Name: Um método computadorizado reprodutível para quantificação da densidade capilar usando capilaroscopia periungueal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Aprenda a quantificar capilares por milímetro quadrado usando capilaroscopia periungueal e algoritmo computadorizado. Este método reprodutível auxilia pesquisadores a estudar microcirculação em doenças cardiovasculares.

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Este projeto foi apoiado por Grant Numbers HL96593 do NIH e D56HP20783 do HRSA/HHS. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH ou HRSA / HHS.

Nota: O processo de aquisição para a obtenção de imagens capilares foi publicado anteriormente e é realizada usando uma câmera fotográfica digital com um programa de computador de aquisição e análise de imagem correspondente 11 21 Este laboratório utiliza imagens estáticas para análise, não vídeos, simplificando a aquisição de imagens para análise.. O que se segue descreve a nova técnica para a quantificação dos capilares a partir das imagens. 1. Processo de Aperfeiçoamento de Imagem <ol><li> Obter imagens digitais com uma câmera digital monocromática. Calibrar as imagens para um objeto de tamanho conhecido por tirar uma foto de um objeto de comprimento conhecido como um governante com a câmera. Este processo permite que o programa de computador para medir com precisão e contar capilares após o processamento. O ideal para a mais alta precisão, deve ser usada uma retícula (peça cientificamente fabricados de vidro com uma régua gravada nela). Mede o número de pixels em um quadrado de 1 mmcaixa usando um programa de computador. Nota: A chave para a reprodutibilidade ea padronização desse protocolo depende em grande parte a colocação adequada da caixa de um milímetro 2 que é contado. </li><li> Use ferramentas de aprimoramento de contraste para escurecer os capilares e clarear o fundo, que irá maximizar a visualização dos vasos capilares. Diferenciação inicial de capilares a partir do fundo é importante para o recorte da imagem adequada em etapas posteriores. Para fazer isso, o ajuste da imagem usando um Para fazer isso, clique em &quot;melhor ajuste histograma.&quot;: Captura, intensidade, imagem histograma, melhor ajuste. </li><li> Cortar uma região de interesse (ROI) para a contagem capilar como uma nova imagem (selecionar, regiões de interesse). Use uma caixa de um milímetro 2, que foi determinada pela calibração das imagens a 530 pixels igualando 1 mm. verifique se a imagem recortada coloca o ápice das alças capilares no topo da imagem. </li><li> Achatar a imagem para que todos os ajustes de imagem futuras será aplicado uniformementea imagem. Para isso, clique em: guia processo, filtros 2D, alise, BG intensidade &quot;, brilhante&quot; width objeto para &quot;75&quot;, se aplicam. </li><li> Levante o contraste da imagem de forma capilares são maximamente visualizado. Para fazer isso, clique em: ajustar guia, exposição, levantar contraste com 75. </li><li> Despeckle a imagem para suavizar as bordas dos capilares, clicando na guia processo, filtros 2D, despeckle, tamanho do kernel 7 x 7, aplique. </li><li> Finalize o contraste da imagem de forma capilares são o preto eo fundo é branco. Execute esta etapa, ajustando o histograma para o &quot;melhor ajuste&quot; do modelo. Nota: Por favor, consulte a Figura 2 em resultados representativos para um exemplo do que a imagem processada deve ser semelhante a de seguir estes passos. </li></ol> 2. Executando Counts capilares / quantificação de densidade capilar <ol><li> Em cada imagem, selecionar manualmente uma parte de um capilar bem definida usando o featur &quot;target objeto&quot;E para ser reconhecido como objectos a serem contados pelo programa. Em seguida, selecione uma pequena parte do fundo, usando o recurso de &quot;base&quot;, como uma referência para as áreas que precisam ser desconsiderada pelo algoritmo de contagem. Nota: A combinação desses destaques faz com que todos os capilares a ser destacado ignorando o ruído de fundo. A (contagem) protocolo de quantificação utiliza as funções do computador para diferenciar partes da imagem com base na cor e morfologia. </li><li> Use a função de contagem para contar instantaneamente todos os capilares na imagem com o equipamento de imagem. Definir o diâmetro mínimo de objectos contados a 5 pixels, a fim de evitar a contagem de ruído de fundo como capilares. </li><li> Para cada indivíduo, a contagem média de 3 - 4 imagens, a fim de se obter uma avaliação mais fiável. Nota: Por favor, consulte a Figura 3 em resultados representativos para um exemplo do que a imagem deve ser semelhante durante o processo de contagem. </li></ol&gt; 3. Criar e utilizar macros para automatizar Processamento de Imagem Nota: Para economizar tempo, macros podem ser criados a fim de executar automaticamente uma seqüência específica de processos em uma ou várias imagens. Estas sequências podem ser personalizados, a fim de fazer as modificações imagem mais rápido. Em essência, esses macros lembrar de como as imagens são processadas, e executar todas as etapas de forma rápida e sem entrada do usuário. Realizando conta com 12 imagens capilares leva este laboratório entre 20 a 30 minutos com as macros (2 a 3 minutos por imagem), em oposição a cerca de 8 minutos por imagem sem as macros. Por conseguinte, utilizar as macros é 3 a 5 vezes mais eficiente do que o processamento manualmente cada imagem individual. <ol><li> A fim de criar uma macro, selecione &quot;Gravar Macro&quot; e em uma imagem execute as etapas e processos desejado, conforme descrito nas etapas 1 e 2 acima. Nome da macro com base na qual a imagem de processamento etapas foram executadas para referência futura. Quando using a macro sobre as futuras imagens, basta clicar em &quot;Executar macro&quot; eo programa aplicará automaticamente as melhorias registadas para a imagem (s) desejada. Nota: Este laboratório usa uma macro para executar todos, mas um dos passos na Seção 1 dos métodos em poucos segundos. O único passo que requer entrada do usuário é escolher onde cortar a imagem, Passo 1.2. </li></ol>

<ol><li>Gronenschild, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automatic+assessment+of+skin+capillary+density%3A+proof+of+principle+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Semi-automatic assessment of skin capillary density: proof of principle and validation.</a> Microvasc Res. 90, 192-198 (2013).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

A capilaroscopia periungueal mostra promessa como uma ferramenta clinicamente útil no futuro para vários oncologia, cardiovascular, e aplicações de doenças reumatológicas. O processo de aquisição de imagem é bastante consistente entre os pesquisadores, ainda existem atualmente vários métodos de processamento e análise de imagem. Os métodos incluem atualmente contagens informatizados e manuais capilares. Contagens manuais são problemáticas como eles são demorados e sujeitos a subjetividade do usuário e fadiga. Métodos ba...

Imaging microvascular é um campo de rápido crescimento, com muitos potenciais aplicações clínicas. 2 Por exemplo, os oncologistas estão usando imagens de microvasos para determinar a extensão da angiogénese tumoral, produzindo informações valiosas sobre o estado do tumor e insights sobre possíveis opções de tratamento. 3 4 Contudo, capilaroscopia periungueal é talvez a forma eficiente e amplamente aplicáveis ​​maioria de custo da imagiologia microvascular. Os pesquisadores estão usando o vídeo capilaroscopia periungueal para estudar as taxas de fluxo de sangue e investigar a morfologia capilar. 5 6 Ambos vídeo e de imagem estática capilaroscopia periungueal são adjuntos para cuidar de diagnóstico e tratamento de fenômeno e várias doenças do tecido conjuntivo de Raynaud, como a esclerose sistêmica. 2 A capilaroscopia periungueal tem várias aplicações potenciais cardiovasculares também. A pesquisa atual sugere usando capilaroscopia periunguealque diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2 pacientes apresentam uma elevada prevalência de morfologia capilar anormal, ainda têm densidades capilares inalteradas em comparação com indivíduos não-diabéticos. 7-8 Capilaroscopia também tem sido estudada experimentalmente em hipertensão. Rarefação capilar estrutural que conduz a uma reduzida densidade capilar tem sido demonstrada em indivíduos hipertensos quando comparados com indivíduos não-hipertensos. 9-10 Em contraste com estes pacientes hipertensos mais velhos que apresentam rarefação estrutural, a pesquisa mais recente tem demonstrado que (idade 40 e acima de média) pacientes hipertensos mais jovens (idade média de menos de 40 anos de idade) têm rarefação funcional sem rarefação estrutural. 11 Isto sugere que a rarefação funcional ocorre antes e pode evoluir ao longo do tempo a rarefação estrutural. Curiosamente, os pacientes hipertensos tratados com drogas anti-hipertensivas específicas, tais como perindopril / indapamida exibido normaal densidade capilar e função endotelial após o tratamento, enquanto aqueles tratados com ACE (conversora da angiotensina-enzima) inibidores ou diuréticos manteve uma baixa densidade capilar apesar do controle da pressão arterial comparável. 12 Isto sugere que alguns medicamentos anti-hipertensivos podem normalizar a densidade capilar, invertendo o capilar rarefação causada por hipertensão. Além disso, outros pesquisadores demonstraram que uma redução no consumo de sal leva à reversão de ambos rarefação capilar funcional e estrutural em indivíduos hipertensos 13. Apesar das várias aplicações clínicas potenciais desta tecnologia, há pouca padronização da técnica para quantificar imagens densidade capilar. 2 Até o momento, os pesquisadores descobriram que os resultados de densidade capilar são reprodutíveis tanto intra-observador e inter-observador perspectiva apenas se o exato mesma área está sendo contado cada vez que 1,14 15. </sup&gt; De nota, os pesquisadores anteriores já largamente executada contagens capilares manualmente usando a olho nu, 9 16 17 18, que é um processo lento e subjetivo. , Baseados em computador algoritmos padronizados para quantificação de imagens capilares, teoricamente, fornecer uma análise de dados mais eficiente e reprodutível com menos subjetividade, facilitando aplicações clínicas da capilaroscopia. Alguns pesquisadores têm realmente usado programas baseados em computador para quantificar os dados a partir das cutículas imagens capilaroscópicos. 1,6 19 20 No entanto, apenas uma publicação a data descreve a confiabilidade de um programa de software complexo disponíveis para quantificar dados capilaroscópicas, 1 e este programa é complicada como anteriormente mencionado acima pela exigência de contar no mesmo campo visual exata. Aqui, nós apresentamos, um protocolo simples para a quantificação fiável capilares utilizando um algoritmo normalizado que permitea utilização de vários campos visuais. A utilização de vários campos visuais não só simplifica o processo, mas também permite a avaliação da variação biológica normal em contagem capilar. O objetivo deste estudo é descrever um algoritmo baseado em computador reprodutível e eficiente que padroniza o processo de quantificação capilar. Embora estes métodos não são totalmente automatizados que exigem entrada muito pouco do usuário e fornecer a quantificação rápida e confiável das imagens.

<table><tbody><tr><td>Image-Pro Premier</td><td>Media Cybernetics, Inc</td><td>9.1</td><td>Software de processamento de imagem</td></tr></tbody></table>

um método computadorizado reprodutível para quantificação da densidade capilar usando capilaroscopia periungueal

A Reproducible Computerized Method for Quantitation of Capillary Density using Nailfold Capillaroscopy

A capilaroscopia é uma metodologia não-invasiva, eficaz, relativamente barata e fácil de aprender para visualizar diretamente a microcirculação. A técnica capilaroscopia pode fornecer insights sobre microvascular saúde de um paciente, levando a uma variedade de dermatológica potencialmente valiosa, oftalmológica, aplicações clínicas reumatológicas e cardiovasculares. Além disso, o crescimento de tumores pode ser dependente da angiogénese, que pode ser quantificada medindo a densidade de microvasos no interior do tumor. No entanto, não há atualmente pouca ou nenhuma padronização de técnicas, e apenas uma publicação a data relata a confiabilidade de um disponíveis atualmente algoritmos complexos baseados computador para quantificar dados capilaroscópicas. 1 Este artigo descreve um algoritmo novo, mais simples, confiável, capilar padronizado contagem para quantificar dados capilaroscópicas das cutículas. Um algoritmo capilaroscopia simples, reprodutível informatizado como este iria facilitar maisuso generalizado da técnica entre pesquisadores e clínicos. Muitos pesquisadores atualmente analisar imagens capilaroscópicas com a mão, promovendo a fadiga do usuário e da subjetividade dos resultados. Este artigo descreve um romance, easy-to-use automatizado algoritmo de processamento de imagem, além de um algoritmo de contagem reprodutível, semi-automatizado. Este algoritmo permite a análise de imagens em minutos, reduzindo a subjetividade; apenas uma quantidade mínima de tempo de treinamento (em nossa experiência, a menos de 1 hora) é necessário para aprender a técnica.

O objetivo deste procedimento de processamento de imagem é diferenciar os capilares a partir da imagem de fundo para que eles possam ser quantificados com precisão. Ambos processamento de imagem incompleta e processamento de imagem excessiva são prejudiciais para a capacidade do programa para quantificar os capilares. Como pode ser visto na Figura 3, o processamento de imagem incompleta faz com que os capilares difícil de distinguir do fundo. É fundamental que o usuário seja capaz de di...

A capilaroscopia é uma metodologia não invasiva, eficiente, relativamente barata e fácil de aprender para visualizar diretamente os capilares na microcirculação. No entanto, apenas uma publicação até o momento descreve a confiabilidade de um programa de software complexo disponível para quantificar dados de capilaroscopia. Aqui, apresentamos um protocolo simples e confiável para quantificar capilares usando um algoritmo padronizado.

Um método computadorizado reprodutível para quantificação da densidade capilar usando capilaroscopia periungueal

Capillaroscopy is a non-invasive, efficient, relatively inexpensive and easy to learn methodology for directly visualizing the microcirculation. The ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar o número de capilares por milímetro quadrado na área da pele diretamente abaixo da cutícula da unha. Isso é realizado primeiramente capturando uma imagem em preto e branco do leito ungueal abaixo da cutícula. O segundo passo é importar a imagem para um programa de processamento de imagens no computador.Em seguida, as imagens são manipuladas para melhor visualizar os capilares; o passo final consiste em identificar e contar todos os capilares dentro de um milímetro quadrado. Em última análise, a manipulação de imagens é utilizada para mostrar a quantidade e a morfologia dos capilares de um indivíduo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área cardiovascular, como a forma pela qual a hipertensão, o diabetes e outras doenças podem afetar a microcirculação.Utilizando uma câmera digital monocromática, obtenha imagens capilares conforme descrito anteriormente. Em seguida, capture imagens de calibração de uma régua com marcações milimétricas usando a mesma câmera e condições de imagem de ampliação utilizadas para obter as imagens capilares. Importe a imagem da régua para o programa de imagem do computador e meça o número de pixels em uma linha de um milímetro na fotografia da régua.Anote este número e calcule a quantidade de pixels presentes em uma região de um milímetro por um milímetro. Em seguida, abra uma das imagens de capilares, escureça os capilares e clareie o fundo ajustando a imagem por meio de um histograma de melhor ajuste. Depois, utilize o comando criar ROI no menu suspenso para criar uma região de interesse de um milímetro por um milímetro na parte superior da tela.Arraste e posicione a região de interesse no local com os laços capilares mais nítidos. Certifique-se de que a região de interesse seja colocada de modo que o ápice dos laços capilares esteja localizado no topo da região. A chave para a reprodutibilidade e padronização desta etapa do protocolo é o posicionamento adequado da caixa de região de interesse de um milímetro quadrado.Uma boa regra geral para manter a padronização é posicionar a caixa no ápice ou na ponta dos laços capilares da imagem. Uma vez corretamente posicionada, clique na ROI e depois clique em recortar no menu suspenso que aparece; em seguida, aplique achatamento à imagem para que todos os ajustes futuros sejam uniformemente aplicados. Em seguida, aumente o contraste da imagem para 75, de modo que os capilares sejam visualizados ao máximo.Também desfaça o granulado da imagem para suavizar as bordas dos capilares. Finalize o contraste da imagem ajustando o histograma ao modelo de melhor ajuste, de modo que os capilares fiquem pretos e o fundo branco. Em cada imagem, selecione manualmente uma parte de um capilar bem definido usando a função de objeto-alvo para ser reconhecida como objetos a serem contados pelo programa.Em seguida, selecione uma pequena parte do fundo usando a função de fundo como referência para áreas que devem ser desconsideradas pelo algoritmo de contagem. Defina o diâmetro mínimo dos objetos contados como cinco pixels para evitar a contagem de ruídos de fundo como capilares. Em seguida, utilize a função de contagem para contar instantaneamente todos os capilares na imagem de cada indivíduo.Conte a média de três a quatro imagens para obter uma avaliação mais confiável. Para economizar tempo, crie uma macro para executar automaticamente uma sequência específica de processos em uma ou mais imagens, selecionando primeiro a opção gravar macro e nomeando-a com base nas etapas e processos realizados e descritos neste vídeo. Em seguida, realize os passos de manipulação da imagem enquanto a macro estiver gravando.Ao usar a macro em imagens futuras, basta clicar em executar macro e o programa aplicará automaticamente os aprimoramentos gravados às imagens desejadas. A única etapa que exige entrada do usuário é escolher onde recortar a imagem. Uma imagem processada de forma ideal pode ser contada em até 30 segundos e distingue claramente os capilares do fundo, bem como os capilares individuais entre si.A imagem final aprimorada é mostrada aqui. A contagem total determinada para esta imagem foi de 54 capilares por milímetro quadrado. Uma vez dominada, esta técnica pode ser usada para quantificar e manipular 12 imagens em 20 minutos.

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Descrevemos a avaliação de um coeficiente de determinação entre a densidade de perfusão do plexo capilar superficial parafoveal para identificar a contribuição de embarcações maiores que capilares à densidade de perfusão.

Avaliação da Contribuição Capilar e Outras Embarcações para Densidade de Perfusão Macular Medida com Angiografia de Coerência Óptica

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

A doença cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo. A calcificação vascular contribui substancialmente para a carga de morbidade e mortalidade cardiovascular. Este protocolo descreve um método simples para quantificar a precipitação de cálcio mediada por células musculares lisas vasculares in vitro por imagem fluorescente.

Um método semi-automatizado e reprodutível de base biológica para quantificar a deposição de cálcio in vitro

A capilaroscopia é uma ferramenta acessível para visualização direta, barata e não invasiva da microvasculatura. O objetivo deste protocolo é permitir que os pesquisadores usem a capilaroscopia para a visualização da morfologia microvascular periférica nos leitos ungueais de camundongos.

Visualização não invasiva da morfologia microvascular do leito ungueal em camundongos usando capilaroscopia

Aprenda a quantificar capilares por milímetro quadrado usando capilaroscopia periungueal e algoritmo computadorizado. Este método reprodutível auxilia pesquisadores a estudar microcirculação em doenças cardiovasculares.

Um método computadorizado reprodutível para quantificação da densidade capilar usando capilaroscopia periungueal

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