Name: Uso de biossensores para quantificar enzimática endógena ATP ou H 2 Ó 2 No rim (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda a usar biossensores enzimáticos para medir ATP e peróxido de hidrogênio endógenos em rins de ratos em tempo real. Este método permite análises ex vivo e in vivo da sinalização celular renal.

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Agradecemos Sarissa Biomedical por seu trabalho no desenvolvimento dos sensores usados ​​no presente manuscrito. Esta pesquisa foi suportada pelo National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) e HL 122662 (A. Staruschenko e A. Cowley), um projeto financiado pelo Medical College of Comitê de Assuntos de Pesquisa Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) e Avançando um Programa de Pesquisa e Educação saudável Wisconsin # 9520217, eo Young Investigator Grant do National Kidney Foundation (O. Palygin).

Os seguintes procedimentos com animais aderiram ao Manual do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A aprovação prévia foi obtida de Cuidado e Uso Comitê Institucional Animal (IACUC). NOTA: Revisão das instruções do fabricante do sensor deve ser feito durante o delineamento experimental e antes da sua utilização. Seguindo estas instruções irá produzir os melhores resultados ao usar os sensores. Calibração do Sensor 1. <ol><li> Preparar soluções de fresco, antes do início da experiência. </li><li> Criar Tampão A contendo tampão NaPi 10 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 1 mM, e 2 mM de glicerol. Ajustar o pH a 7,4 usando NaOH. Armazenar a 2-8 ° C. </li><li> Utilizando uma concentração de estoque de ATP (100 mM) armazenado a -20 ° C, criar uma nova solução de calibração 10 mM de ATP pela adição de 10 ul de estoque de 90 ul de tampão A. </li><li> Re-hidratar o sensor de ATP, colocando a sua ponta (Figura 2) em tele câmara de reidratação contendo Tampão A durante pelo menos 10 min a 2-8 ° C. NOTA: Após reidratação, os sensores não devem ser expostos ao ar durante mais de 20 segundos ou a sensibilidade do sensor pode ser reduzida. Se longas exposições ao ar estão previstos, mergulhe o sensor brevemente em uma solução de glicerol. Os sensores podem ser usados ​​para várias experiências, mas estas devem ocorrer no mesmo dia como sensor de re-hidratação. Os sensores podem ser armazenados na câmara de hidratação com tampão A para até 24 horas. </li><li> Ligue o potenciostato canal duplo (Figura 3) e iniciar o software do sistema de gravação. </li><li> Prepara-se uma câmara de calibração com 3 ml de tampão A. Coloque o eléctrodo de referência dentro da câmara de calibração. Tome cada sensor da câmara de reidratação, em seguida, anexá-lo ao manipulador e inseri-lo na solução de câmara de calibração. NOTA: Use um silicone revestido placa de petri padrão como uma câmara de calibração. Realizar todas as calibrações e studies em uma gaiola de Faraday em uma mesa de ar do laboratório de alta performance para reduzir o ruído do sinal durante as gravações amperometria (Figura 4). Calibrações são o melhor feito tão perto do início da coleta de dados possível. Para aplicações in vivo, o tempo óptimo para a calibração é animais durante o período de recuperação pós-cirurgia. </li><li> Ex vivo calibração <ol><li> Realizar voltametria cíclica na câmara de calibração e ligando os sensores de -500 mV a +500 mV a uma velocidade de 100 mV / seg durante 10 ciclos. Isto melhora grandemente a sensibilidade dos sensores. Veja a Figura 5 para os traços observados a partir dos 10 ciclos. </li><li> Polarizar os sensores a +600 mV após o último ciclo. O sensor de corrente irá decair para uma assíntota. Uma leitura de equilíbrio é atingido após um mínimo de 5 minutos. Registre a leitura do zero. </li></ol></li><li> In vivo calibração do sensor <ol><li> Não execute a voltametria cíclica na in vivo sensors. Em vez disso, polarizar o sensor na câmara de calibração durante 30 seg a 500 mV. Em seguida, defina o potenciostato a 0 mV e permitir que a corrente do sensor de subir para uma assíntota. A corrente do sensor vai demorar pelo menos 2 min a assíntota. Registre a leitura do zero. </li></ol></li><li> Consecutivamente adicionar conjunto quantidades de solução de ATP para dentro da câmara para produzir uma linha de calibração que abrange uma gama de detecção desejado. A solução ATP produz um pico acentuado no sinal do sensor inicialmente, seguido por um decaimento como o ATP difunde-se uniformemente ao longo da câmara. Valores de sinal de gravação uma vez que o nível do sinal se estabilizou após cada adição de ATP. As Figuras 6A e 7 mostram traços e sugere concentrações de ATP para tanto ex vivo e estudos in vivo, respectivamente. NOTA: É importante confirmar a selectividade dos eléctrodos usando sequestrantes dos analitos. O presente protocolo utilizado apirase para testar a especificidade do sensor de ATP e catalase para o H &lt;sub&gt; 2 sinal de O 2 (Figuras 6B). Se os medicamentos são para ser administrado, as medições da sua reactividade com os sensores deve ser determinada antes do estudo. </li><li> Adicionar 3 mL de apirase a partir de um stock de 2 mg / ml (89 NU / mg) para testar a especificidade do sensor de ATP (a corrente produzida por aplicação de ATP deveria reduzir ao nível zero (Figura 7). </li><li> Adicionar 3 mL de catalase a partir de um stock de 2 mg / ml (100 ONU / mg) para testar a especificidade do sensor nulo (a corrente produzida por aplicação de H 2 O 2 deve reduzir a leitura de zero). </li></ol> 2. Cirurgia animal para estudos de Sensores <ol><li> Cirurgia para ex vivo <ol><li> Anestesiar o animal experimental com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) / Medical Grade O 2 ou outro método aprovado. 15 &#39;12 animais devem ser monitorados continuamente para assegurar um nível adequado de anestesia. Streação taxa e toe pitada respiratório capaz são usados ​​para confirmar a anestesia adequada. Nota: eutanásia do animal de acordo com os protocolos aprovados IACUC. Após a conclusão de todos os procedimentos não-sobrevivência sacrificar animais profundamente anestesiados por toracotomia induzir pneumotórax para assegurar o desaparecimento humano do animal 12. </li><li> Colocar o rato sobre uma mesa cirúrgica de temperatura controlada em posição supina. Enquanto se mantinha uma profundidade anestésico adequado, fazer uma incisão na linha média de cerca de 5 cm em linha com o rim esquerdo e expor a aorta abdominal distai. </li><li> Enrole uma ligadura ao redor do artérias celíaca e mesentérica superior ea aorta abdominal acima dessas artérias, mas não ligar. Enrole duas ligaduras em torno da aorta abdominal abaixo das artérias renais. </li><li> Prenda o aorta abdominal acima das ligaduras. Amarre a ligadura inferior. Cateterize da aorta abdominal com tubo de polietileno (PE50). Fixe o cateter com a segunda ligadura aorta. </li><li> Retire o grampo e ligar os mesentéricos e celíacos artérias. Perfundir rim de 6 ml / min com Solução Salina Equilibrada de Hanks à TA, durante 2-3 min, até que o rim é completamente branqueados. </li><li> Excisar o rim e o cateter, ligado porção da aorta. Colocar o rim para um prato de Petri de 3 ml cheio com solução de banho. Nota: protocolo de experiência pode ser realizada à temperatura ambiente. A solução do banho contém em mM: 145 de NaCl, 4,5 de KCl, 2 de MgCl2, 1 de CaCl2, 10 de HEPES, pH 7,35 ajustado com NaOH. </li></ol></li><li> Cirurgia para in vivo <ol><li> Anestesiar ratos utilizando protocolos aprovados IACUC. Para a análise in vivo anestesiar os ratos com cetamina (20 mg / kg IM) e inactina (50 mg / kg ip). Os animais devem ser continuamente monitorado para garantir um nível adequado de anestesia. Uma reação taxa e toe pitada respiratório estável são utilizados para confirmar a anestesia adequada. </li><li> Depois de profundidade anestesia adequada é obterEd, colocar o rato na posição supina sobre uma superfície ligada à terra, com temperatura controlada localizado sobre a mesa de ar. A superfície deve ser pré-aquecido e mantido a 36 ° C. </li><li> Enquanto se mantinha a profundidade da anestesia adequada, fazer uma incisão na linha média cerca de 5 cm em linha com o rim. </li><li> Usar um sutura para desviar e ancorar no tecido cutâneo e subcutâneo para que todo o rim é visível. Coloque o rim em um copo rim para minimizar os artefatos de movimento. </li><li> Utilize uma infusão IV de 2% de BSA: 0,9% de NaCl a 1 ml / 100 g / hr através da veia jugular para manter o volume de sangue. Canular ambos os ureteres para a coleta de urina. Coloque os laços em torno das artérias mesentéricas e celíacas superior ea aorta distal para a manipulação de pressão de perfusão renal (Figuras 10A). </li><li> Se a aplicação de agentes farmacológicos é necessário durante os experimentos in vivo, a inserção de um cateter intersticial é recomendada (Figuras 10B </strong&gt;). </li></ol></li></ol> Setup 3. Aquisição de Dados <ol><li> Abra o programa de aquisição de dados e definir a sua polaridade para ambos ex vivo e in vivo para Anodic positiva. Configure o programa para salvar dados como código ASCII. </li><li> Posicione os micromanipuladores para inserção rápida dos sensores para os rins. NOTA: Como alternativa, utilizar uma sonda ligada ao manequim micromanipulador para ajudar a conseguir o posicionamento desejado de sensores. </li><li> Ex vivo de aquisição de dados <ol><li> Perfundir o rim com uma solução de banho (a partir de 2.1.6) através da aorta foi canulada com uma taxa constante de 650 ul / min. Utilizando uma tesoura cirúrgica, cuidadosamente remover a cápsula do rim, o que é necessário para a inserção do sensor. </li><li> Fixar o rim com bandas de borracha sobre o rim amarrados e ligados ao prato revestido de silicone com pinos. </li><li> Colocar o eléctrodo de referência próximo do rim na placa de Petri com a sua ponta submersa ema solução tampão. </li></ol></li><li> Na aquisição de dados vivo <ol><li> Coloque o rim em um copo de rim. Dependendo da estirpe e idade do animal usar um tamanho de copo que contém o rim frouxamente. A Figura 8 mostra dois tamanhos de copos nos rins. Copos semelhantes são usadas para diferentes abordagens fisiológicas voltadas para a análise da função renal, tais como micropunção etc 16. Nota: A posição da taça do rim é crítica para remover o ruído mecânico produzido pela respiração animal, mas não deve interferir com a perfusão do rim ou bloquear o fluxo ou urina. </li><li> Permitir que 45 min de tempo de recuperação antes de realizar a coleta de dados. </li><li> Usando uma agulha 26-30G, fazer um buraco punção no local desejado e a profundidade do sensor no rim. Blot o buraco superfície para remover o sangue emanava. Adicionar solução de glicerol na superfície do rim. Isto irá evitar que a superfície do rim de secar durante a experiência. </li&gt; <li> Retire o primeiro sensor da câmara de reidratação e anexá-lo ao micromanipulador. Rapidamente, dentro de 20 segundos, inserir o eléctrodo dentro do buraco criado recentemente no rim. Repita os passos de 3,5-3,9 para o sensor nula. </li><li> Insira o eletrodo de referência para o rim, aproximadamente 1 cm a partir dos sensores. </li></ol></li><li> Ligue o potenciostato e activar o programa de gravação no computador. A Figura 9 mostra a configuração final do ex vivo de aquisição de dados do rim. A Figura 10 mostra a configuração final do rim de aquisição de dados in vivo com um cateter inserido. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Importar o arquivo de dados ASCII em origem ou qualquer outro software semelhante. </li><li> Relação atual concentração <ol><li> Use a função de ajuste / extrapolar linear para construir uma concentração linear (eixo x) para corrente (eixo y) relação para a ATP ou H 2 </sub&gt; O 2 pontos de calibração (Figuras 6 e 7). linear linha de ajuste: y = mx + b </li></ol></li><li> Equiparar a corrente a concentração </li><li> Subtrair os vestígios de medição do sensor nulo das do sensor de ATP para obter a corrente real produzida pelo ATP intracelular. </li><li> Converter os valores de ATP no PA obtidos por amperometria para nm, utilizando a equação de calibração detalhado em 4.2.1. Determinar a concentração do traço do sensor de ATP dados subtraídos importando cada corrente ajustada para o valor &quot;X&quot; e resolvendo para y (a concentração da substância a analisar). </li><li> Da mesma forma, calcular H 2 O 2 a partir da sua concentração equação de calibração, se necessário. </li></ol>

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</ol>

Sensores para a gravação do vídeo deste manuscrito foram fornecidas pela Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Reino Unido).

Os actuais protocolos foram desenvolvidos para proporcionar maior resolução temporal e espacial da sinalização de ATP e H 2 O 2 para rins perfundido de sangue ex vivo isolados, perfundidos e in vivo. As diferenças entre os protocolos e os sensores usados ​​aqui fornecem aquisição de dados ideal tanto para agentes farmacológicos ou estudos fisiológicos. Os protocolos consistem de 1) a calibração do sensor, 2) procedimento cirúrgico, 3) de configuração de aquisição de dados, e 4) a análise dos...

Biossensores microeléctrodo enzimática (também referida como sensores no presente manuscrito) ter sido uma ferramenta valiosa para estudar processos dinâmicos de sinalização em células e tecidos vivos. Os sensores proporcionam uma maior resolução temporal e espacial das moléculas de sinalização celular nas concentrações biologicamente relevantes. Em vez de amostragem e análise de fluidos extracelulares tomadas em intervalos durante longos períodos de tempo, estes sensores responder tão rápido quanto suas enzimas reagem com o analito, produzindo, assim, as medições em tempo real de 1,2. Detecção rápida de concentrações intersticiais de factores autócrinos e parácrinos, como purinas ou peróxido de hidrogénio, e a dinâmica da sua libertação pode ser utilizada para estabelecer um perfil para os efeitos da droga em condições normais e patológicas 3. Actualmente, a maioria das aplicações que usam sensores têm sido cérebro em lâminas de tecido e culturas de células 4-10. Os protocolos detalhados nesta objetivo manuscrito paraestabelecer os meios para medir com precisão concentrações em tempo real dos analitos em rins inteiros. Os seguintes protocolos foram desenvolvidos para estudar ATP intersticial e H 2 O 2 a sinalização em rins. No ambiente nativo do rim, ATP extracelular é rapidamente catabolizado por ectonucleotidases endógenos em seus derivados (ADP, AMP e adenosina). Os sensores usados ​​aqui são altamente seletivas para ATP sobre outras purinas ou ATP produtos de degradação 11. Isto oferece uma grande vantagem, pois permite um acompanhamento preciso das concentrações constantes e dinâmicas de libertação de ATP e sua função de sinalização. Intersticial concentração de ATP é medida utilizando a combinação de dois micro-eléctrodos, um sensor de ATP e um sensor nulo. O sensor nulo em combinação com catalase aplicações é capaz de detectar intersticial H 2 O 2 a 12 concentrações. Os seguintes protocolos de usar dois modelos diferentes de sensoRS que possuem características ideais para tanto ex vivo ou em aplicações in vivo. Ambos os modelos são baseados na reacção catalítica sequencial de glicerol cinase e oxidase de glicerol-3-fosfato contido em uma camada de sensor enzimática e é accionado pela presença de ATP. No conjunto de sensores utilizados nos estudos ex vivo, H 2 O 2, o produto final da reacção enzimática, é detectada por oxidação sobre um catalisador de platina / irídio eléctrodo de fio (Pt-Ir). Sensores para estudos in vivo em vez disso são baseados em H 2 O 2 a redução em um eletrodo de ouro mediador revestidos específicos para o tecido perfusão de sangue. Mostrado na Figura 1 é um esquema de ambos os protocolos descritos neste manuscrito. O sensor Null é idêntico ao seu sensor de ATP correspondente exceto ela não tem as enzimas ligadas. Portanto, para além da detecção de H 2 O 2 com a enzima de catalase, o sensor de MEA nuloSures interferências não específicas. Concentrações de ATP são calculados subtraindo o Null detectadas interferências não específicas e fundo H 2 O 2 a partir do sinal do sensor de ATP. Vários sensores também estão comercialmente disponíveis para a detecção de outros analitos, incluindo a adenosina, ionosine, hipoxantina, acetilcolina, colina, glutamato, glucose, lactato, d-serina por ex vivo aplicações ou adenosina, ionosine, e hipoxantina para in vivo, quando emparelhado com o nulo corresponde sensor. A capacidade de o sensor detectar com precisão analitos depende da pré adequada e calibrações pós-13. Isto assegura que a análise representa o desvio na sensibilidade do sensor, que ocorre durante a utilização em tecidos biológicos. O sensor contém um depósito de glicerol que é utilizado como um reagente nas reacções enzimáticas do sensor. Se o sensor não é utilizado em soluções contendo glicerol de banho, que deve perder ao longo do tempo. Shorter recording vezes são, então, necessárias para minimizar a deriva do sensor. Além disso a incrustação do sensor por proteases endógenas e os fragmentos de proteínas podem diminuir significativamente a sensibilidade dos sensores 14. O presente manuscrito estabelece o uso de biossensores microeletrodos enzimáticas para a ex vivo e em preparações in vivo de rim. Em tempo real quantificação do analito fornece detalhes sem precedentes de sinalização celular que pode revelar novos insights sobre os mecanismos de doenças renais e agentes farmacológicos.

<table><tbody><tr><td>Kit de Sensor</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>O kit inclui garrafa de armazenamento, câmara de reidratação, eletrodos e eletrodos de referência.&nbsp; Também incluído no kit está a escolha de sensores do usuário.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>loja em 2-8 oC antes de usar</td></tr><tr><td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>armazenar em 2-8 oC antes de usar</td></tr><tr><td>Sensor nulo Sarissaprobe 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>loja a 2-8 oC antes de usar</td></tr><tr><td>Sensor nulo Sarissagold 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>loja em 2-8 oC antes de usar</td></tr><tr><td>Manual Sarissaprobe ATP Sarissa</td><td>Biomedical</td><td></td><td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potenciostato de canal duplo</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Tipo II Gaiola de Faraday</td></tr><tr><td>Programa de aquisição de dados</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusão</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Modelo R99E</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de fibra óptica</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>suporte magnético para micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>mesa de ar</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>ventilador de isoflurano</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 ml placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>agulha</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26-30</td></tr><tr><td>pinos</td><td></td><td></td> G <td>Pinos de dissecção padrão</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> cateter <td>Tubo de polietileno (PE50)</td></tr><tr><td>cola de tecido de cateter</td><td>Sutura Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>elásticos</td><td></td><td></td><td>qualquer elástico de 2-4 mm de largura</td></tr><tr><td>silicone</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Clear 1#</td><td></td></tr><tr><td>clamp</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr>kit <td></td><td></td><td>de dissecação padrão</td><td>O kit deve incluir bisturi e sissors de dissecação&nbsp;</td></tr><tr><td>Copo</td><td></td><td></td><td>de rim de produtos químicos padrão de design próprio</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM ATP solução</td></tr><tr><td>de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Apirase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>inactina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>cetamina</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Solução salina balanceada&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de biossensores para quantificar enzimática endógena atp ou h<sub&gt; 2</sub&gt; Ó<sub&gt; 2</sub&gt; no rim

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Biossensores microeléctrodo enzimáticas têm sido amplamente utilizados para medir a sinalização extracelular em tempo real. A maioria da sua utilização tem sido limitada a fatias de cérebro e cultura de células neuronais. Recentemente, esta tecnologia tem sido aplicada aos órgãos inteiros. Avanços em design de sensor tornaram possível a medição de sinalização celular em em rins vivo perfusão de sangue. Listar os atuais protocolos os passos necessários para medir ATP e sinalização H 2 O 2 no interstício do rim do rato. Dois modelos de sensores separados são usados ​​para o ex vivo e in vivo protocolos. Ambos os tipos de sensores são revestidos com uma fina biolayer enzimática no topo de uma camada de permeabilidade selectiva para dar resposta rápida, biossensores sensíveis e selectivos. A camada de permeabilidade selectiva protege o sinal a partir dos interferentes no tecido biológico, e a camada enzimática utiliza a reacção catalítica sequencial de glicerol cinase e glicerol-3-fosphate-oxidase na presença de ATP para produzir H 2 O 2. O conjunto de sensores utilizados para os estudos ex vivo mais analito detectada por oxidação de H 2 O 2 em uma platina / irídio eléctrodo de fio (Pt-Ir). Os sensores para os estudos in vivo são, em vez baseado na redução de H 2 O 2 em um eléctrodo de ouro revestido mediador concebido para o tecido perfundido de sangue. Mudanças concentração final detectado por amperometria são em tempo real seguido de calibração de concentrações conhecidas de analito. Além disso, a especificidade do sinal amperométrico pode ser confirmada pela adição de enzimas como a catalase e apirase que quebram H 2 O 2 e ATP correspondentemente. Estes sensores também dependem fortemente de calibrações precisas antes e depois de cada experimento. Os dois protocolos seguintes estabelecer o estudo de detecção em tempo real de ATP e H 2O 2 em tecidos renais, e pode ser ainda modificado para prolongar o método descrito para o uso em outras preparações biológicas ou órgãos inteiros.

O design do biossensor microeléctrodo enzimático permite a detecção em tempo real dos analitos em rins inteiros. A concepção geral para qualquer experiência ex vivo ou estudos in vivo é ilustrado na figura 1 os sensores .Os utilizada e os procedimentos cirúrgicos diferentes, dependendo se o estudo é ex vivo ou in vivo. Para obter resultados reprodutíveis, pré precisas e calibrações pós são críticas. A figura 6A mostra um traço repr...

Os biossensores de microeletrodos enzimáticos permitem medições em tempo real da sinalização de células extracelulares em concentrações biologicamente relevantes. Os protocolos a seguir estendem as aplicações de biossensores para a detecção ex vivo e in vivo de ATP e H2O2 no rim.

Uso de biossensores para quantificar enzimática endógena ATP ou H<sub&gt; 2</sub&gt; Ó<sub&gt; 2</sub&gt; No rim

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

O objetivo geral desses procedimentos é medir em tempo real as concentrações endógenas intersticiais de uma TP e de peróxido de hidrogênio em rins inteiros. Isso é realizado primeiramente reidratando e calibrando sensores para aplicações ex vivo e in vivo com concentrações conhecidas de uma TP e peróxido de hidrogênio. Para a instalação do sensor ex vivo, o rim foi instrumentado cirurgicamente e limpo do sangue.Este procedimento é realizado lavando o rim através da aorta. Em seguida, o rim de rato é isolado cirurgicamente, colocado em uma câmara de registro e perfundido com solução salina. Um TP e peróxido de hidrogênio são medidos utilizando sensores ex vivo para o procedimento in vivo.Uma incisão é feita para permitir a visualização do rim perfundido com sangue. O rim é colocado no suporte estabilizador e um cateter intersticial pode ser implantado para aplicações de fármacos. As concentrações intersticiais renais adicionais de ATP e peróxido de hidrogênio são medidas utilizando sensores in vivo.No final, esses protocolos facilitam o uso de biossensores enzimáticos microeletrodos para medidas em tempo real de ATP e peróxido de hidrogênio no interstício renal. A principal vantagem dos biossensores enzimáticos é a sua capacidade de medir diretamente as concentrações endógenas intersticiais em tecidos biológicos. Aqui, esta tecnologia é utilizada para detectar as concentrações de ATP e peróxido de hidrogênio no interstício de rim isolado perfundido com solução salina, ou in vivo.A precisão dos biossensores enzimáticos permite medições em tempo real da regulação basal e dinâmica das concentrações extracelulares de ATP ou peróxido de hidrogênio. Essas medições podem estabelecer perfis de aplicação de fármacos ou de doenças para regiões renais funcionalmente distintas. Reidrate ambos os sensores, o de ATP e o nulo, colocando suas pontas em câmaras de reidratação separadas contendo tampão A por pelo menos 10 minutos a duas a oito graus Celsius.Ligue o potenciostato de canal duplo e inicie o software do sistema de gravação. Configure o programa para salvar os dados como código A-S-C-I-I e a polaridade do sensor para anódica positiva. Prepare uma câmara de calibração com três mililitros de tampão, abaixando o eletrodo de referência na câmara.Retire cada sensor da reidratação. Fixe-os em micromanipuladores e insira-os na solução da câmara de calibração. Realize todas as calibrações e estudos dentro de uma gaiola de Faraday sobre uma mesa de ar de alto desempenho para reduzir o ruído do sinal.During the gravações de pirometria. Realize a telemetria voltcíclica para os sensores ex vivo na câmara de calibração. Ao cíclicar os sensores de menos 500 milivolts a mais 500 milivolts a uma taxa de 100 milivolts por segundo durante 10 ciclos, isso melhora grandemente a sensibilidade dos sensores, polarizando os sensores a mais 600 milivolts.Após o último ciclo, a corrente do sensor decairá até um valor assintótico. Uma leitura estável é alcançada após um mínimo de cinco minutos. Registre a leitura de zero e adicione consecutivamente quantidades definidas de uma solução de TP na câmara para produzir uma curva de calibração que abranja a faixa de detecção desejada do sensor de ATP.A solução de ATP produzirá inicialmente um pico acentuado no sinal do sensor, seguido por uma diminuição à medida que o ATP se difunde uniformemente pela câmara. Os valores do sinal devem ser registrados assim que o nível do sinal se estabilizar. Para cada adição de ATP, adicione três microlitros evaporados de um estoque de dois miligramas por mililitro para testar a especificidade do sensor de ATP.A corrente produzida por uma aplicação de TP deve reduzir-se ao nível zero consecutivamente com a adição de quantidades definidas de solução de peróxido de hidrogênio na câmara, para gerar uma linha de calibração que englobe uma faixa de detecção; os valores do sinal do sensor nulo devem ser registrados assim que o nível do sinal estiver estabilizado. Para cada adição de peróxido de hidrogênio, adicione três microlitros de extrato de tecido bovino a partir de um estoque de dois miligramas por mililitro para testar a especificidade do sensor nulo. A corrente produzida pela aplicação de peróxido de hidrogênio deve reduzir-se à leitura zero para estudos ex vivo.Ligadura de rapamicina ao redor das artérias celíaca e mesentérica superior e da aorta abdominal acima dessas artérias. Mas não ligar rep duas ligaduras ao redor da aorta abdominal abaixo da artéria renal. Ligar a aorta abdominal distalmente abaixo da artéria renal.Prenda a aorta pelo menos um centímetro acima da ligadura e abaixo da artéria renal. Canule a aorta abdominal com tubo de polietileno entre a ligadura mais baixa e o prendedor. Fixe o cateter com a segunda ligadura da aorta.Remova o clamp e ligue as artérias mesentérica e celíaca e a aorta acima dessas artérias. Perfuse o rim a seis mililitros por minuto com solução salina balanceada de Hank à temperatura ambiente por dois a três minutos, até que o rim fique completamente esbranquiçado. Além disso, a veia renal pode ser cateterizada para coleta do fluido de saída.Usando pin&ccedil;as cir&uacute;rgicas, remova cuidadosamente a c&aacute;psula renal, que &eacute; necess&aacute;ria para a inser&ccedil;&atilde;o do sensor. Resseque o rim, incluindo a por&ccedil;&atilde;o da aorta conectada ao cateter. Coloque o rim em uma placa de Petri de tr&ecirc;s mililitros preenchida com solu&ccedil;&atilde;o de banho.Perfunda o rim com solução de banho através da aorta canulada a uma taxa constante de 650 microlitros por minuto. Fixe o rim com elásticos posicionados sobre o órgão e presos ao recipiente revestido de silicone por meio de pinos. Coloque o eletrodo de referência próximo ao rim na placa de Petri, com suas pontas submersas na solução de banho.Posicione os micromanipuladores para inserção rápida dos sensores no rim. Alternativamente, utilize uma sonda fictícia conectada a cada micromanipulador para ajudar a obter o posicionamento desejado dos sensores para cada sensor, com duração não superior a 20 segundos. Remova o sensor da câmara de reidratação, fixe-o ao micromanipulador e insira o sensor na solução do banho da placa.Se for esperada uma exposição mais prolongada ao ar, mergulhe brevemente o sensor em uma solução de glicerol a cada exposição. Polarize os sensores com o potenciostato em mais 600 milivolts e aguarde a estabilização da corrente. Avance cada sensor até a mesma profundidade no rim.Realize a análise dos dados de acordo com o protocolo descrito. O design do biossensor enzimático com microeletrodo permite a detecção em tempo real de analitos e rins inteiros para obter resultados reprodutíveis. Calibrações precisas antes e após o procedimento são essenciais.Esta figura mostra um traço representativo do sinal produzido pelo sensor X pvo, um sensor TP e um sensor nulo durante a calibração de um sensor TP. O procedimento de calibração produz um ajuste linear que é usado para calcular as mudanças dinâmicas de um TP. O sensor nulo é calibrado com a adição de concentrações conhecidas de peróxido de hidrogênio à solução do banho e os valores paramétricos asim a am são registrados. A adição de catalisadores à solução do banho resulta em rápida decadência da corrente.O sensor in vivo produz um traçado semelhante, mas detecta correntes redutoras em vez de correntes oxidativas, e, portanto, a corrente é negativa. A calibração também produz um ajuste linear na faixa de 0,3 a 80 micromolar. A especificidade do sensor in vivo para TP em relação a outros produtos de purina é mostrada aqui. Demonstrado nesta figura estão as alterações na concentração endógena de peróxido de hidrogênio intersticial induzidas pela angiotensina II em rins recém-isolados de ratos resistentes e sensíveis ao sal.A angiotensina dois induz uma liberação aguda de peróxido de hidrogênio de ambos os rins. No entanto, as amplitudes máximas foram significativamente elevadas nos rins de ratos sensíveis ao sal, especialmente quando alimentados com uma dieta rica em sal. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a ponta do sensor e a superfície do córtex renal são delicadas e, portanto, danificar qualquer uma delas comprometerá as gravações precisas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir substâncias endógenas e órgãos inteiros, como o rim. Você também será capaz de realizar com precisão calibrações e os procedimentos cirúrgicos necessários para gravações bem-sucedidas. Aplicamos este método para estudar um TP e os níveis basilares de peróxido de hidrogênio, bem como sua liberação no rim.No entanto, a mesma abordagem pode ser utilizada para determinar as concentrações de adenosina, glutamato, glicose e algumas outras substâncias quando sensores correspondentes são aplicados.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Os efeitos da activação da proteína quinase C (PKC) isozimas de funções mitocondriais associadas com a respiração e fosforilação oxidativa e na viabilidade celular são descritos. A abordagem técnica adapta adenoviral para superexpressar selectivamente as isozimas PKC em cultura primária de células e uma variedade de ensaios para determinar as funções mitocondriais e do estado de energia da célula.

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

Descrevemos um método para quantificar a atividade de ATPases do tipo P de contratransporte de K+ pela expressão heteróloga das enzimas em oócitos de Xenopus e medindo a captação de Rb+ ou Li+ em células individuais por espectrofotometria de absorção atômica. O método é uma alternativa sensível e segura aos experimentos de fluxo de radioisótopos, facilitando estudos cinéticos complexos.

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

Aqui descrevemos ensaios bioquímicos que podem ser usados para caracterizar enzimas de remodelação da cromatina dependentes de ATP por suas habilidades de 1) catalisar o deslizamento do nucleossomo dependente de ATP, 2) envolver-se com substratos de nucleossomos e 3) hidrolisar ATP de maneira dependente de nucleossomo ou DNA.

Os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de ATP-dependente cromatina remodelação Enzimas

Descrevemos um protocolo básico para quantificar a atividade da ATPase in vitro. Este protocolo pode ser otimizado com base no nível de atividade e requisitos para uma determinada ATPase purificada.

Medindo<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade ATPase para enzimática Caracterização

As cinases de proteínas são altamente evoluídas sinalizando enzimas e andaimes que são críticos para a transdução de sinal inter e intracelular. Nós apresentamos um protocolo para medir a atividade de quinase através do uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), um método confiável para auxiliar na elucidação da regulação da sinalização celular.

Ensaio da Actividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Proteases são rigidamente regulamentadas enzimas envolvidas em processos biológicos fundamentais e desregulação protease atividade unidades de progressão de doenças complexas como câncer. O objetivo do método é criar nanosensors que medem protease atividade na vivo , produzindo um sinal de clivagem que é detectável de urina de anfitrião e discrimina a doença.

Nanosensors para detectar Protease atividade In Vivo para diagnóstico não-invasivo

Nós caracterizamos uma proteína nova da quinase usando aproximações bioquímicas robustas: análise ocidental do borrão com um anticorpo específico dedicado em linhas e em tecidos diferentes da pilha, interações por experimentos do coimmunoprecipitação, atividade da quinase detectada por ocidental Blot usando um anticorpo fosho-específico e por γ [32P] rotulagem ATP.

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

Descrevemos um protocolo para a expressão específica do tipo celular do sensor geneticamente codificado baseado em FRET ATeam1.03YEMK em culturas organotípicas do antecérebro do rato. Além disso, mostramos como usar este sensor para imagens dinâmicas dos níveis de ATP celular em neurônios e astrócitos.

Imagem de ATP intracelular em fatias organotípicas do tecido do cérebro do rato usando o sensor ateam1.03yEMK baseado em FRET

O Kit de Detecção de Protease fluorescente é projetado para a medição da atividade da protease usando fluorometria. Também é adequado para a detecção de vestígios de contaminação protease. O método é baseado no hydroysis proteolítica de uma formulação de um substrato de caseína FITC-rotulados.

Uso do Kit de Detecção de Protease Fluorescente para determinar a atividade de protease

Aprenda a usar biossensores enzimáticos para medir ATP e peróxido de hidrogênio endógenos em rins de ratos em tempo real. Este método permite análises ex vivo e in vivo da sinalização celular renal.

Uso de biossensores para quantificar enzimática endógena ATP ou H

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