Name: Espalhando superfície e Immunostaining de cromossomas da levedura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprenda a espalhar cromossomas de levedura e realizar imunocoloração para visualizar proteínas ligadas aos cromossomas por microscopia de fluorescência. Este método melhora a análise de biologia celular.

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Este trabalho foi apoiado pelo GM50936 de concessão do NIH ao DKB.

NOTA: Alguns passos do protocolo a seguir exigem a trabalhar em um exaustor limpa. Além disso, o método requer um microscópio de dissecção de levedura tétrade equipado com uma objectiva 10X de longa distância de trabalho para monitorizar spheroplasting. O microscópio deve ser configurada na capa antes do tempo. Retire o braço micromanipulador e suporte da placa do âmbito de aplicação e colocar esses itens em um local seguro longe da área de trabalho. 1. Preparação de Esferoplastos <ol><li> Levedura crescer sob condições desejadas. Use cerca de 2 x 10 8 células para cada amostra, por exemplo, 4 ml de uma cultura em OD600 1,4 = 5 x 10 7 células / ml. Embora o processamento imediato de amostras pode ser preferível em alguns casos, para a maioria das aplicações, alíquotas de células pode ser armazenada em gelo durante até 8 horas antes de ser processado. </li><li> Transferir suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugação numa centrífuga clínica na posição 5 (2345 rpm / 857,5 xg) durante 3 min para sedimentar as células. </li&gt; <li> Decantar o meio tomando cuidado para não perder as células do sedimento. Suavemente ressuspender as células em 1 ml de tampão ZK e, em seguida, adicionar 40 ul de 1 M de ditiotreitol (DTT). Incubar 2 min com mistura suave. Células de pellets como antes (veja o passo 1.2). </li><li> Suspenda as pelotas em tampão ZK 1 ml. Adicionam-se 5 ul de uma solução preparada de fresco de 100T zimoliase que tenha sido cuidadosamente misturado. Incubar durante 20-30 min a 30 ° C para remover a parede celular e produzir esferoplastos. </li><li> Dosear uma gota de 10 ul de suspensão de células numa lâmina de microscópio para determinar se spheroplasting é completa. Células vistos sob o microscópio de dissecação, sem uma lamela. As células devem aparecer inchado e volta em vez de ligeiramente oblonga e deve lisar após a adição de 20 l de água. Se as células não conseguem lisar, devolver a amostra a 30 ° C e re-ensaio a cada 10 minutos até que a água de lise induzida é facilmente observado. Células de pellets como antes (veja o passo 1.2). </li><li> Volte a suspender suavemente e lavar pellet celular in 2,5 ml MES / tampão sorbitol frio. Células de pellets como antes (veja o passo 1.2). Delicadamente ressuspender pellet celular em 300-400 ul frio MES / tampão sorbitol. As células podem ser mantidas em gelo, nesta fase, por várias horas. </li></ol> 2. Chromosome Espalhando NOTA: As superfícies de vidro sobre o qual os cromossomos serão distribuídos-quer slides ou lamelas-deve ser preparado antes do tempo. Cada um dos slides ou lamela deve ser submerso em água, seguida de EtOH, depois deixou-se secar, e polido com papel para lentes. Se cromossomos serão distribuídos em lamelas, a lamela deve ser afixada a um slide com fita adesiva ou cimento de borracha. A menos que indicado de outra forma, o restante do protocolo irá descrever espalhamento de cada um slide ou lamela <ol><li> Usando um pipetador P20, pipeta 20 ul de suspensão de células sobre a superfície de uma lâmina limpa. </li><li> Usando uma pipeta P200, adicionar 40 ul da PFA / solução de sacarose 3% e misture delicadamente o solution por &quot;rodar&quot; o slide com a mão até que as linhas Schlieren desaparecer. Coloque a corrediça sob o microscópio e confirmar que as células estão em foco. A solução PFA deve ser recém-preparado no exaustor de fumos no dia da utilização. NOTA: Se a proteína de interesse não foi examinado pelo método anteriormente, é aconselhável preparar lâminas adicionais utilizando soluções que contêm 2 e 4% PFA para determinar se a retenção da proteína é sensível às condições de fixação. Uma solução / sacarose PFA a 4% é utilizado nos casos em que é desejável para visualizar microtúbulos tubulina associados. A desvantagem do fixador concentração mais elevada é que os cromossomas será &quot;underspread&quot;, 2% de PFA também tende a produzir cromossomas &quot;underspread&quot;. </li><li> Usando uma pipeta P200, adicionar 80 ul de 1% LIPSOL, redemoinho como antes para misturar soluções tão completamente quanto possível, iniciar um temporizador. Se LIPSOL não está disponível, 80 ul de 1% NP40, ou 80 ul de dH2O pode sersubstituído (ver resultados representativos, Figura 2). </li><li> Assista as células com cuidado e agite gentilmente o slide a cada 15 segundos. Quando cerca de 80% das células foram lisadas (desaparecido) parar o temporizador, retire imediatamente a lâmina do microscópio, adicionar 80 ul de PFA / solução de sacarose, e agite para misturar. A lise deve ocorrer a partir de entre 30 e 90 segundos após o início do temporizador. NOTA: Se várias lâminas mostram lise em aproximadamente o mesmo tempo, pode-se omitir eventualmente monitorização de microscópio, para o restante das lâminas e simplesmente cuidadosamente o tempo entre o período de adição de LIPSOL e adição da aliquota final do fixador. No entanto, este atalho só é confiável quando se prepara vários slides a partir da mesma amostra. É melhor controlar a lise de cada amostra quando microscopicamente diferentes lâminas são preparadas a partir de amostras tomadas a diferentes tempos ou de diferentes culturas. </li><li> Coloque o slide em uma superfície plana e limpa e espalhar o líquido em todo o surfac unfrostede da lâmina utilizando o lado de um limpa, pipeta descartável Pasto mantido abaixo do menisco de &quot;poça&quot;, mas acima da superfície da própria corrediça, isto é. não &quot;acumular&quot; a superfície da lâmina com a pipeta. Não reutilize pipeta em slides diferentes para evitar a contaminação das amostras. </li><li> Deixe os slides para secar durante a noite na capela. Componentes nucleares insolúveis vai resolver sobre a superfície da lâmina e se ligar a ele. Para grandes experimentos, o planejamento do uso do espaço para a etapa de secagem é importante. </li><li> Uma vez secos, os melhores resultados são obtidos por progredir para a fase de imunocoloração no mesmo dia. No entanto, a solução de sacarose a seco incorpora os cromossomas espalhados numa &quot;mel&quot; que permite a congelação de amostras: As lâminas podem ser transferidos para uma caixa de corrediça de plástico e armazenado a -20 ° C durante anos. </li></ol> 3. Immunostaining <ol><li> Dip slides em 0,2% Photo-Flo por 30 s. para remover o mel. Lâminas Lean Onuma borda, com a borda que descansa em uma toalha de papel, para remover residual Photo-Flo. </li><li> Dip slides em 1x TBS por 5 minutos para lavar. Retire o excesso de líquido, inclinando-se lâminas em uma borda, mas não deixá-los secar. </li><li> Lay lâminas fosco lado de cima, pipeta 300 mL TBS / BSA para o slide em toda a parte unfrosted do slide. </li><li> Incubar numa câmara húmida à temperatura ambiente durante 15 min. (Grande recipiente de plástico forrado com água saturada toalhas de papel debaixo de uma placa de metal ou de plástico caixa de lâminas perfuradas com toalhas de papel saturados). </li><li> Escorra slides, descansando uma margem mais curta do slide em uma toalha de papel e inclinando-se o slide contra um apoio adequado (tal como um rack de tubo de ensaio). Não permita que a superfície para secar. </li><li> Imediatamente aplicar 80 ul de tampão de TBS / BSA contendo uma diluição adequada de anticorpo primário. Se o anticorpo é limitativo, utilizar 40 ul e uma lamela de 22 mm x 22. Para soro de coelho em bruto, este é, tipicamente, entre uma diluição de 1/50 e 1/500. NOTA:Realizar titulações para novas preparações de anticorpos. A preparação mais diluído que gera alto sinal acima do fundo é escolhido. Para controlar o nível de coloração de fundo, os núcleos devem ser preparados a partir da estirpe mutante de deleção adequada e / ou lâminas de duplicados devem ser coradas com soro pré-imune. </li><li> Coloque um polido 22 x 50 mm lamela na lâmina evitar bolhas. Faça isso, mantendo a lamela entre o polegar eo dedo indicador ao longo da borda longa em posições perto de uma margem curta. Segurando a lamela a um ângulo de 30 ° em relação ao deslize, o mais distante borda curta a partir dos dedos é reduzido até que repousa sobre a corrediça apenas no interior da borda do &quot;poça&quot; mais próximo da região fosco da corrediça. Em seguida, abaixe lentamente a lamela em um movimento suave até que os dedos segurando o toque de slides do banco, e depois solte. Não tente ajustar a posição da lamela uma vez ele cair. NOTA: Se os spreads de cromossomos foram preparadas noapostos lamelas (em vez de directamente sobre a superfície de lâminas), esta amostra lamela permanecerá fixada à corrediça ao longo dos passos de coloração e de lavagem. Uma lamela adicional será colocada em cima da lamela amostra para distribuir uniformemente a solução de anticorpo durante a coloração e, em seguida, descartado. </li><li> Colocar as lâminas em uma câmara de humidade selada e incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Segurando a borda transferência fosco os slides para um suporte de coloração lâmina de vidro e submergir em uma tina de coloração contendo TBS. </li><li> Delicadamente mergulhe o slide para cima e para baixo para remover a lamela. Tente não usar muita força para fazer isso. Lavar as lâminas 2x 10 min por submersão em TBS. Remover as lâminas da cremalheira e drenar o excesso de líquido, tocando a borda toalha de papel. Não deixe que a superfície seca. </li><li> Trabalhando sob luz difusa, imediatamente adicionar 80 ul TBS / BSA contendo um 1 / 1.000 diluição vezes de anticorpo secundário conjugado fluorocromo (ou 40 ul com uma lamela de 22 x 22 mm). De Anúnciosd lamela como antes e incubar a 4 ° C durante 2 horas na câmara húmida no escuro. </li><li> Remover lamelas como antes, drenar lâminas, e permita que a superfície secar ao ar durante 1-2 horas no escuro. Lâminas Lean On toalhas de papel como antes. NOTA: Se se espalhando foi realizada sobre uma lamela montado, retirar a lamela do diapositivo antes da secagem. As lamelas são em seguida secou-se como descrito para corrediças no passo anterior. </li><li> Trabalhando sob luz difusa, adicionar cerca de 30 ul de meio contendo DAPI (10 gotas três ul) de montagem e abaixe cuidadosamente a lamela. Se os spreads são em lamelas, coloque as gotas de meio de montagem sobre uma lâmina limpa e reduzir lamela, o lado do cromossomo para baixo, para o slide. </li><li> Ainda sob luz difusa, espere 2 minutos para lamela para se estabelecer e selar bordas da lamela com unha polonês claro. Colocar as lâminas em uma caixa de slides plana. NOTA: Para a microscopia STED, montagem com prolongar Gold. Use 30 ul de prolongar OuroDAPI e sem deixar curar durante a noite. Vedação com unha polonês é desnecessário. </li><li> Veja as lâminas de microscopia de epifluorescência widefield com 40 ou objetiva 100X, utilizando um filtro adequado para definir DAPI para se concentrar. Opcionalmente armazenar a corrediça no escuro a 4 ° C durante várias semanas. Não congelar. </li></ol>

<ol><li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li>
<li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li>
<li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li>
<li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li>
<li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+identifies+Monopolin%3A+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li>
<li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+RecA-like+recombinases%3A+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li>
<li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1%2FAurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li>
<li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li>
<li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li>
<li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

O aparecimento de núcleos espalhados depende criticamente do equilíbrio entre fixação e tratamento de lise/detergente. Como discutido acima, a preservação de estruturas celulares variadas requer o uso de diferentes concentrações de PFA. Para a maioria das proteínas, 3% de PFA é o ideal. No entanto, a preservação dos fusos requer o uso de 4% de PFA. Mesmo com um único conjunto de reagentes, o tempo de lise em relação à fixação também pode afetar a qualidade dos núcleos espalhados. Para obter resultados mais consistente...

A levedura de germinação Saccharomyces cerevisiae oferece muitas vantagens para estudos de mecanismos moleculares de processos biológicos, incluindo o estudo de proteínas que controlam a função cromossoma. Embora existam vantagens bem conhecidas de brotamento de levedura para estudos genéticos, moleculares e bioquímicos, estudos citológicos da distribuição de proteínas no núcleo da célula é complicada pelo seu tamanho pequeno. O núcleo típico de levedura tem um diâmetro de menos de um micron, que é apenas cerca de 5 vezes o limite de resolução da luz visível. Assim, a quantidade de informação sobre a distribuição de proteínas nucleares que pode ser obtido a partir de imunocoloração convencional ou usando as marcas de proteínas fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP), é limitada. Uma abordagem útil para caracterizar a distribuição de proteínas é subnuclear superfície cromossoma espalhamento. Esta abordagem envolve a remoção da parede celular, interrompendo celular e membranas nucleares, e umllowing o conteúdo insolúveis do núcleo para assentar sobre a superfície de uma lâmina de microscópio. Estes componentes insolúveis incluem a matriz nuclear e os cromossomas. Além de permitir a remoção do conteúdo nuclear solúveis, o que aumenta a capacidade para detectar proteínas ligadas cromatina, o cromossoma espalhando método resulta em substancial descompressão dos cromossomas de modo a que os núcleos propagação têm diâmetros de cerca de 3 a 5 um (para os núcleos diplóides meióticas) e 2 a 3 mm para núcleos diplóides mitóticas. Isto permite a detecção de descompressão subestrutura nuclear que é relativamente difícil ou impossível de resolver em núcleos intactos. Uma desvantagem óbvia no cromossoma de espalhamento é a possibilidade de que o processo de espalhamento podem parcialmente ou completamente perturbar a estrutura de interesse. Particularmente preocupante é que um cromossomo ligado proteína particular podem ser perdidos como consequência do processo de propagação. Esta complicação potencial should ser mantido em mente ao interpretar os dados. Um exemplo de uma proteína que é sensível ao procedimento de propagação é o beta-tubulina. Sob algumas condições, o fuso, o qual é composto principalmente de tubulina, é preservada durante o espalhamento 3. Visualização do fuso é frequentemente útil para encenar núcleos de interesse. No entanto, visualizando tubulina requer tratamento com um fixador de elevada concentração; fusos são perdidos sob as condições padrão descritas abaixo. Este exemplo ilustra que, quando se analisa a distribuição de uma proteína anteriormente não caracterizada, é importante variar a concentração do fixador para determinar a sensibilidade da proteína é referida variação. A despeito da preocupação com o impacto das condições de propagação em estrutura dos cromossomas, a utilidade e o método de alimentação de propagação tem sido demonstrada em muitos contextos e tem ampla utilidade na caracterização de mitose e, especialmente células meióticas 4-7. TwO espalhamento métodos têm sido utilizados extensivamente. O primeiro destes métodos, desenvolvidos pela Dresser Giroux e 8, evita a utilização de detergente e pode produzir preparações propagação que parecem ter morfologia cromossoma relativamente bem preservada quando coradas para o corante de DAPI-ADN específica. No entanto, este método é relativamente difícil e aperfeiçoar a qualidade dos núcleos propagação varia dramaticamente, quando uma região de uma corrediça é comparada com outras regiões. Este problema pode complicar abordagens quantitativas que envolvem imagiologia muitos núcleos não selecionados de um slide para evitar viés de aquisição de dados. O segundo cromossomo método espalhando, desenvolvido pela Loidl e Klein 1, envolve o equilíbrio de fixação por paraformaldeído, com lise e descompressão cromatina promovido por uma solução de detergente. Quando executado corretamente, este método dá resultados muito reprodutíveis com menos variação de região para região, em comparação com o método Dresser and Giroux. Esta apresentação se concentra em um modified versão do método de Loidl e Klein, por causa da sua fiabilidade e a simplicidade. Cromossoma propagação não é complicada ou demorada; até 100 lâminas pode ser preparado para a imunocoloração num único dia. Além disso, as preparações de propagação pode ser armazenado no congelador durante anos antes da imunocoloração, e, assim, laboratórios pode desenvolver um repositório de barrar cromossómicas congelados que podem ser usados ​​quando novas perguntas biológicos surgem novos reagentes de coloração ou tornar-se disponíveis. O método cromossoma espalhamento é mais comummente usado em combinação com imuno fluorescência e microscopia de campo amplo, mas também é possível preparar as lâminas de super-resolução métodos microscópicos de luz, tais como esgotamento de emissão estimulada microscopia (STED).

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biológica</td><td>Z1004</td><td>Preparar a solução a 20 mg/ml em Tris pH 7,5 a 50 mM, suplementada com glucose a 2%. Prepare fresco cada experimento e armazene a 4&deg; C até estar pronto para uso.</td></tr><tr><td>Lipsol&nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&nbsp;</td><td>não está mais disponível comercialmente</td><td>Prepare a solução a 1% (v / v) em água. Armazene no gelo.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Prepare a solução a 1% (v/v) em água. Armazene no gelo.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Capa padrão</td><td>Fisher</td><td>12-544-E ou 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de alta resolução</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solução</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Prepare a solução a 0,2% (v/v) em água.&nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Prepare uma solução a 1% (p/v) em TBS. Armazene a 4&deg; C por até um mês.</td></tr><tr><td>Anticorpo</td><td></td><td></td><td></td>primário</tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Anticorpo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mídia de montagem Vectashield com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de slides de plástico</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Armazene as lâminas contendo pastas secas em fendas a -20 ° C. Além disso, use como uma câmara úmida.</td></tr><tr><td>Caixa de papelão para lâminas</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Use para transportar convenientemente lâminas manchadas/seladas ou armazene a 4°C.</td></tr><tr><td>Frasco Coplin</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Use como lavatório para slides.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

espalhando superfície e immunostaining de cromossomas da levedura

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

O pequeno tamanho dos núcleos da levedura Saccharomyces cerevisiae limita a utilidade da microscopia de luz para análise da distribuição subnuclear de proteínas ligadas à cromatina. O espalhamento superficial dos núcleos de levedura resulta na expansão da cromatina sem perda de proteínas ligadas. Um método para espalhamento superficial equilibra a fixação de proteínas ligadas ao DNA com tratamento detergente. O método demonstrado é ligeiramente modificado em relação ao descrito por Josef Loidl e Franz Klein1,2. O método tem sido usado para caracterizar a localização de muitas proteínas ligadas à cromatina em vários estágios do ciclo celular mitótico, mas é especialmente útil para o estudo de estruturas cromossômicas meióticas, como recombinossomos meióticos e o complexo sinaptonêmico. Também descrevemos uma modificação que não requer o uso de Lipsol, um detergente patenteado, que foi exigido no procedimento original, mas não está mais disponível comercialmente. Um protocolo de imunocoloração compatível com o método de espalhamento cromossômico também é descrito.

O aparecimento de propagação núcleos depende criticamente sobre o equilíbrio entre a fixação cromossomo e de compactação. Mesmo quando os reagentes são adequadamente equilibrado, variação no grau de cromossoma de compactação pode ocorrer em diferentes regiões da mesma lâmina e / ou entre as diferentes lâminas. Assim, a qualidade dos spreads em uma determinada região de um slide deve ser avaliada antes imagens são interpretadas. Os efeitos da &quot;asa&quot; e &quot;underspreading&quot; pode ...

Um método para espalhar a superfície dos cromossomos a partir de leveduras em brotamento é apresentado. Este método é derivado de um método descrito anteriormente por Loidl e Klein. Além disso, demonstramos um procedimento para imunocoloração de cromossomos disseminados.

Espalhando superfície e Immunostaining de cromossomas da levedura

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar proteínas ligadas aos cromossomos por microscopia de fluorescência. Isso é realizado primeiramente removendo a parede celular por meio do tratamento com enzimas. Eu sou olis.O segundo passo é lisar a célula e as membranas nucleares por choque osmótico, geralmente com a ajuda de um detergente. Isso é feito na presença de uma baixa concentração de fixador para preservar a estrutura das proteínas. Após a lise celular, a concentração de fixador é aumentada para estabilizar ainda mais as estruturas proteicas.As células lisadas são então depositadas em uma lâmina de microscópio e os núcleos são deixados assentar sobre a superfície da lâmina. O passo final é a imunomarcação das amostras. O método de imuno-histoquímica indireta demonstrado aqui utiliza um anticorpo primário que se liga à proteína de interesse e um anticorpo secundário marcado com fluoróforo que se liga ao anticorpo primário.Por fim, a microscopia de imunofluorescência é utilizada para examinar a distribuição de proteínas ligadas aos cromossomos. Essas imagens representativas são de um núcleo mitótico espalhado, imunomarcado para as proteínas de recombinação DMC1 e RAD51. A principal vantagem desta técnica em relação ao outro método comumente utilizado, introduzido por Mike Dresser e Craig Deru, é que a maior parte da superfície da lâmina conterá núcleos adequadamente espalhados, facilitando a obtenção de imagens de um grande número de núcleos espalhados a partir de uma única lâmina.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo de estruturas subnucleares, como, por exemplo, se duas proteínas co-localizam ou se a formação de uma determinada subestrutura nuclear depende da função de um gene de interesse específico. Enfatizamos que este método foi originalmente desenvolvido por Franz Klein e Yosef Lole. Esperamos que este vídeo ajude outras pessoas a dominar a nossa versão da técnica.As gotas são preparadas a partir de células de levedura cultivadas sob as condições desejadas. Utilize cerca de duas vezes 10 elevado a oito células para cada amostra. Transfira a suspensão celular para tubos de centrífuga de 15 mililitros.Centrifugue os tubos em uma centrífuga clínica na velocidade cinco por três minutos para fazer o pellet das células. Decante o meio, tomando cuidado para não perder as células do pellet. Resuspenda suavemente as células em um mililitro de tampão ZK e, em seguida, adicione 40 microlitros de dihi a um molar.Três etol incubam por dois minutos à temperatura ambiente com mistura suave. Pelotize as células como antes da resus. Suspenda cada pellet em um mililitro de tampão ZK.Adicione cinco microlitros de uma solução recém-preparada de zy liase 100 T que tenha sido completamente misturada. Incube a 30 graus Celsius por 20 a 30 minutos para remover a parede celular e produzir esferoplastos. Analise 10 microlitros da suspensão celular ao microscópio para determinar se a esferoplastia está completa.Antes da remoção da parede celular, as células de levedura parecem ligeiramente oblongas. Células esferoplastadas devem parecer inchadas e arredondadas. Após a adição de água, as células esferoplastadas devem ser suavemente ressuspendidas; em seguida, lavar o pellet celular em 2,5 mililitros de tampão MES orbital frio. Após a centrifugação, ressuspender novamente suavemente o pellet celular em 300 a 400 microlitros de tampão MES orbital frio. As células podem ser mantidas em gelo nesta etapa por várias horas.Este procedimento exige um microscópio de dissecação tetra de levedura equipado com uma objetiva de longa distância de trabalho de 10 x montada na câmara de fluxo laminar, sendo necessário remover a agulha de microdissecação. A superfície de vidro sobre a qual os cromossomos serão espalhados também deve ser preparada previamente: com uma pipeta P20, pipete 20 microlitros da suspensão celular sobre a superfície de uma lâmina limpa; com uma pipeta P200, adicione 40 microlitros de uma solução recém-preparada de paraformaldeído 3% e sacarose 3,4% e misture suavemente a solução girando a lâmina com a mão até que as linhas de Schlein desapareçam. Coloque a lâmina sob o microscópio e confirme que as células estão em foco.Usando uma pipeta P200, adicione 80 microlitros de Lip Sal 1% e gire suavemente como antes para misturar as soluções o mais completamente possível e inicie um cronômetro. Se o Lip Sal não estiver disponível, pode-se usar o mesmo volume de MP40 1% ou água destilada. Em vez disso, observe cuidadosamente as células e gire suavemente a lâmina a cada 15 segundos.Este clipe de vídeo mostra o que deve ser observado quando aproximadamente 80 a 90% das células tiverem lisado. Pare o cronômetro e remova imediatamente a lâmina do microscópio. A lise deve ocorrer entre 30 e 90 segundos.Após iniciar o cronômetro, adicione 80 microlitros da solução de paraformaldeído e sacarose e agite suavemente para misturar. Coloque a lâmina sobre uma superfície plana e limpa. Utilize o lado de uma pipeta Pasteur descartável e limpa, mantida abaixo do menisco da gota, mas acima da superfície da lâmina, para espalhar o líquido por toda a superfície não fosca da lâmina.Não raspe a superfície da lâmina com a pipeta. Use uma pipeta nova para cada lâmina para evitar contaminação das amostras. Deixe as lâminas secarem durante a noite na capela; os componentes nucleares insolúveis, incluindo os cromossomos, irão sedimentar sobre a superfície da lâmina e ligar-se a ela assim que as lâminas estiverem secas.Resultados ideais são obtidos ao prosseguir com a imunomarcação no mesmo dia. Mergulhe as lâminas em Photo flow 0,2% por 30 segundos. Para remover a solução de sacarose seca, apoie as lâminas em uma borda, com a borda apoiada em uma toalha de papel, para remover o photo flow residual.Mergulhe as lâminas em um XTBS durante cinco minutos para lavar. Remova o líquido em excesso inclinando as lâminas sobre uma borda, mas não as deixe secar. Em seguida, posicione as lâminas com o lado fosco voltado para cima e pipete 300 microlitros de T-B-S-B-S-A sobre cada lâmina, cobrindo a porção não fosca da lâmina.Incube as lâminas em uma câmara úmida à temperatura ambiente por 15 minutos. Após 15 minutos, drene as lâminas apoiando uma borda curta de cada lâmina em uma toalha de papel e inclinando a lâmina contra um suporte apropriado, como uma grade para tubos de ensaio. Não permita que a superfície seque imediatamente.Adicione 80 microlitros de tampão T-B-S-B-S-A contendo a diluição apropriada de anticorpo primário para soro bruto de coelho. Normalmente, essa diluição varia entre 1:50 e 1:500. Coloque uma lamínula polida de 22 por 50 milímetros sobre a lâmina, evitando bolhas.Faça isso segurando a lamínula entre o polegar e o indicador ao longo da borda longa, em posições próximas a uma das bordas curtas. Enquanto segura a lamínula em um ângulo de 30 graus em relação à lâmina, abaixe a borda curta mais distante dos dedos até que ela repouse sobre a lâmina, logo dentro da borda da gota mais próxima da região fosca da lâmina.Abaixe lentamente a lamínula com um movimento suave até que os dedos toquem a lâmina e, então, solte. Não tente ajustar a posição da lamínula após ela ter sido posicionada. Coloque as lâminas em uma câmara úmida fechada e incube durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte, segurando as lâminas pela borda fosca. Mergulhe cada uma em um frasco de coloração contendo TBS.Mova suavemente as lâminas submersas para cima e para baixo para remover a lamínula. Evite usar muita força para fazer isso. Lave as lâminas submergindo-as em TBS duas vezes, por 10 minutos cada vez.Substitua o tampão após a primeira lavagem. Remova as lâminas do suporte e remova o líquido em excesso tocando suas bordas em papel toalha. Não deixe a superfície secar imediatamente.Adicione a cada lâmina 80 microlitros de T-B-S-B-S-A contendo uma diluição de um para 1000 do anticorpo secundário conjugado com fluorocromo. Adicione a lamínula como anteriormente e incube na câmara úmida a quatro graus Celsius por duas horas no escuro. Após duas horas, remova as lamínulas, lave como antes e seque as lâminas.Apoiando-os sobre toalhas de papel. Deixe a superfície secar ao ar por uma a duas horas no escuro, trabalhando sob luz reduzida, com cerca de 30 microlitros de meio de montagem contendo dbi. Em seguida, abaixe cuidadosamente uma lamínula.Aguarde dois minutos ainda sob luz reduzida para que a lamínula assente, e então selar as bordas da lamínula com esmalte incolor. Coloque as lâminas em uma caixa para lâminas plana. As lâminas podem ser armazenadas no escuro a quatro graus Celsius até o momento de serem visualizadas.Não congele. Os lâminas nesta etapa mostrados são dois exemplos de núcleos mióticos idealmente espalhados com dupla imunomarcação para as duas proteínas de troca de fita eucarióticas RAD51 e DMC1 e contra-coloração para DNA com DAPI. Para células diplóides, núcleos mióticos idealmente espalhados têm diâmetros de aproximadamente cinco mícrons. Em um núcleo subespalmado, menos focos de RAD51 e DMC1 são resolvidos e nem todas as estruturas podem ser visualizadas em um único plano focal, porque a amostra não é suficientemente plana. Em núcleos superespalmados.Menos focos de RAD51 e DMC1 permanecem devido à fixação insuficiente e/ou detergente em excesso. Experimentos de tratamento também foram realizados, nos quais lip-sal, que não está mais comercialmente disponível, foi substituído por MP-40, obtendo-se resultados satisfatórios, conforme mostrado no núcleo miótico espalhado corado para RAD51 e Zip1, um componente da região central do complexo sinaptonemal. A substituição de lip-sal por água destilada também gerou resultados satisfatórios.Em ambos os casos, a compactação cromossômica que ocorre quando as células transicionam de NEA leptina para PAA foi amplamente preservada. Este método de espalhamento é adequado para uso com métodos de microscopia tipo super-resolução. Nesta imagem do Complexo Sinapto Neal, o núcleo Paki INE sustentou-se para zip um e vermelho um.Componentes do complexo sinaptonemal visualizados por microscopia de esgotamento por emissão estimulada. Observe que o anticorpo zip1 usado aqui, mostrado em verde, se liga próximo aos elementos laterais, conforme evidenciado pelo padrão de coloração linear paralelo. Os elementos laterais estão separados por cerca de 100 nanômetros e não podem ser resolvidos por microscopia convencional.Uma vez dominada, a técnica de plaqueamento e espalhamento pode ser realizada em duas a quatro horas, dependendo do número de amostras, com prática. Até 100 lâminas podem ser preparadas por este método. Recomenda-se preparar uma ou mais lâminas duplicatas de cada amostra. As duplicatas podem ser armazenadas para uso futuro a menos 20 graus Celsius após a etapa de secagem durante a noite.As lâminas geralmente duram anos quando armazenadas desta forma.

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