Um método computadorizado reprodutível para quantificação da densidade capilar usando capilaroscopia periungueal
October 27th, 2015
A capilaroscopia é uma metodologia não invasiva, eficiente, relativamente barata e fácil de aprender para visualizar diretamente os capilares na microcirculação. No entanto, apenas uma publicação até o momento descreve a confiabilidade de um programa de software complexo disponível para quantificar dados de capilaroscopia. Aqui, apresentamos um protocolo simples e confiável para quantificar capilares usando um algoritmo padronizado.
O objetivo geral deste procedimento é quantificar o número de capilares por milímetro quadrado na área da pele diretamente abaixo da cutícula ungueal. Isso é feito primeiro tirando uma foto monocromática do leito da unha abaixo da cutícula. O segundo passo é importar a imagem para um programa de imagem de computador.
Em seguida, as imagens são manipuladas Para melhor visualizar os capilares, a etapa final é identificar e contar todos os capilares dentro de um milímetro quadrado. Em última análise, a manipulação de imagens é usada para mostrar a quantidade e a morfologia dos capilares de um indivíduo. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo cardiovascular, como hipertensão, diabetes e outras doenças podem afetar a microcirculação.
Usando uma câmera digital monocromática, obtenha imagens capilares conforme descrito anteriormente. Em seguida, tire imagens de calibração de um ridículo com marcações milimétricas usando as mesmas condições de câmera e imagem de ampliação que foram usadas para obter as imagens capilares. Importe a imagem do ridículo para o programa de imagem do computador e meça o número de pixels em uma linha de um milímetro na fotografia da régua.
Anote esse número e calcule o número de pixels que estão em uma região de um milímetro por um milímetro. Em seguida, abra uma das imagens capilares, escureça os capilares e clareie o fundo ajustando a imagem usando um histograma de melhor ajuste. Em seguida, use o comando create ROI no menu suspenso para criar uma região de interesse de um milímetro por um milímetro na parte superior da tela.
Arraste e posicione a região de interesse para o local com os loops capilares mais claros. Certifique-se de que a região de interesse seja colocada de forma que o ápice das alças capilares esteja localizado no topo da região. A chave para a reprodutibilidade e padronização desta etapa do protocolo é a colocação adequada da caixa de região de interesse de um milímetro quadrado.
Uma boa regra para manter a padronização é colocar a caixa no ápice ou na ponta das alças capilares da imagem. Uma vez posicionado corretamente, clique no ROI e, em seguida, clique em cortar no menu suspenso que aparece e, em seguida, nivele a imagem para que todos os ajustes futuros de imagem sejam aplicados uniformemente à imagem. Em seguida, aumente o contraste da imagem para 75 para que os capilares sejam visualizados ao máximo.
Também limpe a imagem para suavizar as bordas dos capilares. Finalize o contraste da imagem ajustando o histograma para o modelo de melhor ajuste para que os capilares fiquem pretos e o fundo branco. Em cada imagem, selecione manualmente uma parte de um capilar bem definido usando o recurso de objeto alvo a ser reconhecido como objetos a serem contados pelo programa.
Em seguida, selecione uma pequena parte do plano de fundo usando o recurso de plano de fundo como referência para áreas que precisam ser desconsideradas pelo algoritmo de contagem. Defina o diâmetro mínimo dos objetos contados para cinco pixels para evitar a contagem de ruído de fundo como capilares. Em seguida, use a função de contagem para contar instantaneamente todos os capilares na imagem para cada indivíduo.
Conte a média de três a quatro imagens para obter uma avaliação mais confiável. Para economizar tempo, crie uma macro para executar automaticamente uma sequência específica de processos em uma ou mais imagens, selecionando primeiro a macro de gravação para nomear a macro com base nas etapas e processos executados e descritos neste vídeo. Em seguida, execute as etapas de manipulação de imagem enquanto a macro está gravando.
Ao usar a macro em fotos futuras, basta clicar em executar macro e o programa aplicará automaticamente os aprimoramentos gravados às imagens desejadas. A única etapa que requer a entrada do usuário é escolher onde cortar a imagem. Uma imagem processada de forma ideal pode ser contada em 30 segundos e distingue claramente os capilares do fundo, bem como os capilares individuais uns dos outros.
A imagem aprimorada final é mostrada aqui. A contagem total determinada para esta imagem foi de 54 capilares por milímetro quadrado Uma vez dominada. Essa técnica pode ser usada para quantificar e manipular 12 imagens em 20 minutos.
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Visão Geral
A capilaroscopia é um método não invasivo para visualizar capilares na microcirculação. Este artigo apresenta um protocolo confiável para quantificar capilares usando um algoritmo padronizado.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microcirculação
- Visualização capilar
- Pesquisa cardiovascular
Fundo
- A capilaroscopia permite a observação direta dos capilares.
- Estudos anteriores têm dados limitados de confiabilidade sobre software para quantificação capilar.
- Este método é crucial para entender a microcirculação em várias doenças.
- Quantificar capilares pode fornecer insights sobre condições como hipertensão e diabetes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo simples e confiável para quantificação capilar.
- Aprimorar a compreensão da morfologia e quantidade capilar.
- Abordar lacunas nas metodologias existentes para análise capilar.
Métodos Usados
- Capturar uma imagem monocromática do leito da unha abaixo da cutícula.
- Importar a imagem para um programa de imagem de computador.
- Manipular a imagem para melhor visualização dos capilares.
- Identificar e contar capilares dentro de uma área definida (1 mm²).
Principais Resultados
- O protocolo permite uma quantificação precisa dos capilares.
- A manipulação da imagem melhora a visibilidade da morfologia capilar.
- Este método pode ser aplicado para estudar os efeitos de doenças na microcirculação.
- Os resultados podem informar a pesquisa cardiovascular e práticas clínicas.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido é confiável e fácil de implementar.
- Ele fornece dados valiosos para entender a microcirculação.
- Este método pode auxiliar na avaliação de várias condições cardiovasculares.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Standardized quantitation of capillary density using computerized nailfold capillaroscopy addresses a critical need for reproducible microvascular assessment in early discovery and translational research. This method reduces subjectivity and user fatigue, enabling reliable, quantitative evaluation of microcirculation relevant to disease modeling and target validation. Its reproducibility and efficiency support robust decision-making at key inflection points in cardiovascular and metabolic disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables objective quantitation of microvascular changes for hypothesis testing in disease models.
- Supports functional target validation by providing standardized microcirculation metrics.
- Facilitates mechanistic de-risking by reducing operator bias in capillary density assessment.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage in vascular and metabolic research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible image-based assays for downstream compound screening.
- Standardizes capillary density measurement, enhancing assay reproducibility and scalability.
- Delivers quantitative outputs suitable for cross-study and cross-site comparison.
- Enables rapid, semi-automated analysis to support high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microvascular quantitation with disease-relevant endpoints for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent measurement protocols.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust microcirculation data.
- Reduces translational ambiguity by linking quantitative capillary metrics to disease phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This computerized capillaroscopy method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early hypothesis testing and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Facilitates reproducible hypothesis testing and pathway clarification in microvascular research.
- Screening: Provides standardized, quantitative capillary density outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables objective, statistical comparison of microvascular changes across experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity from in vitro to in vivo models when microcirculation is a relevant endpoint.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, semi-automated workflow adaptable across disease models and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microvascular studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and rapid quantitation with minimal training requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of vascular and metabolic disease programs.
Implementation Considerations
- Requires basic expertise in digital imaging and capillaroscopy interpretation.
- Needs access to monochrome digital cameras and compatible image analysis software.
- Demands cross-team standardization of image acquisition and ROI placement for reproducibility.
- Adaptable to various disease models where microcirculation is a relevant endpoint.
- Manual ROI selection remains a potential source of variability and requires attention to protocol adherence.
