Name: Imunofluorescência para monitorar a Incorporação celular de lactoferrina humana e sua Associated atividade antiviral contra o vírus da hepatite C (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprenda a usar imunofluorescência para monitorar a internalização de lactoferrina humana em células hepáticas e avaliar seu efeito inibidor sobre a replicação do vírus da hepatite C.

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Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e Ciências Naturais e pelo Conselho de Pesquisa em Engenharia do Canadá. M. Bisaillon é um Chercheur Boursier Senior do Fonds de Recherche en Santé du Québec e também membro do Centre de Recherche Clinique du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. Agradecemos ao Dr. Ralf Bartenschlager pelo generoso presente do sistema de replicon HCV. Também agradecemos ao Dr. Charles Rice e ao Dr. Daniel Lamarre por gentilmente fornecerem a linha de células hepáticas. Também queremos agradecer a Guillaume Tremblay pela assistência técnica.

1. Células e Preparação de tratamento <ol><li> Numa placa de 24 poços, colocar uma tampa de vidro no fundo dos poços. Lavar cada poço com tampão fosfato salino (PBS). </li><li> Semente células Huh-7 que suportam o replicão de VHC subgenï¿½ico em cada poço a uma densidade de 5 x 10 4 células / poço. Se não houver tratamento a fazer, as células podem ser semeadas a uma densidade mais elevada. O meio de cultura é de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), L-glutamina 2mM, piruvato de sódio 1 mM e 250 mg / mL de G-418 (para manter o replicão). </li><li> Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. No dia seguinte, as células com o tratamento de 3 ^ M da hLF purificado a partir de leite humano. </li></ol> 2. O paraformaldeído / Sacarose Preparação (12% de PAF e 12% de sacarose) <ol><li> Coloque 500 ml de PBS num recipiente e aquecê-la compreendida entre 20 ° C e 30 ° C. Dissolve-se 60 g de sacarose em PBS. Dissolve-se 60 g de paraformaldehyde (PAF) na / solução de sacarose PBS. Adiciona-se lentamente NaOH 2 N (3 a 7 ml) até que uma solução clara é obtida. </li><li> Ajustar o pH para 7,4 com HCl. Completar o volume a 500 ml com PBS. Filtrar por gravidade sobre filtro Whatman. Antes do uso, dilui-se a solução com PBS até uma concentração final de 4% de PAF e 4% de sacarose (de armazenamento de 4 ° C durante 1 semana no máximo). </li></ol> 3. Imunofluorescência <ol><li> No momento desejado (0 horas, 2 horas ou 24 horas de tratamento), lavar células duas vezes (1 minuto), com PBS e fixar com PBS / 4% de PAF / 4% de sacarose durante 20 min à TA. As células são tipicamente a 30-40% de confluência e 5 1,5x10 células são utilizadas. </li><li> Permeabilizar as células com 0,15% de Triton X-100 em PBS durante 5 min à temperatura ambiente e em bloco de 10% de soro de cabra normal (NGS) em PBS durante 20 min. </li><li> Dilui-se o anticorpo primário da proteína de interesse em 10% NGS (exemplo: rato primária anticorpo anti-hLF diluída 1: 1.000). Aplicar o anticorpo primário às células. </li><li> Após 4 horas à temperatura ambiente ou O /N a 4 ° C, lavar as células três vezes durante 5 min com 10% de NGS. Corar as células com o anticorpo secundário marcado com fluorocromo diluído em 10% NGS (exemplo: Fluorocromo com um comprimento de onda de excitação de 488 nm ligada a um anticorpo anti-rato de 1: 1000) durante 1 h à TA no escuro. </li><li> Lavar as células uma vez durante 5 min com PBS e as células com manchar 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1 ug / ml) durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lavar as células duas vezes durante 5 min com PBS. Mount cobrir vidros no SlowFade meio de montagem antes de visualização através da microscopia. As células estão agora prontos para análise por epifluorescência ou microscopia confocal. </li><li> Use diferentes controlos para assegurar a especificidade da detecção. Por exemplo, todos os anticorpos podem ser omitidos a fim de detectar a autofluorescência. O anticorpo primário pode ser omitido para determinar a coloração não específica por o anticorpo secundário. Finalmente, se possível, controlar as células ou tecidos que não fazerexpressar a molécula de interesse, também pode ser usado. </li><li> Visualize as amostras que usam o microscópio de fluorescência apropriado (epifluorescência ou confocal) e filtros adequados para a etiqueta fluorescente utilizado. As lâminas podem também ser armazenadas numa caixa de corrediça a &lt;-20 ° C para análise posterior. </li></ol> 4. Microscopia de Fluorescência <ol><li> Manter as amostras no escuro para evitar a fotodegradação. Ligue a fonte de luz do microscópio escolhido (epifluorescência ou confocal). </li><li> Ligue o microscópio. Ligue a câmera para o microscópio. Coloque o slide no microscópio para visualização. Adicionar o óleo de imersão sobre a corrediça para aumentar a abertura numérica da lente objectiva. </li><li> Selecione os filtros apropriados. Ajuste o foco e objetivo adequado. Ajuste as persianas, a fim de detectar o fluorocromo adequado, mas evitar a fotodegradação. Mantenha fora luzes do teto para minimizar fundo claro quando se olha para amostra. </li><li> Alterar thOs filtros para visualizar vários fluorocromos (por exemplo DAPI e para um comprimento de onda de excitação de 488 nm). Tire fotos com a câmera. </li></ol>

<ol><li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Derm%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence techniques.</a> J Invest Derm. 133 (1), e4(2013).</li>
<li>Portugal, J., Waring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+DNA+binding+sites+for+4%E2%80%99%2C6-diamidine-2-phenylindole+and+bisbenzimide+%28Hoechst+33258%29.+A+comparative+footprinting+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study.</a> Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li>
<li>St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy%3A+comparisons%2C+applications%2C+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems.</a> BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).</li>
<li>Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+envelope+proteins+bind+lactoferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin.</a> Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).</li>
<li>Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferrin+for+prevention+of+common+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inf+Chem%22%5BJournal%5D)">Lactoferrin for prevention of common viral infections.</a> J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).</li>
<li>Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+inhibition+of+HCV+replication+represents+a+novel+mechanism+of+action+by+the+innate+immune+Lactoferrin+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+research%22%5BJournal%5D)">The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein.</a> Antiviral research. 111, 13-22 (2014).</li>
<li>Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fading+of+immunofluorescence+during+microscopy%3A+a+study+of+the+phenomenon+and+its+remedy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy.</a> J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li>
<li>Green Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein%3A+a+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Sci. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A epidemia de HCV permanece uma ameaça global, com 80% dos pacientes recém-infectadas desenvolvem uma infecção crônica, colocando-os em risco de cirrose, insuficiência hepática ou carcinoma hepatocelular. Por acção directa agentes antivirais combatem a replicação do HCV e maturação representam agentes anti-HCV de primeira linha, como recentemente demonstrado pela aprovação regulamentar de dois NS3 N-terminal inibidores da protease (boceprevir e telaprevir). A actividade anti-VHC hLF é actualmente acredita-se que se comp...

A imunofluorescência é uma técnica que usa um microscópio de fluorescência para visualizar a distribuição e/ou localização de uma molécula alvo em uma amostra biológica. A imunofluorescência depende da especificidade dos anticorpos marcados com fluorescência contra seus antígenos correspondentes dentro de uma célula1. É normalmente usado em seções de tecido e linhagens celulares cultivadas para analisar a distribuição/localização de várias moléculas biológicas, como proteínas, ácidos nucléicos e glicanos. Deve-se notar que a imunofluorescência é frequentemente usada em combinação com outros métodos de coloração fluorescente sem anticorpos, como as colorações de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que são normalmente usadas para marcar o DNA2. Além disso, essa técnica envolve a fixação das células, o que permite a análise das células em um momento específico.
Diferentes tipos de microscópios podem ser usados para analisar amostras de imunofluorescência. O mais simples é o microscópio de epifluorescência (Figura 1), para o qual a excitação do fluorocromo e a detecção da fluorescência são feitas pelo mesmo caminho de luz3. Como a maior parte da luz de excitação é transmitida através da amostra, apenas a luz excitatória refletida pode atingir o objetivo junto com a luz emitida. Infelizmente, essa abordagem leva a uma alta relação sinal-ruído frequente. Em contraste, a microscopia confocal (Figura 2) oferece uma vantagem distinta para aumentar a resolução óptica e o contraste por meio da adição de um orifício espacial colocado no plano confocal da lente para eliminar a luz fora de foco4. Esta abordagem permite a reconstrução de estruturas tridimensionais a partir das imagens obtidas. No entanto, como uma fração importante da luz da amostra é bloqueada no orifício, muitas vezes são necessárias longas exposições.
Existem duas classes de técnicas de imunofluorescência, primária (ou direta) e secundária (ou indireta). A imunofluorescência direta envolve um anticorpo primário ligado a um fluorocromo (Figura 3). Esse método é menos utilizado porque fornece menor sinal, envolve maior custo e menor flexibilidade1. Além disso, esses anticorpos são geralmente mais difíceis de encontrar comercialmente. Por outro lado, a ligação direta do fluorocromo ao anticorpo reduz significativamente o número de etapas do procedimento, economizando tempo e reduzindo frequentemente o sinal de fundo não específico. Isso também limita a possibilidade de reatividade cruzada de anticorpos.
A imunofluorescência indireta envolve um anticorpo primário não marcado que é específico para o epítopo de interesse1. Um anticorpo secundário que carrega o fluorocromo reconhece o anticorpo primário e se liga a ele (Figura 3). Embora a imunofluorescência indireta seja mais complexa e demorada do que a imunofluorescência direta, ela é frequentemente usada devido à sua alta sensibilidade e também fornece um sinal amplificado, pois mais de um anticorpo secundário pode se ligar a cada anticorpo primário. Além disso, uma vasta gama de anticorpos secundários comerciais está disponível a preços acessíveis.
O vírus da hepatite C (HCV) é um grande problema de saúde pública, com 130-170 milhões de indivíduos cronicamente infectados em todo o mundo. Para deter a epidemia, a terapia contra o HCV precisará ser eficaz e amplamente disponível. Estudos focados em produtos naturais seguros e acessíveis contra o HCV revelaram a atividade antiviral da proteína lactoferrina humana (hLF), que se liga e neutraliza o vírion circulante5. No presente estudo, a investigação da atividade de hLF no sistema de replicon subgenômico do HCV, que é independente da entrada e excreção viral, revelou uma atividade anti-replicativa distinta de hLF contra o HCV. Este manuscrito apresenta um estudo no qual foram realizados ensaios de imunofluorescência para monitorar a internalização da hLF, um importante componente do sistema imunológico6, em células hepáticas. Além disso, monitoramos o potencial inibitório da hLF na replicação intracelular do vírus da hepatite C (HCV).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>PAF</td><td>BioShop</td><td>PAR070.1</td><td>Sólido inflamável, irritante para a pele, pulmões e olhos&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td>sem Ca2+ & Mg2+</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Wisent</td><td>053-150</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-marcado anti-mouse</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 568-marcado anti-coelho</td><td>Invitrogeb</td><td>A21069</td><td></td></tr><tr><td>Aglutinina de gérmen de trigo Alexa Fluor 488 conjugado (WGA)</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td>Potencialmente mutagênico</td></tr><tr><td>Anti-NS5A coelho</td><td>Abcam</td><td>ab2594</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-hLF</td><td>Abcam</td><td>ab10110</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst mancha</td><td>Life Techn.</td><td>H1399</td><td>Potencialmente&nbsp; mutagênico&nbsp;
e cancerígeno</td></tr><tr><td>hLF</td><td>Sigma</td><td>L0520</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse microscópio visível/epifluorescência</td><td>Nikon</td><td>TE2000-E</td><td></td></tr><tr><td>microscópio de epifluorescência/confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imunofluorescência para monitorar a incorporação celular de lactoferrina humana e sua associated atividade antiviral contra o vírus da hepatite c

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Imunofluorescência é uma técnica de laboratório vulgarmente usados ​​para estudar vários aspectos da biologia. É tipicamente usado para visualizar a distribuição e / ou a localização de uma molécula alvo em células e tecidos. Imunofluorescência baseia-se na especificidade de anticorpos fluorescentes marcado contra os seus antigénios correspondentes no interior de uma célula. Ambas abordagens directas e indirectas de imunofluorescência pode ser usado que se baseiam no uso de anticorpos ligados a um fluorocromo. A imunofluorescência direta é menos freqüentemente usado porque fornece sinal inferior, envolve custos mais elevados e menos flexibilidade. Em contraste, imunofluorescência indireta é mais comumente utilizado devido à sua alta sensibilidade e fornece um sinal amplificado desde mais de um anticorpo secundário pode anexar a cada anticorpo primário. Neste texto, tanto microscopia de epifluorescência e microscopia confocal foi utilizada para monitorizar a internalização da lactoferrina humana, um componente importante da resposta imunesistema, em células hepáticas. Além disso, nós monitorizado o potencial inibitório da hLF na replicação intracelular do vírus da hepatite C por meio de imunofluorescência. Ambas as vantagens e desvantagens associadas a estes métodos são discutidos.

A capacidade do Huh-7 linha celular hepática para internalizar exogenamente administrada hLF foi monitorizada utilizando imunofluorescência em um miscroscope confocal. hLF foi adicionado ao meio de cultura e a internalização foi deixada por 24 horas, após o que, a hLF extracelular foi lavada com PBS e a membrana ligada a hLF residual foi degradada com um tratamento com tripsina 5 min (1 mL). As células foram re-semeadas e deixou-se voltar a aderir durante 18 h antes de coloração por imunofluorescência. A fim de delinear...

A lactoferrina humana (hLF) é um componente do sistema imunológico. Neste estudo, ensaios de imunofluorescência são usados para demonstrar tanto a captação hepatocelular de hLF quanto uma redução qualitativa na replicação do vírus da hepatite C após o tratamento com hLF.

Imunofluorescência para monitorar a Incorporação celular de lactoferrina humana e sua Associated atividade antiviral contra o vírus da hepatite C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

O objetivo geral do experimento a seguir é monitorar a internalização da lactoferrina humana em células hepáticas utilizando microscopia de fluorescência epiluminiscente e microscopia confocal, e avaliar seu potencial inibitório sobre a replicação intracelular do vírus da hepatite C ou HCV. Isso é realizado cultivando células HUH 7, que suportam o replicon subgenômico do HCV. Em seguida, a lactoferrina humana é adicionada às células em crescimento, permitindo que a proteína entre nas células.Em seguida, as células são fixadas e visualizadas utilizando microscopia de fluorescência. Os resultados mostram que os hepatócitos têm a capacidade de adquirir HLF do seu ambiente extracelular e que a marcação do replicon subgenômico do HCV é reduzida nas células tratadas com HLF com base na microscopia de fluorescência. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do vírus EB C, como o mecanismo molecular pelo qual a rina inibe a replicação do vírus.Para começar, coloque um disco de vidro redondo no fundo de cada poço de uma placa de 24 poços e use PBS para lavar os poços. Semeie células HUH7 portadoras do replicon de HCV numa densidade de 5 × 10⁴ células por poço, em D

immunofluorescence-to-monitor-cellular-uptake-human-lactoferrin-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Dois métodos de formação de heterocários Descobrir Fatores de restrição HCV

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Fonte: Shah, R., et al. Imagem de Fluorescência Multiplexada em Célula Única para Visualizar Ácidos Nucléicos e Proteínas Virais e Monitorar Infecções por HIV, HTLV, HBV, HCV, Vírus Zika e Influenza. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a visualização simultânea de DNA, RNA e proteína do capsídeo do HIV-1 em linfócitos humanos infectados, utilizando hibridização de DNA ramificado e imunofluorescência, permitindo a análise detalhada das etapas da replicação viral em células individuais.

Imagens de Fluorescência Multiplexadas de Ácidos Nucleicos Virais e Proteínas em Linfócitos Humanos Infectados

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Fonte: Ren, S., et al. Um Protocolo para Analisar a Replicação do Vírus da Hepatite C. J. Vis. Exp. (2014)Este vídeo demonstra o ensaio de focos de fluorescência utilizado para quantificar o vírus da hepatite C infeccioso em cultura celular. Ele mostra a diluição seriada do sobrenadante viral, a infecção de células de hepatoma e a detecção de sítios de replicação viral por meio de microscopia de fluorescência baseada em anticorpos.

Quantificação do Vírus da Hepatite C Infeccioso por Microscopia de Fluorescência

Este vídeo demonstra um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais. Usando o vírus da hepatite C geneticamente modificado e a luciferase, ele avalia os efeitos inibitórios na fixação viral, conforme indicado pela menor intensidade de luz em poços co-tratados em comparação com poços tratados apenas com o vírus.

Um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais

Este vídeo demonstra um ensaio para avaliar agentes antivirais que visam etapas específicas da entrada viral nas células hospedeiras e fusão com o endossomo. As células são incubadas a baixa temperatura e depois infectadas com HCV. A baixa temperatura permite a ligação viral às células hospedeiras, mas inibe a internalização via endocitose. O composto antiviral de teste é adicionado e as células são incubadas à temperatura fisiológica. Essa mudança para uma temperatura mais alta facilita a...

Um ensaio para avaliar o efeito dos compostos de teste na entrada e fusão viral em células hospedeiras

Este vídeo demonstra um ensaio de imunofluorescência projetado para medir a neutralização do citomegalovírus humano (HCMV). Anticorpos específicos do vírus são misturados com o vírus e incubados com células de fibroblastos humanos. Os anticorpos neutralizam o vírus, tornando-o incapaz de infectar as células hospedeiras, enquanto os vírus não neutralizados infectam as células. Após a incubação, a extensão da neutralização é determinada quantificando as células infectadas pelo vírus usando...

Um método de imunofluorescência para medir a neutralização do citomegalovírus humano

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Aprenda a usar imunofluorescência para monitorar a internalização de lactoferrina humana em células hepáticas e avaliar seu efeito inibidor sobre a replicação do vírus da hepatite C.

Imunofluorescência para monitorar a Incorporação celular de lactoferrina humana e sua Associated atividade antiviral contra o vírus da hepatite C (Vídeo) | JoVE Journal

Imunofluorescência para monitorar a Incorporação celular de lactoferrina humana e sua Associated atividade antiviral contra o vírus da hepatite C

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