Name: A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Aprenda a preparar fatias colículo-tálamo-corticais do cérebro de camundongo preservando conexões auditivas intactas. Este método utiliza corte duplo angular e imagem de flavoproteína para estudar processamento auditivo.

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Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação Prêmios R03-DC-012125 para D. A. Llano e F31-DC-013501 para B. J. Slater, bem como pela Fundação Carver.
Os autores gostariam de agradecer a Jason MacLean e Matthew Banks pelos conselhos técnicos com imagens de cálcio.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na Universidade de Illinois. Todos os animais foram alojados em instalações de cuidados de animais aprovados pela Associação Americana para Credenciamento de Laboratório Animal Care. Foi feito todos os esforços para minimizar o número de animais utilizados e reduzir o sofrimento em todas as fases do estudo. 1. Preparação e Remoção de cérebro de rato para Cortando <ol><li> Prepare-se para perfusão e fatia de incubação. <ol><li> Cerca de 30 minutos antes de cortar, preparar alta solução de corte de sacarose e de baixo aCSF cálcio para a incubação da fatia antes da gravação ou imagem. </li><li> Colocar para fora todas as ferramentas necessárias (grandes tesouras cegas finais, pequenas tesouras primavera, pinças anatômicas, grandes tesouras ou guilhotina, íris tesouras, joalheiros fórceps, seringa de 10 ml com agulha de 27G x 1/2 polegadas, pequeno pedaço de 1 cm x 2 cm de filtro papel, e uma pipeta Pasteur com ponta quebrada para sltransferência de gelo) para perfusão e corte, e preparar a bandeja de perfusão. </li><li> Configurar câmara com oxigenado aCSF incubação num banho de água 32 o C e um prato de cultura preenchido com solução de corte. </li></ol></li><li> Prepare corte palco para cortar. <ol><li> Corte um pequeno pedaço de agar a 3%, aproximadamente, 1 cm 3 para usar como um batente para o cérebro e 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm para uma colisão para ser utilizado para sustentar o IC. </li><li> Cole o batente traseiro para o palco com adesivo de cianoacrilato, bem como a saliência no lado direito do batente de tal modo que eles formam um ângulo de 80 °. </li></ol></li><li> Remover o cérebro. <ol><li> Profundamente anestesiar a p12-p20 (idealmente p14-18) mouse com cetamina 100 mg / kg e xylaxine 3 mg / kg (ou procedimento aprovado comitê de ética comparáveis). Nota: Confirme nível anestesia adequada através de falta de resposta aos pés pitada. À medida que o animal é brevemente sob anestesia, pomada oftálmica é desnecessária. </li><li> Usando sem cortetesoura acabar, expor a caixa torácica do apêndice xifóide até o pescoço. <ol><li> Encontre o apêndice xifóide, e faça um corte horizontal de aproximadamente 1,5 cm. </li><li> Faça dois cortes verticais das extremidades do corte horizontal anterior para os ombros, aproximadamente 1,5 cm cada. </li></ol></li><li> Corte através do diafragma e as junções costocondrais para expor o coração. </li><li> Com uma tesoura pequena mola, faça um pequeno, 2-5 mm cortar no átrio direito, a partir do ventral para dorsal lado do coração. </li><li> Usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 27G x 1/2 de polegada, injectar o ventrículo esquerdo e rapidamente perfundir o animal com elevado corte solução de sacarose. </li><li> Quando o sangue corre claro, usar a tesoura maiores para remover a cabeça. Nota: Não temos sistematicamente avaliada a utilidade da perfusão. No entanto, em nossa experiência, a perfusão transcardíaca em ratinhos jovens este pode ser feito com quase 100% de sucesso, e tem a vantagem de eliminar bl vermelhoood células, o que pode interferir com fluorescência e imagem. </li><li> Corte a pele para baixo da linha média para expor o crânio. </li><li> Usando íris dobrados tesoura, corte o crânio entre os olhos, em seguida, começando a partir do corte entre os olhos, cuidadosamente cortadas de anterior para posterior ao longo da sutura mediana tomando cuidado para não danificar o cérebro por baixo. Nota: A dura geralmente sai com o crânio. Se necessário, retire a dura antes de retirar cuidadosamente o cérebro. </li><li> Usando uma pinça joalheiro, forçar a abertura do crânio e remova cuidadosamente o cérebro, em seguida, colocar o cérebro em solução de corte. Tome cuidado para não danificar o córtex. </li></ol></li></ol> 2. Preparação do cérebro por Cortando <ol><li> Preparando cérebro para montagem em vibratome palco. <ol><li> Usando uma lâmina marcada com duas linhas a 90 o e uma linha diagonal em 17 o da parte superior esquerda para a direita inferior, interseção onde as duas linhas se encontram, coloque o lado do cérebro dorsal para cima, utilizandouma lâmina de barbear, de 2-4 mm de remover o cérebro extremidade rostral criando uma superfície plana. </li><li> Coloque cérebro lado do caudal sobre a superfície plana recentemente criado, e alinhar a superfície dorsal do cérebro com a horizontal e da linha média do cérebro com a linha vertical. </li><li> Alinhe a lâmina de barbear com a linha 17 o, incline a lâmina em um ângulo de 30 ° e retire cerca de 3 mm do córtex direito em um corte diagonal duplo (17 o do plano horizontal e 60 o do coronal). </li></ol></li><li> Montagem cérebro em vibratome palco. <ol><li> Coloque um pequeno pedaço de papel de filtro de 1 cm x 2 cm sobre o lado ventral do cérebro, de forma que a dimensão do comprimento é perpendicular à linha mediana. </li><li> Cuidadosamente aplicar uma pequena quantidade de adesivo de cianoacrilato para a área em frente do batente traseiro (e para a esquerda da colisão). </li><li> Coloque o cérebro diagonalmente duplo corte para a cola de modo a que a parte caudal do cérebro e do encéfalo posterior são prOP sobre a colisão eo lado direito do cérebro é contra o anti-retorno. </li><li> Delicadamente pressionar para baixo sobre o cérebro, assegurando que toda a superfície está em contacto com a câmara de corte. </li></ol></li></ol> 3. A obtenção da Colliculo-tálamo-cortical Slice <ol><li> Assumir rapidamente o estágio de corte e coloque no vibratome, encher o palco com uma solução de corte. </li><li> Alinhar a lâmina com a parte superior (lado ventral) no cérebro. </li><li> Remover 1-1,5 mm a partir do topo do cérebro, remova 300-500 uM fatias e avaliar profundidade após a remoção. Nota: Quando o IC, o MGB, eo núcleo geniculado lateral (LGN) são visíveis, eo giro dentado forma uma forma &#39;C&#39; levar de um a dois 600 um fatias. Ver a Figura 3A. </li><li> Coloque as fatias em câmara quente (32 ° C), segurando. </li></ol> 4. Criação de Imagens do Slice <ol><li> Preparação para a imagem latente flavoprotein autofluorescência. <ol> &lt;li&gt; Preparar aCSF pela perfusão da fatia numa câmara de registo electrofisiológico padrão, bolha aCSF com 95% de O2 / 5% de CO 2. </li><li> Puxe eletrodo de vidro para a estimulação. Observe que vários eletrodos estimulantes diferentes e configurações (vidro, tungsténio, fibra de carbono, monopolar, bipolar) todo o trabalho muito bem em conjunto com imagiologia flavoprotein autofluorescência. </li><li> Ligue computador, câmera, micromanipulador, fonte de luz, estimulação software, software de captura de imagem. </li><li> Perfundir a câmara de gravação com oxigenado aCSF, coloque ponte personalizado (projeto disponível em Materiais Complementares) para elevar a fatia na câmara. Nota: taxa de perfusão pode variar de acordo com qualquer indivíduo configurar; 5-15 mL / min é usada aqui. </li><li> Coloque fatia na câmara, diminuir o nível de líquido na câmara para evitar que a fatia de levantar fora da ponte ao colocar harpa especialmente construído sobre fatia, tendo o cuidado de evitar a colocação de cordas da harpa sobre as vias de cooperação interEst (Figura 1A). Aumentar o nível de líquido para cerca de 1-2 mm acima da fatia para manter o fluxo aCSF acima e abaixo da fatia. Nota: Se o reposicionamento é necessário, use o fim Pasteur pipeta quebrado ou permitir que o nível aCSF a subir e utilize uma pinça com extremo cuidado. </li><li> Inserir eletrodos de cloreto de prata em eletrodo de vidro cheio de aCSF, insira o eletrodo de vidro em micromanipulador e conectar-se ao estímulo isolador, e coloque cuidadosamente eletrodo de vidro no IC / substância branca levando a tálamo (ver Figura 1A). </li></ol></li><li> Flavoproteína aquisição de imagem autofluorescência. <ol><li> Coletar imagens em 4 Hz (usando uma macro 2X objetivo corrigido ao infinito (NA 0,13)) e uma câmera para 105 seg enquanto estimular eletricamente (cada estímulo consiste de 1 seg de 40 Hz 2 ms pulsos tecido em 0,05 Hz cinco vezes), enquanto iluminando o tecido com luz azul 470-490 nm e 515 nm capturar acima. Certifique-se de que a imagem não é nem aVeja o escuro, nem apagado Figura 3 coluna esquerda para referência. Nota: Coleção tempo, frequência de recolha, e freqüência de estimulação pode ser alterado para se adequar ao experimento, o programa personalizado incluído no materiais complementares podem ser modificados como tal. </li><li> Exportar imagens para Matlab, e utilizando o programa de escrita feito sob encomenda disponível em materiais complementares, para análise espectral de potência das imagens em 0,05 Hz. A imagem resultante mostrará vias conectados. Nota: O programa personalizado usa uma transformação Fourier rápida dos valores de pixel da série histórica para produzir a imagem. </li></ol></li><li> Preparação para a imagiologia de cálcio. <ol><li> Prepare pequena câmara de incubação utilizando um prato de cultura de 3 cm e membrana cultura levantada para permitir aCSF para alcançar a parte superior e inferior da fatia, e lugar numa almofada de aquecimento para manter a temperatura a cerca de 32 o C. </li><li> Preencha pequena câmara de incubação com aCSF morna e lentamente bolha com 95% O2/5% de CO 2. </li><li> Misturar 2 ul de Pluronic F-127 de ácido e 50 ug de Fura-02:00 dissolvido em 48 ul de DMSO. </li><li> Lugar em fatia pequena câmara de incubação na membrana levantou e cuidadosamente usando uma micropipeta adicione a mistura de coloração diretamente acima do MGB (ou outra estrutura de interesse). </li><li> Cubra fatias para prevenir o branqueamento antes da imagiologia, e permitem fatias a incubar durante 45 minutos - 1 hora. </li><li> Retire as fatias a câmara de retenção aquecida para 10-15 minutos para lavar o excesso de material. </li><li> Siga os passos 4.1.1 a 4.1.6 para preparação de estimular e imagem da fatia colliculo-tálamo-cortical. </li></ol></li><li> Aquisição de imagem de cálcio. <ol><li> Coletar imagens em 10 Hz (utilizando uma objectiva de imersão 20X de água) por 25 segundos enquanto estimular eletricamente (cada estímulo consiste de um pulso de 2 ms) tecido a 0,2 Hz cinco vezes enquanto iluminando o tecido com 365 nm de luz e capturando fluorescência acima de 510 nm. </li&gt; <li> Exportar imagens para Matlab e usar o programa escrito costume disponíveis em materiais complementares, para análise espectral de potência das imagens em 0.2 Hz. A imagem resultante mostrará células activas. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li>
<li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+%28barrel%29+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li>
<li>MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+thalamocortical+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+meth%22%5BJournal%5D)">A visual thalamocortical slice.</a> Nat meth. 3, 129-134 (2006).</li>
<li>Crabtree, J. W., Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+intrathalamic+pathways+allowing+modality-related+and+cross-modality+switching+in+the+dorsal+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus.</a> J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).</li>
<li>McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attentional+Modulation+of+Thalamic+Reticular+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons.</a> J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).</li>
<li>Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attentional+Orienting+Is+Impaired+by+Unilateral+Lesions+of+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat.</a> J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).</li>
<li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li>
<li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Paradigm+for+Optical+Imaging%3A+Temporally+Encoded+Maps+of+Intrinsic+Signal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal.</a> Neuron. 38, 529-545 (2003).</li>
<li>Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+cortical+inhibition+in+an+aging+mouse+model+of+chronic+tinnitus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus.</a> J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li>
<li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse%3A+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo descreve melhorias em relação a uma fatia cerebral colículo-tálamo-cortical descrita anteriormente em camundongos p12-20 para estudar o fluxo de informações no sistema auditivo1. Este método tem uma série de vantagens sobre outras preparações semelhantes de fatias cerebrais, mantendo conexões entre mais áreas cerebrais em uma única fatia, o que dá aos investigadores novas ferramentas para entender a interação e interação entre os núcleos auditivos no prosencéfalo. Houve algumas modificações impo...

No sistema auditivo, embora não haja processamento substancial de informação entre a periferia sensorial e colículo inferior, existe uma considerável processamento adicional antes que ela atinja o córtex auditivo. Sabemos muito pouco sobre como esse processamento é feito e, portanto, pouco sobre como essa transformação permite que o cérebro para interpretar informação sensorial recebida. Com a excepção do olfacto, cada um dos sentidos tem uma estrutura muito semelhante com sinais periféricos inicialmente ser retransmitido com alta fidelidade, que diminui à medida que o sinal sobe para o córtex. O córtex, em seguida, envia projecções para as estruturas inferiores para modular ainda mais a informação recebida. Este sistema complexo tem sido estudada numa variedade de maneiras in vivo, bem como em um número de preparações in vitro. No primeiro caso, todas as ligações estão intactas, permitindo que o pesquisador sondar qualquer conjunto de ligações, enquanto se controla a entrada sensorial e medindosaída em qualquer área. Com essa abordagem, há pouco ou nenhum controlo da grande variedade de outros factores de produção, incluindo outras entradas sensoriais, excitação e atenção, dando origem a uma produção intensamente complexo. In vitro, fatias de cérebro foram cortados para capturar um único set de projecções, ou duas áreas do cérebro ligadas, que permitem que pesquisadores para estimular e avaliar vários aferentes ou áreas do cérebro. Estes são muitas vezes fatias quer talamocorticais ou tectothalamic onde quer a entrada para o tálamo ou no tálamo e sua saída para o córtex são preservados 2-5. Estas preparações permitem uma ampla variedade de manipulações farmacológicas, elétricas e optogenética. No entanto, com apenas duas regiões do cérebro, que avaliam principalmente à transferência de informações e falta a capacidade de avaliar a transformação de informação à medida que passa através do tálamo. Além disso, a projecção reticulo-tálamo, o que pode jogar um papel na modulação da atenção é 6-9 PRESENT nesta fatia. Aqui demonstramos melhorias sobre nossa preparação anterior 1, que permite o controle investigador de várias entradas para o tálamo para dar uma perspectiva única de como os portões tálamo e filtros de informação. Nós casal Esta preparação fatia romance com imagens flavoprotein autofluorescência para avaliar a conectividade fatia e análise de ativação de grande escala, a imagem latente de cálcio no tálamo para análise da população neuronal, e gravação de uma única célula para medir o impacto das várias entradas em um nível única célula. Para auxiliar na manutenção destas ligações generalizadas nós também têm desenvolvido uma série de modificações do âncora fatia normal (aka &quot;harpa&quot;) para a realização da fatia do cérebro no lugar e uma ponte para elevar a fatia para maior perfusão. A harpa é projetado em forma de ferradura modificado para cercar a fatia e permitir a pontos de fixação personalizáveis ​​para as cordas da harpa. Três cordas sãoligado de tal modo que i) um encontra-se horizontalmente ao longo do bordo medial da fatia, ii) estende-se a partir da extremidade caudal do IC para a extremidade caudal do CA e iii) estende-se na diagonal a partir do bordo medial da fatia para uma área rostral à AC (ver Figura 1A). Pequenos recortes no quadro para colagem (com cola de cianoacrilato) de harpas cordas para permitir uma diminuição da quantidade de pressão sobre a fatia para ajudar a manter a integridade da fatia (ver Figura 1B). Ao usar a impressão tridimensional, somos capazes de harpas de design personalizado com as nossas especificações únicas, bem como pontes que permitem o fluxo ideal de artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) acima e abaixo do tecido. Isso também mantém grandes áreas para a luz para penetrar no tecido para patch-clamp eletrofisiologia.

<table><tbody><tr>Solução <td></td><td></td><td>de corte com alto teor de sacarose</td><td>em mM: 206 sacarose, 10,0 MgCl2, 11,0 glicose, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0,5 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Baixo teor de cálcio aCSF</td><td></td><td></td><td>em mM: 126 NaCl, 3,0 MgCl2, 10,0 glicose, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1,0 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td>em mM: 126 NaCl, 2,0 MgCl2, 10,0 glicose, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2,0 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Isolador de estímulo</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Lote: 1572C502</td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td>Lote: 144912</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Technologies</td><td>P3000MP</td><td>Lote: 1499369</td></tr><tr><td>Prato de cultura grande</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-13</td><td>Prato de cultura pequeno de 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Prato de cultura</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 x10 mm</td></tr><tr><td>Membrana de cultura elevada</td><td>Millicell</td><td>PICMORG50</td><td>Usado para manter a perfusão de fluido oxigenado em ambos os lados da fatia.</td></tr><tr><td>Cubo de fluorescência de imagem de flavoproteína</td><td>Olympus</td><td>UMNIB</td><td>470&ndash; 490 nm de excitação, 505 nm dicróico, 515 nm de emissão de longa duração.&nbsp; Descobrimos que praticamente qualquer cubo de filtro de proteína de fluorescência verde funcionará aqui.</td></tr><tr><td>Cubo de fluorescência de imagem de cálcio</td><td>Omega Optical</td><td>BX-18</td><td>XF1005 saída de 365 nm, XF2001 400 nm dicróico, XF3080 510 nm de emissão</td></tr><tr><td>Ágar para bloqueio do cérebro</td><td></td><td></td><td>3% em peso na água</td></tr><tr><td>Viper si Stereo Lithography Apparatus</td><td>3D Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a modificação de um colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato fatia, incorporando a impressão 3-d da câmara components and imaging optical multi-escala

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

A capacidade do cérebro de processar informações sensoriais depende de conjuntos de projeções ascendentes e descendentes. Até recentemente, a única maneira de estudar esses dois sistemas e como eles interagem era com o uso de preparações in vivo. Grandes avanços foram feitos com fatias cerebrais agudas contendo as vias tálamo-corticais e córtico-talâmicas nos sistemas somatossensorial, visual e auditivo. Com refinamentos importantes em nossa recente modificação do corte tálamo-cortical auditivo1, somos capazes de capturar de forma mais confiável as projeções entre a maioria das principais estruturas auditivas do mesencéfalo e do prosencéfalo: o colículo inferior (CI), o corpo geniculado medial (MGB), o núcleo reticular talâmico (TRN) e o córtex auditivo (AC). Com partes de todas essas conexões mantidas, somos capazes de responder a perguntas detalhadas que complementam as perguntas que podem ser respondidas com preparações in vivo. O uso de imagens de autofluorescência de flavoproteínas nos permite avaliar rapidamente a conectividade em qualquer fatia e orientar o experimento subsequente. Usando essa fatia em conjunto com técnicas de gravação e imagem, agora estamos mais bem equipados para entender como o processamento de informações ocorre em cada ponto do prosencéfalo auditivo à medida que a informação sobe para o córtex e o impacto da modulação cortical descendente. A impressão 3D para construir componentes da câmara da fatia permite perfusão frente e verso e amplo acesso a redes dentro da fatia e mantém as conexões generalizadas essenciais para a utilização total dessa preparação.

Um exemplo de fatia de cérebro de ratinho colliculo-talamocortical obtido em P15 rato é mostrada na Figura 2. A fatia ideal irá conter os quatro principais estruturas auditivas do mesencéfalo e do prosencéfalo IC, MGB, TRN, e AC, que são activados quando o IC é estimulada (Figura 2A). Usando a análise de Fourier, o poder espectral é medido na frequência de estimulação elétrica, com regiões do cérebro ligadas mostrando atividade que é periódica e arrastado na freqüência ...

O uso de vários ângulos para cortar o cérebro do rato filhote, podemos melhorar em cima de uma fatia cerebral aguda anteriormente descrito que captura as conexões entre a maioria dos principais mesencéfalo e prosencéfalo estruturas auditivas.

A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar o corte cortical do tálamo Calot contendo quatro estruturas auditivas principais: o colículo inferior, o tálamo auditivo, a porção auditiva do núcleo reticular talâmico e o córtex auditivo. Isso é realizado primeiramente removendo o cérebro do camundongo. O segundo passo é bloquear o cérebro em preparação para o corte em fatias.Em seguida, corte o cérebro para obter fatias contendo a conexão tálamo-cortical de Calot. O passo final é utilizar a imagem de flavoproteína para avaliar a conectividade. Em última análise, a fatia de cérebro contendo a conexão tálamo-cortical pode ser usada para uma variedade de experimentos para melhor compreender o processamento de informações nas regiões auditivas do mesencéfalo e do diencéfalo. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos para bloquear o cérebro antes do corte são difíceis de aprender, pois exigem um corte duplo angular complexo, essencial para obter projeções intactas.Para demonstrar a técnica, estará BJ Slater, um estudante de pós-graduação no meu laboratório. Para preparar o estágio de corte para o fatiamento, corte um pequeno pedaço de agar a 3%, com aproximadamente um centímetro cúbico, para ser usado como suporte traseiro para o cérebro, e outro pedaço de 1,5 centímetro por 1,5 milímetro por três milímetros para ser usado como elevação para sustentar o colículo inferior. Em seguida, cole o suporte traseiro no estágio com adesivo de cianoacrilato e, depois, cole a elevação no lado direito do suporte traseiro, de modo que formem um ângulo de 80 graus. Em uma lâmina marcada com duas linhas a 90 graus e uma linha diagonal a 17 graus, do canto superior esquerdo ao inferior direito, posicione o cérebro com a face dorsal voltada para cima no ponto de interseção das duas linhas. Usando uma lâmina de barbear, remova dois a quatro milímetros da extremidade rostral do cérebro para criar uma superfície plana.Em seguida, posicione o cérebro com o lado coddle voltado para cima sobre a superfície plana recém-criada. Alinhe a superfície dorsal do cérebro com uma linha horizontal e a linha média do cérebro com uma linha vertical marcada na lâmina. Depois, alinhe a lâmina de barbear com uma linha de 17 graus.Incline a lâmina em um ângulo de 30 graus e remova aproximadamente três milímetros do córtex direito com um corte diagonal duplo para montar o cérebro na plataforma do vibrátomo. Coloque um pequeno pedaço de papel de filtro no lado ventral do cérebro, de modo que a dimensão maior fique perpendicular à linha média. Aplique cuidadosamente uma pequena quantidade de adesivo de cianoacrilato na área anterior ao batente e à esquerda da saliência.Posteriormente, posicione o lado do cérebro cortado diagonalmente sobre a cola de modo que a parte coddle do cérebro e o cérebro posterior sejam apoiados sobre o saliente, e o lado direito do cérebro fique encostado no batente traseiro. Neste procedimento, coloque rapidamente o estágio de corte no vibrátomo e preencha o estágio com solução de corte. Em seguida, alinhe a lâmina com o topo do cérebro.Remova um a 1,5 milímetro do topo do cérebro. Em seguida, corte e remova mais fatias de 300 a 500 micrômetros enquanto avança mais profundamente. Quando o colículo inferior, o corpo medial ate e o núcleo lateral ICT estiverem todos visíveis, o giro denteado deverá aparecer com formato de C e a estrutura deverá estar alinhada.Obtenha cerca de duas fatias de 600 micrômetros. Essas são as fatias corticais carotídeas. Em seguida, transfira-as para a câmara de espera a 32 graus Celsius.Para adquirir a imagem de autofluorescência de flavoproteínas, colete as imagens a quatro hertz durante 105 segundos. Ilumine o tecido com luz azul de 470 a 490 nanômetros e capture acima de 515 nanômetros, garantindo que a imagem não fique nem muito escura nem superexposta. Em seguida, use estimulação elétrica para ativar o tecido e adquirir uma imagem de cálcio.Colete imagens a 10 hertz durante 25 segundos. Ilumine o tecido com luz de 365 nanômetros e capture a fluorescência acima de 510 nanômetros. Novamente, certifique-se de que a imagem não esteja nem muito escura nem superexposta.Em seguida, utilize estimulação elétrica para ativar as células. Esta imagem mostra a confirmação da conexão cortico-carotídea no corte cerebral por Autofluorescência de Flavoproteína. A estimulação elétrica aplicada a 0,05 hertz no colículo inferior foi registrada a quatro hertz e processada para mostrar a potência correspondente àquela estimulação.Frequência, o tálamo auditivo, tálamo, reticular, núcleo e córtex auditivo são ativados sinapticamente. Aqui está uma fatia desconectada. A estimulação elétrica do colículo inferior com ativação foi observada apenas no tálamo auditivo.O caminho inteiro não foi capturado, provavelmente porque um dos cortes estava ligeiramente fora do plano. Com projeções corticais de Alam. Esta imagem mostra ativação atípica da córtex auditiva.A estimulação elétrica do colículo inferior ativou a córtex auditiva sem sinal visível. No tálamo auditivo, é provável que o tálamo ainda tenha sido ativado, mas não estava na superfície da imagem. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter uma fatia cortical tálamo-AAL e como avaliar sua conectividade.

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Este vídeo demonstra a gravação da atividade neural do cérebro através de uma janela óptica em camundongos transgênicos. Os camundongos expressam uma proteína fluorescente que permite a detecção de atividades neurais. Uma pequena parte do crânio é cuidadosamente removida para instalar uma janela óptica, e o crânio é então coberto com cimento preto para bloquear a luz antes da imagem.

Instalação de janelas ópticas no cérebro de camundongos transgênicos para imagens de atividades neurais

Neste artigo vamos descrever o procedimento experimental completo para reconstruir, com alta resolução, a anatomia do cérebro multa de cérebros fluorescente etiquetado do mouse. O protocolo descrito inclui preparação de amostras e limpeza, espécime de montagem para a imagem latente, os dados de pós-processamento e visualização multi-escala.

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Usando exames de ressonância magnética (humana), software de imagem 3D e análise imuno-histológica, documentamos alterações nos ventrículos laterais do cérebro. O mapeamento longitudinal 3D das alterações do volume do ventrículo lateral e a caracterização das alterações celulares periventriculares que ocorrem no cérebro humano devido ao envelhecimento ou doença são então modelados em camundongos.

Modelagem 3D do lateral ventrículos e histológica Caracterização do Tecido Periventricular em humanos e mouse

Aqui, apresentamos um procedimento para a realização de imagens de Ca 2 + em larga escala com resolução celular em múltiplas camadas corticais em camundongos que se movem livremente. Centenas de células ativas podem ser observadas simultaneamente usando um microscópio em miniatura montado na cabeça acoplado com uma sonda de prisma implantada.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Aprenda a preparar fatias colículo-tálamo-corticais do cérebro de camundongo preservando conexões auditivas intactas. Este método utiliza corte duplo angular e imagem de flavoproteína para estudar processamento auditivo.

A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala (Vídeo) | JoVE Journal

A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

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