Um Sistema Organotípicas alta taxa de transferência para Caracterização de Drogas de sensibilidade de células de mieloma múltiplo primárias
15 de julho de 2015
Descrevemos um ensaio de sensibilidade a medicamentos de alto rendimento para células primárias de mieloma múltiplo. Consiste em uma reconstrução do microambiente da medula óssea (incluindo matriz extracelular e estroma) em placas de múltiplos poços e um método não invasivo para quantificação longitudinal da viabilidade celular.
O objetivo geral deste procedimento é quantificar a quimiosensibilidade de células primárias de mieloma múltiplo a um painel de agentes quimioterápicos. Isso é realizado primeiramente misturando células de mieloma múltiplo isoladas de aspirado fresco de medula óssea com estroma derivado do paciente e colágeno pré-cultivado. Na segunda etapa, a mistura CEL é semada em uma placa de múltiplas cavidades.
As células são então tratadas com os agentes quimioterápicos de interesse, e a placa é transferida para o incubador de um microscópio com estágio motorizado para a realização de imagens sequenciais das células durante um período de incubação de 96 horas. Em última análise, um algoritmo de análise de imagem digital pode ser utilizado para gerar curvas de viabilidade para cada fármaco e concentração. As principais vantagens desta técnica em relação aos ensaios de viabilidade de ponto final existentes são a possibilidade de testar vários agentes quimioterápicos contra um único espécime do paciente e a capacidade de medir longitudinalmente a viabilidade das células do paciente ao longo de vários dias, sem a necessidade de separar as células do estroma ou da matriz.
As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de tumores hematopoiéticos, pois teoricamente pode ser utilizada para prever a resposta clínica a regimes específicos de quimioterapia. Tivemos pela primeira vez a ideia deste protocolo ao percebermos que substituir nossos lâminas microfluídicas originais por placas de múltiplos poços reduziria significativamente o custo e o tempo necessários para concluir o experimento. Para preparar culturas co-culturas primárias de mieloma múltiplo e células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea com uma pipeta multicanal, comece suspendendo as células numa concentração seis vezes superior à concentração final em RPMI 1640.
Em seguida, misture 50 microlitros de cada tipo celular com colágeno tipo I recém-preparado até um volume final de 300 microlitros. Em seguida, use uma pipeta multicanal para dispensar manualmente oito microlitros da mistura de células e matriz no centro de cada poço de uma placa de 384 poços e centrifugue a placa para concentrar todas as células no mesmo plano focal.
Após centrifugar, incubar as placas em condições de cultura celular por uma hora para permitir a polimerização do gel. Em seguida, adicionar 80 microlitros de meio de crescimento suplementado a cada poço e incubar a placa durante a noite para permitir que o estroma adira ao fundo da placa. Para preparar culturas co-culturas de estroma de mieloma múltiplo com uma pipeta robótica, comece suspendendo 300 microlitros de células de mieloma múltiplo positivas para CD138 e 300 microlitros de células estromais em RPMI 1640, meio na densidade final desejada multiplicada por seis, conforme acabou de ser demonstrado.
Em seguida, misture ambos os tipos celulares em um tubo de 1,5 mililitro rotulado como CD138 positivo e coloque o tubo em uma incubadora de cultura celular. A seguir, suspenda 60 microlitros da linhagem celular de mieloma múltiplo apropriada e 60 microlitros das células estromais em RPMI 1640, meio a seis vezes a densidade final desejada, e misture ambos os tipos celulares em um tubo de 1,5 mililitro rotulado como segunda linhagem celular e incube também a 37 graus Celsius. No pipetador robótico, carregue o arquivo de script de semeadura celular.
Em seguida, coloque uma caixa de ponteiras de pipeta de 200 microlitros na estação A, uma placa de microtitulação na estação B e uma placa estéril de 84 poços na estação E do robô. Depois, misture a suspensão de células positivas para CD138 com o tubo do meio pré-misturado de CD138 recém-preparado e transfira 1,5 mililitro da solução celular resultante para o poço número um da placa de microtitulação.
Coloque o restante das células no gelo e inicie o programa. O robô semeará os primeiros 176 poços da placa de 384 poços e depois pausará. Utilize este tempo para transferir as células CD138 positivas restantes para o poço número dois da placa de microtitulação e retome o programa.
O robô verá os 144 poços restantes da placa e pausará novamente. Agora, misture as células do tubo da linhagem celular com um tubo de pré-mistura recém-preparada da linhagem celular e transfira o conteúdo para o poço número três da placa de microtitulação. Em seguida, reinicie o programa novamente, permitindo que o robô semeie os 64 poços restantes da placa de 3 84 poços.
Quando o último poço tiver sido semeado, centrifugue as células e transfira as culturas co para o incubador de cultivo celular para polimerização do colágeno. Após uma hora, carregue o script da camada de meio no robô e coloque uma caixa de ponteiras de 120 microlitros na estação A, um reservatório de reagentes com 31 mililitros de meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal, plasma de paciente e antibióticos na estação B e a placa CED 3 de 84 poços na estação E. Em seguida, execute o programa. O robô irá transferir 81 microlitros do meio suplementado para cada poço.
Quando o robô terminar, retorne as células ao incubador para permitir que o estroma adira ao substrato durante a noite. Para tratar as células semeadas com a droga de interesse, primeiro carregue o script da placa de drogas na camada de meio na interface do usuário do pipetador robótico. Em seguida, coloque uma caixa de ponteiras de 120 microlitros na estação A, um reservatório com 21 mililitros de RPMI 1640 suplementado com plasma de pacientes FPS e antibióticos na estação B e uma placa vazia de 84 poços na estação E; execute o programa, e o pipetador robótico adicionará 30 microlitros de meio a todos os poços.
A placa de 3 84 poços. Em seguida, seguindo o modelo, adicione 200 microlitros de fármaco na concentração máxima 20 vezes maior a cada poço de uma placa de microtitulação para o controle. No poço, adicione meio suplementado com plasma de pacientes FPS e antibióticos.
Em seguida, coloque uma caixa de ponteiras de micropipeta de 120 microlitros na estação A, a placa de microtitulação com fármacos na estação B e uma placa de 3 84 poços com meio na estação C e carregue o programa da placa de fármacos. O pipetador robótico realizará uma diluição seriada de um para três, conforme ilustrado nesta figura. Agora, coloque uma caixa nova de ponteiras de micropipeta de 120 microlitros na estação A, a placa de 3 84 poços com fármaco diluído na estação B e a placa de 3 84 poços com células semeadas na estação C e execute o programa de adição de fármaco.
O pipetador robótico irá transferir oito microlitros de fármaco de cada poço da placa de fármaco para o poço correspondente na placa de células. Após o último poço ter sido tratado, transfira imediatamente a placa de células para o incubador do microscópio digital. Em seguida, para imagens das células, limpe o interior do incubador de bancada com um lenço umedecido com etanol e troque cuidadosamente a tampa da placa pela tampa do incubador.
Em seguida, siga os passos do software para adicionar as referências anatômicas das regiões de interesse que serão imageadas sucessivamente durante o experimento. Por fim, utilizando uma objetiva de aumento de 5x ou 10x, coloque as células em foco até que as células de mieloma múltiplo apareçam como discos brilhantes cercados por um anel escuro e as células estromais fiquem mal visíveis. Neste experimento, as células vivas de mieloma múltiplo foram pseudocoloridas em verde, com pouco ou nenhum sinal verde observado nas células estromais e nas células endoteliais da veia umbilical humana ao final do experimento, na maior concentração do fármaco, quando todas as células de mieloma múltiplo estavam mortas.
O software do robô foi então utilizado para iniciar a perda gradual de viabilidade resultante da exposição às diferentes concentrações de fármaco ao longo do tempo. É importante observar cuidadosamente todas as poças semeadas antes de iniciar o processo de aquisição de imagens, pois artefatos podem induzir o software de análise de imagens a erros e levar a resultados falsos. Por exemplo, aqui se mostra o resultado de uma densidade excessiva de células estromais ou de muito tempo entre a tripsinização e a semeadura, o que resulta na formação de agregados celulares, como visto nesta imagem.
Se as linhagens celulares forem semeadas em duas densidades elevadas, elas formarão colônias à medida que se replicam, reduzindo a precisão do algoritmo de análise de imagem digital, pois torna-se cada vez mais difícil distinguir uma célula da outra. Aqui, um número insuficiente de células de mieloma múltiplo foi semeado quando a quantidade de células de mieloma múltiplo obtidas do aspirado de medula óssea está abaixo de 500.000. É necessário determinar o volume morto do tubo utilizado antes de semear as células e incluir esse volume nos cálculos de diluição. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas a três horas.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter o meio pré-misturado contendo o colágeno em gelo para prevenir a polimerização antes que as células estejam prontas. Isso também ajudou a explorar como a heterogeneidade da quimiosensibilidade da carga tumoral pode determinar a profundidade e a duração da resposta do paciente.
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Visão Geral
Este artigo descreve um ensaio de sensibilidade a fármacos de alto rendimento projetado para células primárias de mieloma múltiplo. O método envolve a reconstrução do microambiente da medula óssea e permite a quantificação longitudinal não invasiva da viabilidade celular.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Biologia Celular
Contexto
- O mieloma múltiplo é um tipo de câncer sanguíneo que afeta as células plasmáticas.
- A avaliação da sensibilidade aos medicamentos é fundamental para um tratamento eficaz.
- Os ensaios tradicionais frequentemente exigem a separação das células, o que limita sua utilidade.
- Este estudo tem como objetivo aprimorar a avaliação das respostas medicamentosas em um ambiente fisiologicamente mais relevante.
Objetivo do Estudo
- Quantificar a quimiosensibilidade de células primárias de mieloma múltiplo.
- Avaliar a eficácia de diversos agentes quimioterápicos.
- Permitir o monitoramento longitudinal da viabilidade celular sem perturbar o microambiente.
Métodos Utilizados
- Isolamento de células de mieloma múltiplo a partir de aspirado fresco de medula óssea.
- Mistura de células com estroma derivado do paciente e colágeno.
- Plaqueamento da mistura celular em placas de múltiplos poços.
- Imageamento sequencial das células durante um período de incubação de 96 horas usando um microscópio com estágio motorizado.
Resultados Principais
- Foram geradas curvas de viabilidade para cada fármaco e concentração.
- O método permite testar múltiplos agentes contra uma única amostra de paciente.
- Medições longitudinais da viabilidade celular foram obtidas com sucesso.
- A técnica demonstra vantagens em comparação com ensaios tradicionais de ponto final.
Conclusões
- Este ensaio de alto rendimento fornece uma avaliação mais precisa da sensibilidade aos fármacos.
- Preserva o microambiente da medula óssea, aumentando a relevância para as condições dos pacientes.
- O método pode facilitar estratégias de tratamento personalizadas para o mieloma múltiplo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este sistema organotípico de alto rendimento permite o perfil de sensibilidade a fármacos longitudinal e com preservação do microambiente em células primárias de mieloma múltiplo, abordando uma lacuna crítica nos modelos pré-clínicos que não conseguem recapitular as interações tumor-estroma. Ao gerar curvas quantitativas de viabilidade e métricas de heterogeneidade a partir de espécimes derivados de pacientes, o método apoia a desmistificação mecanicista e a confiança preditiva na identificação de compostos líderes. Ele atua como uma ponte translacional entre a descoberta inicial e a validação pré-clínica, orientando a priorização ajustada ao risco de regimes terapêuticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição de alterações na viabilidade induzidas por fármacos em células tumorais primárias dentro de um nicho de medula óssea reconstruído.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio de leituras de quimiossusceptibilidade dependentes de dose e tempo, sem separação do estroma.
- Valor Preditivo: Quantifica a heterogeneidade tumoral por meio de modelagem de subpopulações, orientando a triagem de portfólios com base na diversidade de respostas clonais aos fármacos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas de mieloma validados e co-cultivados com estroma para triagem reprodutível de compostos frente a múltiplos agentes.
- Valor Operacional: Padroniza a prontidão do ensaio por meio do formato de câmara microfluídica em placas de 384 poços, permitindo perfilagem de fármacos escalonável baseada em placas.
- Valor Técnico: Gera saídas longitudinais de viabilidade por meio de análise digital de imagens, permitindo avaliação cinética dos efeitos dos fármacos ao longo de 96 horas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para a doença ao preservar células-tronco mesenquimais derivadas de pacientes e matriz extracelular, aumentando o valor preditivo pré-clínico.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade desde a descoberta até o trabalho pré-clínico, fornecendo dados farmacodinâmicos longitudinais sem interromper o microambiente.
- Mitigação de Riscos: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco ao simular regimes terapêuticos e estimar a resposta clínica a partir de modelos personalizados para o paciente.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao permitir testes de hipóteses na Fase Inicial de Descoberta, preparação de ensaios na Triagem e modelagem preditiva na Pesquisa Translacional, aproveitando o contexto microambiental específico do paciente.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos ao associar a exposição ao fármaco a alterações na viabilidade de células tumorais aderentes ao estroma.
- Triagem: Oferece padronização de ensaios e leituras cinéticas quantitativas, permitindo avaliação confiável de compostos em diferentes concentrações e pontos temporais.
- Análises: Fornece curvas de viabilidade e parâmetros de heterogeneidade como saídas mensuráveis para comparação dos efeitos de fármacos e da dinâmica de subpopulações tumorais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da simulação de regimes terapêuticos personalizados para o paciente e da estimativa de resposta clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para perfis de fármacos em células primárias, adaptável ao mieloma múltiplo e potencialmente a outros tumores hematopoiéticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao capturar respostas medicamentosas mediadas pelo microambiente e reduzir a ambiguidade mecanicista em modelos de tumores primários.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da padronização da preparação da matriz estromal-tumoral e de fluxos de trabalho automatizados de imagem.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao permitir o acompanhamento longitudinal da viabilidade, reduzindo a dependência de ensaios terminais que não detectam resistência adaptativa.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao quantificar a heterogeneidade da quimiosensibilidade entre pacientes e intra-tumoral para estratégias de dosagem personalizada.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em isolamento de células primárias, co-cultivo estromal e manipulação de matriz extracelular para manter a fidelidade do microambiente.
- Depende de microscopia motorizada, software de análise de imagens digitais e infraestrutura de pipetagem robótica para o rastreamento longitudinal e dispensação de reagentes.
- Necessita padronização entre equipes quanto à concentração de colágeno, proporções de células estromais e densidade de semeadura para garantir consistência do ensaio entre amostras de pacientes.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a outros tipos de tumores, já que a composição do microambiente (por exemplo, matriz, parceiros estromais) deve ser reengenheirada para relevância da doença.
- Inclui limitações práticas, como quantidade mínima viável de células de entrada (~500.000 células de mieloma) e sensibilidade ao crescimento excessivo estromal, o que pode dificultar a análise de imagens se não for otimizado.
