Customizado aparelho de aquecimento à base de laser para lançamento acionado de cisplatina de termossensível lipossomas com Ressonância Magnética Orientação Imagem

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o funcionamento de um aparelho de aquecimento baseado em laser, construído especialmente, que pode ser usado para aquecer tumores subcutâneos localmente, visando a liberação de uma formulação de lipossoma ativada por calor. Isso é realizado primeiramente pela preparação da formulação HTLC por meio da formação de filme lipídico, hidratação com extrusão e diálise. Na segunda etapa, um camundongo doador é inoculado com células de carcinoma cervical.

Após quatro a cinco semanas, o tumor é ressecado, cortado em fragmentos e implantado individualmente em um camundongo receptor. Na etapa final, o tumor do camundongo receptor é aquecido localmente a 42 graus Celsius utilizando o sistema de aquecimento baseado em laser. O aparelho de aquecimento baseado em laser é compatível com RM, o que permite o monitoramento das alterações na temperatura tecidual durante a administração da luz, e é pequeno e portátil, permitindo um aquecimento simples e eficaz do tumor no interior do orifício do aparelho de RM para pequenos animais.

Por fim, a liberação ativada pelo calor do HTLC termossensível pode ser monitorada por imagem de ressonância magnética em tempo real. As principais vantagens dessa técnica em comparação com métodos existentes, como o uso de banho-maria e cateter de aquecimento, são que nosso método fornece uma abordagem conformacional para a entrega de calor ao tumor em um a dois minutos após o início do tratamento térmico e permite ajuste em tempo real da potência do laser, minimizando as flutuações de temperatura durante o procedimento. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método quando iniciamos estudos in vivo com nossa formulação de lipossomos termossensíveis HTLC.

Descobrimos que os métodos existentes não eram capazes de fornecer aquecimento local eficiente de um tumor subcutâneo. Os procedimentos de preparação de lipossomos serão demonstrados por Myung, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para preparar os lipossomos, comece combinando a mistura lipídica recém-preparada com a mistura lipídica de fármaco recém-preparada, seguida por uma hidratação de uma hora com vortex a cada 15 a 20 minutos enquanto a mistura lipídica está hidratando. Monte o extrusor de 10 mililitros com duas pilhas de filtros de policarbonato de 200 nanômetros, aqueça o cilindro do extrusor em um banho de água circulante ajustado a 70 graus Celsius e conecte o dispositivo a um tanque de nitrogênio comprimido.

Imediatamente após a hidratação, transfira os lipídios para a câmara do extrusor e abra o fluxo de nitrogênio. Em seguida, a uma pressão de 200 PSI, extruda os lipossomos através das membranas, coletando-os em um tubo cônico de 50 mililitros colocado em banho-maria a 70 graus Celsius. Após extrudir os lipossomos cinco vezes, desmonte o equipamento e remonte-o com duas pilhas de filtros de policarbonato de 100 nanômetros.

Defina a pressão em 400 PSI e extrude os lipossomos 10 vezes conforme acabou de ser demonstrado. Coletar os lipossomos na extrusão final em um tubo cônico de 15 mililitros permite que os lipossomos esfriem até a temperatura ambiente, seguido pela precipitação do cisplatina insolúvel por centrifugação, e então dialise os lipossomos durante a noite contra solução salina 0,9% em tubos de diálise com corte de peso molecular de 15.000 em condições estéreis. Para implantar o xenoenxerto de tumor cervical, colete 180 células de uma cultura com 90% de confluência e conte o número de células viáveis de carcinoma cervical por hemo.

Citômetro, em seguida, dilua as células para um vezes 10 à sexta células por 100 microlitros. Todo o trabalho com animais foi realizado no Centro de Inovação Star; inocule camundongos skit fêmeas por injeção intramuscular no músculo gastrocnêmio da pata traseira utilizando paquímetro, meça o tamanho do tumor resultante até que os tumores atinjam de nove a 12 milímetros em sua maior dimensão. Em seguida, excise o tumor do camundongo doador e pique-o em fragmentos de dois a três milímetros cúbicos.

Agora, depile a pata traseira esquerda do animal receptor e faça uma incisão na pele descoberta. Insira um fragmento do tumor doador subcutaneamente através da incisão e utilize de um a dois clipes cirúrgicos para fechar a pele três a cinco dias após o implante. Remova os clipes e deixe o tumor crescer por duas a três semanas antes de realizar o tratamento térmico.

Primeiro, conecte uma extremidade de uma fibra laser ao dispositivo a laser e a outra extremidade ao iluminador. Em seguida, insira um cateter de injeção de 27 gauge na veia lateral da cauda de um camundongo receptor anestesiado, seguido pela inserção de um cateter de 22 gauge no centro do tumor. Depois, coloque uma sonda óptica de temperatura na luz do cateter para monitorar quaisquer alterações de temperatura e cubra todo o tumor com o iluminador. Final.

Defina a potência em 0,8 a um watt, ligue o laser e aguarde o aumento da temperatura, ajustando manualmente a potência do laser durante todo o tratamento entre 0,1 e 0,8 watts para manter a temperatura do tumor em 42 graus Celsius, conforme ilustrado nesta imagem de uma seção transversal de um tumor submetido a tratamento térmico. Considerando uma potência total de um watt, a taxa máxima de fluência em qualquer ponto do tumor é de 70 miliwatts por centímetro quadrado, com a taxa de fluência no tumor na profundidade da pele, medindo 50% da taxa máxima de fluência, conforme confirmado pelo deslocamento da frequência de ressonância de prótons na termometria por ressonância magnética durante o aquecimento. O uso da configuração de aquecimento baseada em laser gera um mapa de distribuição de temperatura relativamente uniforme, mostrado na imagem, que acompanha a variação relativa de temperatura a partir de uma medição de referência absoluta adquirida antes do aquecimento pela fonte pontual. O tumor aquecido exibe o maior aumento de sinal relativo em comparação com o músculo turt não aquecido após a administração de gad HTLC, conforme determinado pela análise do sinal de ressonância magnética, mantendo o sinal até o final do período de aquecimento. Uma vez dominada, esta técnica pode ser montada em menos de 15 minutos se realizada corretamente, fornecendo uma ferramenta valiosa para avaliação pré-clínica de formulações de lipossomos termossensíveis.

Não se esqueça de que trabalhar com um laser de Classe quatro pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de óculos de segurança, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.