Rotulagem celular e Segmentação com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar nanopartículas de óxido de ferro super paramagnéticas e usar essas partículas para rotular células para aplicações de direcionamento e classificação magnética. Isso é feito sintetizando primeiro nanopartículas de magnetita de 10 nanômetros de diâmetro. O segundo passo é revestir as nanopartículas de magnetita com uma casca de 50 nanômetros de espessura de ácido polilático coglicólico ou PLGA.

Em seguida, as nanopartículas magnéticas são lavadas e liofilizadas. A etapa final é rotular as células com nanopartículas magnéticas para aplicações de direcionamento e classificação de células. Em última análise, a microscopia fluorescente é usada para mostrar o direcionamento de células marcadas com nanopartículas magnéticas dentro de campos magnéticos.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o direcionamento celular mediado por anticorpos, é que o direcionamento magnético da célula é altamente específico e controlável. As implicações dessa técnica se estendem à terapia para uma variedade de condições médicas, porque as células terapêuticas podem ser entregues ao local-alvo enquanto os locais fora do alvo são poupados. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é necessária uma atenção cuidadosa aos detalhes para obter nanopartículas puras e de alta qualidade.

Queríamos melhorar o direcionamento e a localização de células vivas dentro do corpo. Comece usando uma garrafa dressel para desgaseificar 500 mililitros de água deionizada borbulhando suavemente o gás nitrogênio por 30 minutos. Para configurar o aparelho de reação, coloque um balão de fundo redondo de 500 mililitros e três gargalos dentro de um aquecedor de manto ISO.

Em seguida, cubra um lado do pescoço com um septo de borracha e instale um condensador de refluxo no outro. Passe continuamente água fria pelo condensador para criar uma atmosfera inerte para a reação. Primeiro, perfure o septo de borracha dos frascos com agulha conectada a uma linha de gás nitrogênio.

Em seguida, perfure o septo do condensador com uma agulha conectada a um borbulhador para visualizar o fluxo de saída de gás. Em seguida, instale um pedal de lâmina no pescoço central com um adaptador de remo. Para manter a agitação constante da mistura de reação, conecte o eixo da lâmina a uma agitação suspensa montada em um suporte.

Purgue o frasco com gás nitrogênio e deixe o nitrogênio fluindo para o frasco a uma taxa baixa, mas detectável. Em seguida, remova o condensador de refluxo e adicione um grama de ferro, três cloretos, 612,5 miligramas de ferro, dois tetra de cloreto e 50 mililitros de água Degas. Substitua o condensador e agite a reação a 1000 RPM enquanto aquece a 50 graus Celsius.

Isso produzirá partículas de magnetita de 10 nanômetros de diâmetro. Quando a reação atingir 50 graus Celsius, use uma seringa para injetar 10 mililitros de hidróxido de amônio a 28% através do septo do frasco. À medida que a magnetita precipita, a solução deve ficar preta.

Remova o septo de borracha e a linha de gás e aqueça a reação a 90 graus Celsius. Em seguida, adicione um mililitro de ácido oleico ao frasco para revestir as nanopartículas e formar o gel de magnetita. Em seguida, recoloque o septo e a linha de gás no frasco e remova o condensador.

Desligue o fogo e mexa a reação a 500 RPM por duas horas. Depois de mexer, transvase o excesso de líquido enquanto segura as nanopartículas no fundo do frasco com um ímã forte. Para iniciar a purificação, primeiro dissolva o gel de magnetita em 40 mililitros de hexanos.

Despeje lentamente esta solução em um funil separatório contendo 40 mililitros de água Degas e gire suavemente o funil por cinco minutos. Depois de agitar a decantação da fração aquosa inferior, lavar a solução de magnetite mais duas vezes com água Degas de forma semelhante. Em seguida, transferir a solução de magnetite para um erlenmeyer.

Seque a solução adicionando várias espátulas de sulfato de sódio e agitando a mistura. Em seguida, aspire. Filtrar a mistura através de um micrómetro de papel de filtro.

Defina a temperatura do banho-maria de um evaporador rotativo para 50 graus Celsius com 24 graus Celsius de água circulando pelo condensador. Em seguida, transferir o filtrado para um balão de evaporação de 50 ml e evaporar os hexanos durante duas horas a uma velocidade de rotação moderada sob vácuo. Em frascos de vidro, colete o gel de magnetita em seis revestimentos de alíquota de 40 miligramas e a lavagem será feita em cada alíquota separadamente, adicione uma alíquota de gel junto com 40 mililitros de PLGA em acetato de etila em um béquer de plástico e sonice a mistura por 10 minutos.

Em seguida, adicione 80 mililitros de F1 27 onic ao béquer e emulsione imediatamente com um misturador em configuração alta por sete minutos. Essas nanopartículas agora são nanopartículas de óxido de ferro super paramagnéticas ou espionam diluir a solução com um litro de água deionizada e sonicar em uma capela por uma hora. Em seguida, coloque um ímã forte ao lado da solução e mexa suavemente a solução para coletar o espião no ímã.

Transvasar a solução aquosa, retendo as mudas S no copo. Lave os rebentos S três vezes com água fornicante a cada vez. Depois de todas as seis alíquotas terem sido revestidas e lavadas.

Colete os recortes S em um único frasco de vidro. Liofilize a solução espiã durante a noite em um liofilizador para se preparar para a marcação celular. Primeiro, suspenda o pyon em PBS na concentração de 40 miligramas por mililitro e sonice-os por 30 minutos.

Em seguida, adicione a solução a um frasco de células quase em confluência a uma concentração de cinco microlitros por mililitro de cultura de células. Média. Balance o frasco para distribuir uniformemente o Sion. Incubar as células durante 16 horas.

A 37 graus Celsius. Aspire suavemente o meio de cultura e lave as células duas vezes. Com o PBS, as células marcadas magneticamente agora podem ser usadas para experimentos.

Nanopartículas de magnetita com um diâmetro de 10 nanômetros podem ser feitas consistentemente agitando uma solução aquosa de ferro três cloreto e ferro dois cloreto tetra-hidrato a 50 graus Celsius e 1000 RPM microscopia eletrônica de transmissão ou TEM é o método preferido para determinar o tamanho das partículas revestindo as nanopartículas de magnetita com PLGA usando um emulsificante de alta velocidade de forma reprodutível resulta em PLGA, As mudas de magnetita S com um diâmetro de 120 nanômetros, microscopia eletrônica de varredura ou SEM são usadas para visualizar essas partículas. A incubação de células endoteliais de crescimento sanguíneo com pyon por 16 horas resulta em endocitose das nanopartículas usando TEM. As nanopartículas de magnetita PLGA podem ser visualizadas na célula ou armazenadas dentro de endossomos citoplasmáticos.

A carga de ferro nas células é alta o suficiente para alcançar a captura magnética de células viáveis para dispositivos médicos implantáveis ferromagnéticos. As células endoteliais marcadas magneticamente são atraídas por um stent ferromagnético a uma taxa mais alta do que um stent não magnético. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de lavar bem todos os artigos de vidro e equipamentos para maximizar a pureza e a segurança das nanopartículas Após este procedimento.

Outros métodos, como o direcionamento magnético de células, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais terapias médicas podem se beneficiar da entrega específica e controlada de células. Esta tecnologia de direcionamento magnético deve permitir o desenvolvimento de entrega celular focalizada para uma variedade de aplicações biomédicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar nanopartículas de óxido de ferro super paramagnéticas e usar essas partículas para rotular células para aplicações de direcionamento magnético.