Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em

O objetivo geral deste procedimento é construir um modelo de tecido pulmonar in vitro para estudos de infecção por M tuberculosis. Isso é realizado primeiramente aplicando uma matriz de colágeno com fibroblastos sobre o filtro de um inserto de placa de cultura celular. Na segunda etapa, células epiteliais pulmonares e imunes infectadas são semeadas sobre a camada de colágeno com fibroblastos.

O modelo de tecido 3D resultante é então exposto ao ar para facilitar a secreção de muco e a estratificação do epitélio. Na etapa final, o tecido é coletado e montado. Por fim, utiliza-se microscopia de imunofluorescência para analisar a formação do granuloma inicial induzido por M tuberculosis.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a monocamada de células in vitro, é que as células neste sistema estão presentes em um microambiente tridimensional, permitindo a formação de granulomas após infecção com microrganismos virulentos semelhantes ao TB humano. Para preparar fibroblastos embutidos em colágeno, comece tratando células de fibroblastos pulmonares com tripsina por 10 minutos a 37 graus Celsius; quando as células se destacarem, interrompa a reação com oito mililitros de DMEM completo e, em seguida, centrifugue as células. Resuspenda os pellets a 230.000 células por mililitro em DMEM fresco e coloque as células no gelo. Em seguida, adicione um inserto por poço em uma placa de seis.

Placa de poços e distribua um mililitro de mistura fresca de camada acelular em cada inserto, certificando-se de que a mistura cubra completamente o inserto sem bolhas de ar. Em seguida, coloque a placa em um incubador a 37 graus Celsius por 30 minutos. Ao final da incubação, misture dois mililitros de colágeno com 615 microlitros do pré-mix em um tubo cônico estéril sobre gelo para neutralizar o pH do colágeno por inserto.

Em seguida, adicione 58 microlitros de DMEM completo e 327 microlitros de fibroblastos pulmonares por inserto à mistura de colágeno. Pipete para cima e para baixo para distribuir as células uniformemente por toda a mistura. Agora, adicione rapidamente três mililitros da camada celular pelas laterais de cada inserto sobre cada camada acelular de colágeno.

Tendo cuidado para evitar bolhas de ar, retorne a placa ao incubador de cultura celular por mais duas horas. Após a polimerização do colágeno, adicione dois mililitros de DMEM completo no fundo de cada poço e retorne a placa ao incubador por mais 24 horas. No dia seguinte, utilize um par de pinças limpas para levantar cuidadosamente os inserts, um de cada vez, e aspire o meio de cultura do fundo de cada poço.

Em seguida, adicione dois mililitros de DMM completo ao fundo de cada poço e dois mililitros de DMM completo a cada inserto. Troque ambos os volumes de meio a cada dois dias, durante cinco a sete dias. Para preparar os macrófagos infectados, comece incubando uma cultura de macrófagos por quatro horas com M. tuberculosis virulenta, com uma multiplicidade de infecção de 10.

Após o término da incubação, lave as células três vezes com PBS para remover as bactérias extracelulares e trate os macrófagos com dois milimolares de A DTA por 10 minutos a 37 graus Celsius. Quando as células tiverem se destacado, re-suspenda-as em DMM completo sem antibiótico. Em seguida, aspire todo o meio da placa de matriz de colágeno com fibroblastos e adicione 1,5 mililitros de DMM completo fresco sem antibiótico às câmaras externas.

Em seguida, misture monócitos marcados com fluoróforo aos macrófagos infectados na proporção de cinco para um, em 50 microlitros de DM EM completo sem antibiótico por inserto. Então, adicione 50 microlitros da mistura de monócitos e macrófagos ao interior de cada inserto e retorne a placa ao incubador. Após uma hora, adicione lentamente dois mililitros de meio de cultura pelas paredes dos insertos, evitando deslocar as células, e incube as culturas por mais 24 horas.

Para semear as culturas com células epiteliais pulmonares, adicione 4 milhões de células epiteliais por mililitro em 50 microlitros de DMM completo sobre as matrizes de colágeno de fibroblastos com células imunes. Incube as células por dois minutos à temperatura ambiente, seguidos de uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione cuidadosamente dois mililitros de DMM completo sem antibiótico aos insertos, conforme acabou de ser demonstrado, e cultive as células por mais três dias.

Cinco dias após o semeadura, aspire todo o meio de cultura da placa e adicione 1,8 mililitros de DMM completo sem antibiótico às câmaras externas. Em seguida, exponha os modelos de tecido 3D ao ar no incubador por dois dias, sem adicionar meio ao inserto no sétimo dia, após a semeadura.

Remova completamente o meio da placa e misture os modelos teciduais com paraldeído 4% por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, usando um bisturi, separe as membranas dos insertos de poço. Depois, use um bisturi limpo para remover cuidadosamente as bordas dos modelos teciduais e corte cada tecido em quatro pedaços quadrados de tamanho aproximadamente igual.

Transfira os fragmentos para lâminas de vidro super frosts e deixe secar por cinco minutos. Em seguida, utilizando meio de montagem fluorescente contendo agente antidesvanecimento e dpi, monte os tecidos e cubra-os com lamínulas. Deixe as lâminas à temperatura ambiente no escuro até que sequem completamente e, depois, selar as bordas da lamínula com esmalte para unhas.

Após a secagem do esmalte, mergulhe as lâminas em etanol 70% para a transferência para fora da instalação de BSL 3. Para visualizar os tecidos, adquira imagens tridimensionais de cinco a dez campos diferentes que cubram toda a peça de tecido, com resolução de 512 por 512 e cobertura Zack de, no mínimo, 20 mícrons de espessura e separação de um a 1,5 mícron entre as pilhas, em um microscópio confocal fluorescente para quantificação tridimensional dos aglomerados celulares. Abra o software de processamento de imagens tridimensionais e carregue a imagem de interesse.

Em seguida, utilizando a ferramenta de ajuste de exibição, ajuste cada canal de imagem, contraste, brilho e opacidade da sobreposição para otimizar a renderização volumétrica e minimizar a interferência de ruído. Depois, para visualizar a superfície do tecido, selecione o canal de monócitos vermelhos e defina os limiares apropriados utilizando os filtros para restringir a seleção dos monócitos vermelhos ou excluir o fundo, conforme necessário. Por fim, exporte os dados para o programa de planilha apropriado para análises posteriores.

No sétimo dia, após o cultivo de células infectadas com M. tuberculosis, a microscopia confocal revela um agrupamento de monócitos vermelhos no local da infecção, observado pela presença das bactérias verdes, imitando as lesões da tuberculose humana conhecidas como granuloma 3D. A visualização oferece a flexibilidade de interagir, examinar e quantificar diversas características. Uma imagem 3D, por exemplo, nessas imagens que retratam um agrupamento de monócitos no local da infecção por M. tuberculosis.

A disposição espacial das bactérias verdes e dos agregados celulares de monócitos vermelhos pode ser observada nas vistas apical, rotacional e lateral. Como esperado, esses agregados não foram observados nos tecidos não infectados. A quantificação do tamanho e do número de monócitos, agregados celulares e tecidos infectados por M. tuberculosis revelou que o tamanho dos agregados celulares é aumentado, enquanto o número de monócitos individuais é reduzido em comparação com os modelos de tecidos não infectados.

Usuários potenciais deste modelo de tecido pulmonar incluem o estudo do papel de diferentes células imunes e da imunidade tecidual na tuberculose, o estudo de fenótipos de micobactérias e a avaliação de candidatos a fármacos que eliminam micobactérias dentro do granuloma.