A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

O objetivo geral deste procedimento é preparar o corte cortical de Calot Thal com quatro estruturas auditivas principais, o colo inferior, o tálamo auditivo, a porção auditiva do núcleo reticular talâmico e o córtex auditivo. Isso é feito removendo primeiro o cérebro do mouse. O segundo passo é bloquear o cérebro em preparação para o corte.

Em seguida, corte o cérebro para obter fatias contendo a conexão cortical Calot thal. A etapa final é usar imagens de flavoproteínas para avaliar a conectividade. Em última análise, a fatia do cérebro contendo a conexão cortical carotal pode ser usada para uma variedade de experimentos para entender melhor o processamento de informações nas regiões auditivas do cérebro médio e quatro A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas para bloquear o cérebro antes do corte são difíceis de aprender porque requer um corte complexo de ângulo duplo, que é a chave para obter projeções intactas.

Demonstrando a técnica estará BJ Slater, um estudante de pós-graduação em meu laboratório, Para preparar o estágio de corte para fatiar, corte um pequeno pedaço de 3% de aproximadamente um centímetro cúbico para ser usado como um batente para o cérebro, e outro pedaço de 1,5 centímetro por 1,5 milímetro por três milímetros para ser usado como uma protuberância para apoiar o colículo inferior. Em seguida, cole o recuo no palco com adesivo de cianoacrilato e, em seguida, cole a saliência no lado direito do recuo de modo que forme um ângulo de 80 graus em um slide marcado com duas linhas a 90 graus e uma linha diagonal a 17 graus do canto superior esquerdo para o canto inferior direito, coloque o lado dorsal do cérebro para cima no ponto de interseção das duas linhas. Usando uma lâmina de barbear, remova de dois a quatro milímetros da extremidade rostral do cérebro para criar uma superfície plana.

Em seguida, coloque o cérebro com o lado do mimo para cima na superfície plana recém-criada. Alinhe a superfície dorsal do cérebro com uma linha horizontal e a linha média do cérebro com uma linha vertical marcada no slide. Em seguida, alinhe a lâmina de barbear com uma linha de 17 graus.

Incline a navalha em um ângulo de 30 graus e remova aproximadamente três milímetros do córtex direito em um corte diagonal duplo para montar o cérebro no estágio de vibrato. Coloque um pequeno pedaço de papel de filtro no lado ventral do cérebro de modo que a dimensão longa fique perpendicular à linha média. Aplique cuidadosamente uma pequena quantidade de adesivo de cianoacrilato na área em frente ao batente traseiro e à esquerda da saliência.

Em seguida, coloque o lado do cérebro cortado diagonalmente na cola de modo que a parte do cérebro e o cérebro posterior fiquem apoiados na protuberância e o lado direito do cérebro fique contra o recuo. Neste procedimento, coloque rapidamente o estágio de corte no vibrato, construa um estágio com solução de corte. Em seguida, alinhe a lâmina com a parte superior do cérebro.

Remova de um a 1,5 milímetros da parte superior do cérebro. Em seguida, corte e remova mais fatias de 300 a 500 micrômetros enquanto se aprofunda. Quando o colículo inferior, o corpo medial e o núcleo lateral da ICT são visíveis, o giro dentado deve aparecer em forma de C e a estrutura deve estar alinhada.

Obtenha cerca de duas fatias de 600 micrômetros. Estas são as fatias corticais carotais. Depois disso, transfira-os para a câmara de retenção de 32 graus Celsius.

Para adquirir a imagem de autofluorescência de flavoproteínas, colete as imagens a quatro hertz por 105 segundos. Ilumine o tecido com luz azul de 470 a 490 nanômetros e capture acima de 515 nanômetros, garantindo que a imagem não fique muito escura nem estourada. Em seguida, use a estimulação elétrica para ativar o tecido para adquirir uma imagem de cálcio.

Colete imagens a 10 hertz por 25 segundos. Ilumine o tecido com luz de 365 nanômetros e capture a fluorescência acima de 510 nanômetros. Novamente, garantindo que a imagem não esteja muito escura nem estourada.

Em seguida, use estimulação elétrica para ativar as células. Esta imagem mostra a confirmação da conexão cortical carotal na fatia do cérebro por autofluorescência de flavoproteínas. A estimulação elétrica dada a 0,05 hertz para o cólus inferior foi fotografada em quatro hertz e quatro a processada para mostrar a potência nessa estimulação.

Frequência, o tálamo auditivo, o tálamo, reticular, núcleo e córtex auditivo são ativados sinapticamente. Aqui está uma fatia desconectada. A estimulação elétrica do cólico inferior com ativação foi observada apenas no tálamo auditivo.

Todo o caminho não foi capturado, provavelmente devido a um dos cortes estar ligeiramente fora do plano. Com projeções corticais de Alam. Esta imagem mostra a ativação atípica do córtex auditivo.

A estimulação elétrica do cólon inferior ativou o córtex auditivo sem sinal visível. No tálamo auditivo, é provável que o tálamo ainda estivesse ativado, mas não na superfície da imagem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter a fatia cortical talâmica AAL e avaliar sua conectividade.