, tampe-o e deixe repousar por 20 minutos.Remova o chip usando pin&ccedil;as e enx&aacute;gue com 200 microlitros de &aacute;gua antes de sec&aacute;-lo por um minuto com um fluxo de g&aacute;s nitrog&ecirc;nio. Para depositar a origami de DNA no sil&iacute;cio funcionalizado com o teste APT, misture brevemente o frasco de origami de DNA e pipete quatro microlitros da solu&ccedil;&atilde;o sobre o substrato de sil&iacute;cio. Deixe a solu&ccedil;&atilde;o em repouso pelo tempo necess&aacute;rio de acordo com a concentra&ccedil;&atilde;o utilizada e a cobertura desejada.Em seguida, lave um substrato com 100 microlitros de água estéril de 18 mega ohm centímetro e seque com fluxo de nitrogênio. Por um minuto, repita a lavagem com mais 100 microlitros de água estéril e seque o substrato com nitrogênio por três minutos. Os resultados representativos da variação da concentração de DNA origami na cobertura do substrato são mostrados aqui.Concentrações aumentadas proporcionam maior cobertura em substratos de MICA; a cobertura de origami de DNA em MICA e silício exibe uma alta absorção inicial, com saturação ocorrendo após aproximadamente uma hora. A porcentagem de cobertura em MICA também é consistentemente maior do que a mesma concentração e tempo em amostras de silício funcionalizado. O protocolo de enxágue e secagem é essencial para o preparo bem-sucedido de amostras de origami de DNA.Uma lavagem e secagem ineficazes podem levar à formação de ilhas de agregação de solvente de origami de DNA ou à ligação de nanoestruturas em amostras de alta cobertura. Uma vez dominadas, as técnicas de preparação do substrato Micah podem ser concluídas em 20 minutos ou menos. As amostras de silício podem ser preparadas em menos de duas horas, se realizadas corretamente.A litografia por feixe de elétrons e o destacamento molecular podem ser integrados a este processo para criar padrões e dispositivos inovadores para experimentos adicionais. Não se esqueça de que o trabalho com ácido fluorídrico pode ser extremamente perigoso; tome precauções adequadas, como o uso de equipamentos de proteção individual e a disponibilidade de suprimentos de emergência de gluconato de cálcio durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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