Customizado aparelho de aquecimento à base de laser para lançamento acionado de cisplatina de termossensível lipossomas com Ressonância Magnética Orientação Imagem

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a operação de um aparelho de aquecimento personalizado baseado em laser que pode ser usado para aquecer tumores subcutâneos localmente para entrega de uma formulação de lipossomas ativada por calor. Isso é feito preparando primeiro a formulação do HTLC por meio da formação de filme lipídico, extrusão de hidratação e diálise. Na segunda etapa, um camundongo doador é inoculado com células de carcinoma cervical.

Após quatro a cinco semanas, o tumor é excisado, cortado em fragmentos e implantado individualmente em um camundongo receptor. Na etapa final, o tumor do camundongo receptor é aquecido localmente a 42 graus Celsius usando o sistema de aquecimento baseado em laser. O aparelho de aquecimento baseado em laser é compatível com MR, o que permite o monitoramento das mudanças na temperatura do tecido durante a entrega de luz, e um pequeno e portátil que permite o aquecimento simples e eficaz do tumor no furo do pequeno animal

mr.Ultimamente, a liberação ativada pelo calor do HTLC termossensível pode ser monitorada por ressonância magnética em tempo real. As principais vantagens dessa técnica em relação ao método existente, como o uso de banho-maria e cateter de aquecimento, é que nossa técnica fornece um método conforme de fornecer calor ao tumor dentro de um a dois minutos após o início do tratamento térmico e permite o ajuste em tempo real da potência do laser, minimizando as flutuações de temperatura durante o procedimento. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando começamos a realizar estudos in vivo com nossa formulação de lipossomas termossensíveis HTLC.

Descobrimos que os métodos existentes não foram capazes de fornecer eficientemente aquecimento local de um tumor subcutâneo. Os procedimentos de preparação de lipossomas serão demonstrados por myung, um estudante de doutorado do meu laboratório Para preparar os lipossomas, comece combinando a mistura lipídica recém-preparada com a mistura de medicamentos lipídicos recém-preparada, seguida de uma hora de hidratação com vórtice a cada 15 a 20 minutos enquanto a mistura lipídica está hidratando. Monte a extrusora de 10 mililitros com duas pilhas de filtros de policarbonato de 200 nanômetros barril térmico da extrusora em um banho-maria circulante ajustado para 70 graus Celsius e conecte o dispositivo a um tanque de nitrogênio comprimido.

Imediatamente após a hidratação, transfira os lipídios para a câmara da extrusora e abra o fluxo de nitrogênio. Em seguida, a uma pressão de 200 PSI, extrude os lipossomas através das membranas, coletando os lipossomas em um tubo cônico de 50 mililitros colocado no banho-maria de 70 graus Celsius. Depois de extrudar os lipossomas cinco vezes, desmonte o dispositivo e remonte-o com duas pilhas de filtros de policarbonato de 100 nanômetros.

Defina a pressão para 400 PSI e extrude os lipossomas 10 vezes, conforme demonstrado. A coleta dos lipossomas da extrusão final em um tubo cônico de 15 mililitros permite que os lipossomas esfriem à temperatura ambiente, seguida pela precipitação da cisplatina insolúvel por centrifugação e, em seguida, dialise os lipossomas durante a noite contra solução salina a 0,9% em tubos de diálise com um corte de 15.000 pesos moleculares em condições estéreis. Para implantar o xenoenxerto de tumor cervical, colhe-me 180 células de uma cultura 90% confluente e conte o número de células viáveis de carcinoma cervical por hemo.

O citômetro então dilui as células para uma vezes 10 elevado a seis células por 100 microlitros. Todo o trabalho com animais foi realizado no Star Innovation Center, inocular camundongos fêmeas por injeção intramuscular no músculo gastrocnômico do membro posterior usando paquímetros, medir o tamanho do tumor resultante até que os tumores atingissem nove a 12 milímetros em sua dimensão mais longa. Em seguida, extirpe o tumor do camundongo doador e pique-o em fragmentos de dois a três milímetros cúbicos.

Agora raspe o membro traseiro esquerdo do animal receptor e faça uma incisão na pele nua. Insira um pedaço do tumor doador por via subcutânea através da incisão e use um a dois clipes de ferida para fechar a pele três a cinco dias após o implante. Remova os clipes e deixe o tumor crescer por duas a três semanas para realizar o tratamento térmico.

Primeiro, conecte uma extremidade de uma fibra de laser ao dispositivo a laser e a outra extremidade ao iluminador. Em seguida, insira um cateter de injeção de calibre 27 na veia da cauda lateral de um camundongo receptor anestesiado, seguido pela inserção de um cateter de calibre 22 no centro do tumor. Em seguida, coloque uma sonda de temperatura de fibra óptica no cateter oco para monitorar quaisquer mudanças de temperatura e cobrir todo o tumor com o iluminador. Final.

Defina a potência para 0,8 a um watt, ligue o laser e espere a temperatura subir ajustando manualmente a potência do laser durante todo o tratamento entre 0,1 a 0,8 watts para manter a temperatura do tumor em 42 graus Celsius, conforme ilustrado nesta imagem de uma seção transversal através de um tumor tratado termicamente, Assumindo uma potência total de um watt, a taxa máxima de fluência em qualquer ponto do tumor é de 70 miliwatts por centímetro quadrado com a taxa de fluência no tumor na profundidade da pele, medindo 50% da taxa máxima de fluência, conforme confirmado pela mudança da frequência de ressonância de prótons para aquecimento por termometria de ressonância magnética. O uso da configuração de aquecimento baseada em laser gera um mapa de distribuição de temperatura relativamente uniforme mostrado na imagem, que rastreia a mudança de temperatura relativa a partir de uma medição de linha de base absoluta adquirida antes do aquecimento pela fonte pontual. O tumor aquecido apresenta o maior aumento de sinal relativo em comparação com o músculo turta não aquecido após a administração de gad HTLC, conforme determinado pela análise do sinal de ressonância magnética, mantendo o sinal até o final do período de aquecimento Uma vez dominada, esta técnica pode ser configurada em menos de 15 minutos se for realizada corretamente, fornecendo uma ferramenta valiosa para a avaliação pré-clínica de formulações de lipossomas termossensíveis.

Não se esqueça de que trabalhar com um laser de Classe quatro pode ser extremamente perigoso e que precauções como o uso de óculos de segurança devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.