Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em Mycobacterium tuberculosis Infecção

O objetivo geral deste procedimento é construir um modelo de tecido pulmonar in vitro para estudos de infecção por M tuberculosis. Isso é feito primeiro colocando uma matriz de colágeno de fibroblastos no filtro de uma inserção de placa de cultura de células. Na segunda etapa, as células epiteliais imunes e pulmonares infectadas são assentadas na camada de colágeno de fibroblastos.

O modelo de tecido 3D resultante é então exposto ao ar para facilitar a secreção de muco e a estratificação do epitélio. Na etapa final, o tecido é colhido e montado. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência é usada para analisar a formação de granuloma precoce induzido por M tuberculosis.

A principal vantagem desta técnica ou dos métodos existentes, como a monocamada de células in vitro, é que as células deste sistema estão presentes em um microambiente 3D, permitindo a formação de granulomas após a infecção por microbactérias virulentas semelhantes à tuberculose humana Para preparar fibroblastos embebidos em colágeno, comece tratando as células de fibroblastos pulmonares com tripsina por 10 minutos a 37 graus Celsius quando as células se desprenderem, Pare a reação com oito mililitros de DMEM completo e, em seguida, gire as células. Ressuspender os pellets a 230 000 células por mililitro em dmm fresco e colocar as células no gelo. Em seguida, adicione uma inserção por poço em seis.

Poço e dispense um mililitro de uma mistura de camada celular recém-preparada em cada inserção, certificando-se de que a mistura cubra toda a pastilha sem bolhas de ar. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos. No final da incubação, misture dois mililitros de colágeno com 615 microlitros de pré-mistura em um tubo cônico estéril no gelo para neutralizar o pH do colágeno por inserção.

Em seguida, adicione 58 microlitros de dmem completo e 327 microlitros de fibroblastos pulmonares por inserção à mistura de colágeno. Pipetagem para cima e para baixo para distribuir as células uniformemente por toda a mistura. Agora adicione rapidamente três mililitros da camada celular na lateral de cada inserção em cada camada de colágeno acelular.

Tomando cuidado para evitar bolhas de ar e devolver a placa à incubadora de cultura de células por mais duas horas. Após a polimerização do colágeno, adicione dois mililitros de dmem completo ao fundo de cada poço e retorne a placa à incubadora por mais 24 horas. No dia seguinte, use uma pinça limpa para levantar cuidadosamente as inserções, uma de cada vez, e aspirar o meio de cultura da parte inferior de cada uma.

Bem, então adicione dois mililitros de DMM completo ao fundo de cada poço e dois mililitros de DMM completo a cada inserção. Alterar os dois volumes do meio a cada dois dias por cinco a sete dias. Para preparar os macrófagos infectados, comece incubando uma cultura de macrófagos por quatro horas com M tuberculosis virulento em uma multiplicidade de infecção de 10.

No final da incubação, lave as células três vezes com PBS para remover as bactérias extracelulares e trate os macrófagos com dois milimolares, A DTA por 10 minutos a 37 graus Celsius. Quando as células tiverem se destacado, suspenda-as em dmm completo sem antibióticos. Em seguida, aspire todo o meio da placa de matriz de colágeno de fibroblastos e adicione 1,5 mililitros de DMM completo fresco sem antibióticos às câmaras externas.

Em seguida, misture monócitos marcados com fluorescência com os macrófagos infectados em uma proporção de cinco para um em 50 microlitros do DM EM completo livre de antibióticos por inserção. Em seguida, adicione 50 microlitros da mistura de monócitos macrófagos no interior de cada inserto e retorne a placa à incubadora. Após uma hora, adicione lentamente dois mililitros de cultura, abaixe as paredes das inserções para evitar o deslocamento das células e incube as culturas por mais 24 horas.

Para semear as culturas com células epiteliais pulmonares, adicione 4 milhões de células epiteliais por mililitro em 50 microlitros de dmm completo em cima das matrizes de colágeno de fibroblastos de células imunes. Incube as células por dois minutos em temperatura ambiente, seguido de uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione suavemente dois mililitros de DMM completo sem antibióticos às inserções, como acabamos de demonstrar, e cultive as células por mais três dias.

Cinco dias após a semeadura, os macrófagos infectados aspiram todo o meio de cultura da placa e adicionam 1,8 mililitros de DMM completo e livre de antibióticos às câmaras externas. Em seguida, expôs os modelos de tecido 3D na incubadora por dois dias sem adicionar meio à inserção no sétimo dia. Pós-semeadura.

Remova o meio inteiramente da placa e misture os modelos de tecido com 4% de paraldeído por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, usando um bisturi, separe as membranas das inserções do poço. Em seguida, use um bisturi limpo para remover cuidadosamente as laterais dos modelos de tecido e corte cada tecido em quatro pedaços quadrados de tamanho aproximadamente igual.

Transfira as peças para lâminas de vidro super frost e deixe secar por cinco minutos. Em seguida, usando montagem fluorescente, meio contendo anti fade e dpi, monte os lenços e cubra-os com lamínulas. Deixe as lâminas em temperatura ambiente no escuro até que estejam secas e, em seguida, sele as bordas da lamínula com esmalte.

Quando a laca estiver seca, mergulhe as lâminas em etanol 70% para uma transferência para fora da instalação BSL três. Para visualizar os tecidos, adquira imagens 3D de cinco a 10 campos diferentes cobrindo todo o pedaço de tecido em uma resolução de 512 por 512 com Zack cobrindo com um mínimo de 20 mícrons de espessura com uma separação de um a 1,5 mícron entre as pilhas em um microscópio confocal fluorescente para quantificação 3D dos aglomerados de células. Abra o software de processamento de imagem 3D e carregue a imagem de interesse.

Em seguida, usando a ferramenta de ajuste de exibição, ajuste cada canal para imagem, contraste, brilho e opacidade de mesclagem para otimizar a renderização de volume e minimizar a interferência de ruído. Em seguida, para visualizar a superfície do tecido, selecione o canal de monócitos vermelhos e defina os limites apropriados usando os filtros para restringir a seleção dos monócitos vermelhos ou excluir o fundo conforme necessário. Por fim, exporte os dados para o programa de planilha apropriado para análise posterior a jusante.

No sétimo dia, a microscopia confocal de semeadura de células infectadas por M tuberculosis revela um agrupamento de monócitos vermelhos no local da infecção, conforme observado pela presença da bactéria verde que imita as lesões de tuberculose humana conhecidas como granuloma 3D. A visualização fornece a flexibilidade de interagir, examinar e quantificar vários recursos. Uma imagem 3D, por exemplo, nessas imagens retratando um aglomerado de monócitos no local da tuberculose.

O arranjo espacial de bactérias verdes e aglomerados de monócitos vermelhos pode ser observado nas vistas apical, rotacional e lateral. Como esperado, esses clusters não foram observados nos tecidos não infectados. A quantificação do tamanho e número de monócitos, aglomerados de células e tecidos infectados por M tuberculosis revelou que o tamanho dos aglomerados de células é aumentado enquanto o número de monócitos individuais é diminuído em comparação com os modelos de tecidos não infectados.

Os usuários potenciais deste modelo de tecido pulmonar incluem um estudo do papel de diferentes células imunes e imunidade tecidual na tuberculose, o estudo de fenótipos de micobactérias e testes de candidatos a medicamentos que matam micobactérias dentro do granuloma.