Um método computadorizado reprodutível para quantificação da densidade capilar usando capilaroscopia periungueal
27 de outubro de 2015
A capilaroscopia é uma metodologia não invasiva, eficiente, relativamente barata e fácil de aprender para visualizar diretamente os capilares na microcirculação. No entanto, apenas uma publicação até o momento descreve a confiabilidade de um programa de software complexo disponível para quantificar dados de capilaroscopia. Aqui, apresentamos um protocolo simples e confiável para quantificar capilares usando um algoritmo padronizado.
O objetivo geral deste procedimento é quantificar o número de capilares por milímetro quadrado na área da pele diretamente abaixo da cutícula da unha. Isso é realizado primeiramente capturando uma imagem em preto e branco do leito ungueal abaixo da cutícula. O segundo passo é importar a imagem para um programa de processamento de imagens no computador.
Em seguida, as imagens são manipuladas para melhor visualizar os capilares; o passo final consiste em identificar e contar todos os capilares dentro de um milímetro quadrado. Em última análise, a manipulação de imagens é utilizada para mostrar a quantidade e a morfologia dos capilares de um indivíduo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área cardiovascular, como a forma pela qual a hipertensão, o diabetes e outras doenças podem afetar a microcirculação.
Utilizando uma câmera digital monocromática, obtenha imagens capilares conforme descrito anteriormente. Em seguida, capture imagens de calibração de uma régua com marcações milimétricas usando a mesma câmera e condições de imagem de ampliação utilizadas para obter as imagens capilares. Importe a imagem da régua para o programa de imagem do computador e meça o número de pixels em uma linha de um milímetro na fotografia da régua.
Anote este número e calcule a quantidade de pixels presentes em uma região de um milímetro por um milímetro. Em seguida, abra uma das imagens de capilares, escureça os capilares e clareie o fundo ajustando a imagem por meio de um histograma de melhor ajuste. Depois, utilize o comando criar ROI no menu suspenso para criar uma região de interesse de um milímetro por um milímetro na parte superior da tela.
Arraste e posicione a região de interesse no local com os laços capilares mais nítidos. Certifique-se de que a região de interesse seja colocada de modo que o ápice dos laços capilares esteja localizado no topo da região. A chave para a reprodutibilidade e padronização desta etapa do protocolo é o posicionamento adequado da caixa de região de interesse de um milímetro quadrado.
Uma boa regra geral para manter a padronização é posicionar a caixa no ápice ou na ponta dos laços capilares da imagem. Uma vez corretamente posicionada, clique na ROI e depois clique em recortar no menu suspenso que aparece; em seguida, aplique achatamento à imagem para que todos os ajustes futuros sejam uniformemente aplicados. Em seguida, aumente o contraste da imagem para 75, de modo que os capilares sejam visualizados ao máximo.
Também desfaça o granulado da imagem para suavizar as bordas dos capilares. Finalize o contraste da imagem ajustando o histograma ao modelo de melhor ajuste, de modo que os capilares fiquem pretos e o fundo branco. Em cada imagem, selecione manualmente uma parte de um capilar bem definido usando a função de objeto-alvo para ser reconhecida como objetos a serem contados pelo programa.
Em seguida, selecione uma pequena parte do fundo usando a função de fundo como referência para áreas que devem ser desconsideradas pelo algoritmo de contagem. Defina o diâmetro mínimo dos objetos contados como cinco pixels para evitar a contagem de ruídos de fundo como capilares. Em seguida, utilize a função de contagem para contar instantaneamente todos os capilares na imagem de cada indivíduo.
Conte a média de três a quatro imagens para obter uma avaliação mais confiável. Para economizar tempo, crie uma macro para executar automaticamente uma sequência específica de processos em uma ou mais imagens, selecionando primeiro a opção gravar macro e nomeando-a com base nas etapas e processos realizados e descritos neste vídeo. Em seguida, realize os passos de manipulação da imagem enquanto a macro estiver gravando.
Ao usar a macro em imagens futuras, basta clicar em executar macro e o programa aplicará automaticamente os aprimoramentos gravados às imagens desejadas. A única etapa que exige entrada do usuário é escolher onde recortar a imagem. Uma imagem processada de forma ideal pode ser contada em até 30 segundos e distingue claramente os capilares do fundo, bem como os capilares individuais entre si.
A imagem final aprimorada é mostrada aqui. A contagem total determinada para esta imagem foi de 54 capilares por milímetro quadrado. Uma vez dominada, esta técnica pode ser usada para quantificar e manipular 12 imagens em 20 minutos.
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Visão Geral
A capilaroscopia é um método não invasivo para visualizar capilares na microcirculação. Este artigo apresenta um protocolo confiável para quantificar capilares utilizando um algoritmo padronizado.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microcirculação
- Visualização capilar
- Pesquisa cardiovascular
Contexto
- A capilaroscopia permite a observação direta dos capilares.
- Estudos anteriores possuem dados limitados sobre a confiabilidade de softwares para a quantificação capilar.
- Este método é essencial para compreender a microcirculação em diversas doenças.
- A quantificação de capilares pode fornecer informações sobre condições como hipertensão e diabetes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo simples e confiável para a quantificação capilar.
- Aprimorar o entendimento sobre a morfologia e a quantidade de capilares.
- Abordar lacunas nas metodologias existentes para análise capilar.
Métodos Utilizados
- Capturar uma imagem em preto e branco da base da unha abaixo da cutícula.
- Importar a imagem para um programa de processamento de imagens no computador.
- Manipular a imagem para melhorar a visualização dos capilares.
- Identificar e contar os capilares dentro de uma área definida (1 mm²).
Resultados Principais
- O protocolo permite a quantificação precisa de capilares.
- A manipulação de imagens melhora a visibilidade da morfologia capilar.
- Este método pode ser aplicado para estudar os efeitos de doenças na microcirculação.
- Os resultados podem contribuir para a pesquisa cardiovascular e práticas clínicas.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido é confiável e fácil de implementar.
- Ele fornece dados valiosos para a compreensão da microcirculação.
- Este método pode auxiliar na avaliação de diversas condições cardiovasculares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação padronizada da densidade capilar utilizando capilaroscopia ungueal computadorizada atende a uma necessidade crítica de avaliação reprodutível da microvasculatura na descoberta precoce e na pesquisa translacional. Este método reduz a subjetividade e a fadiga do operador, permitindo uma avaliação confiável e quantitativa da microcirculação relevante para modelagem de doenças e validação de alvos. Sua reprodutibilidade e eficiência apoiam decisões robustas em pontos críticos dos fluxos de pesquisa de doenças cardiovasculares e metabólicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a quantificação objetiva de alterações microvasculares para testes de hipóteses em modelos de doenças.
- Apoia a validação funcional de alvos ao fornecer métricas padronizadas da microcirculação.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao diminuir o viés do operador na avaliação da densidade capilar.
- Aprimora a confiança preditiva para triagem inicial de portfólios em pesquisas vasculares e metabólicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara ensaios baseados em imagens validados e reprodutíveis para triagem de compostos em etapas subsequentes.
- Padroniza a medição da densidade capilar, aumentando a reprodutibilidade e a escalabilidade do ensaio.
- Fornece resultados quantitativos adequados para comparação entre estudos e entre diferentes locais.
- Permite análise rápida e semi-automatizada para apoiar a preparação para triagem de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha a quantificação microvascular com pontos finais relevantes para a doença no desenvolvimento de biomarcadores translacionais.
- Garante continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, permitindo protocolos de medição consistentes.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados robustos de microcirculação.
- Reduz ambiguidades translacionais ao associar métricas quantitativas de capilares a fenótipos da doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método computadorizado de capilaroscopia integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico, apoiando tanto a verificação inicial de hipóteses quanto o alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Biologia da Descoberta: Facilita testes de hipóteses reprodutíveis e a clarificação de vias na pesquisa microvascular.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas de densidade capilar para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Permite comparação objetiva e estatística de alterações microvasculares entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores e a continuidade de modelos in vitro a in vivo quando a microcirculação é um desfecho relevante.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho escalável e semiautomatizado, adaptável a diferentes modelos de doenças e equipes de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos microvasculares.
- Valor Operacional: Oferece quantificação padronizada, reprodutível e rápida com requisitos mínimos de treinamento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos e a eficiência do capital ao fornecer pontos finais robustos e quantitativos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas para doenças vasculares e metabólicas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimento básico em imagem digital e interpretação de capilaroscopia.
- Necessita de acesso a câmeras digitais monocromáticas e software de análise de imagem compatível.
- Exige padronização entre equipes na aquisição de imagens e posicionamento de regiões de interesse (ROI) para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos modelos de doenças em que a microcirculação é um desfecho relevante.
- A seleção manual da ROI permanece como uma fonte potencial de variabilidade e exige atenção à adesão ao protocolo.
