Name: As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprenda a analisar a expressão de miRNA em tecidos clínicos de câncer de próstata usando PCR em tempo real e hibridização in situ com sondas de ácido nucleico bloqueado. Este protocolo simplificado permite quantificar e localizar biomarcadores em amostras FFPE arquivadas.

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Agradecemos ao Dr. Roger Erickson por seu apoio e assistência na preparação do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer, no Instituto Nacional de Saúde (Grant Número RO1CA177984; RO1CA138642), projeto de programa VA sobre o câncer de próstata (BX001604).

Foram obtidas amostras de câncer de próstata fresco congelado-fixada em formalina, embebidos em parafina (FFPE) ou a partir do SFVAMC. Amostras eram de pacientes com câncer de próstata submetidos à prostatectomia radical em SFVAMC. Termo de consentimento informado foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê UCSF em Pesquisa com Seres Humanos. Alternativamente, tecidos de câncer de próstata microarrays foram adquiridos a partir de fontes comerciais e utilizados para análises de miRNA por ISH. Informações clínico-patológico e acompanhamento para pacientes com câncer de próstata analisados ​​foram coletados. 1. As amostras de tecidos <ol><li> Cortar amostras de tecido da próstata câncer em 10 mm seções usando um micrótomo e mancha com H &amp; E seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Comente lâminas coradas para a identificação de focos de câncer de próstata, bem como epitélio glandular normal adjacente. Nota: A placa certificada patologista deve rever os slides H &amp; E manchada e maRK para o tumor e zonas normais. Use os slides marcados como guias nas seções subseqüentes para miRNA análises de tumor vs áreas normais. </li></ol> 2. miRNA expressão quantitativa Análises por PCR em tempo real Nota: Esse fluxo de trabalho envolve as seguintes etapas: Captura de Laser microdissection, isolamento de RNA total (incluindo miRNA e mRNA), ensaio de miRNAs maduros usando os ensaios de expressão TaqMan MicroRNA conforme detalhado nas seções seguintes. <ol><li> Extração de RNA <ol><li> Isolamento de miRNA de cancro da próstata tecidos FFPE <ol><li> Captura Laser microdissection (LCM) Nota: Siga as etapas 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 em um exaustor química. <ol><li> Preparar lâminas de tecido (10 mm seções) para LCM. Deparrafinize secções de tecido por imersão em xileno (2x), durante 10 min cada, em seguida, re-hidratar os tecidos através da incubação das lâminas durante 5 min cada em etanol graduado (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguido por destilada água(5 min). </li><li> Após reidratação, as secções com hematoxilina mancha durante 30 seg seguido de água. </li><li> Coloque tecidos em etanol graduado (70%, 95%, 90%, 80%, 70%) (5 min cada) e xileno (5 min). </li><li> Lâminas secas em um exaustor e, em seguida, colocar no instrumento LCM para microdissection. </li><li> Execute microdissecações com o Sistema de LCM de acordo com as instruções do fabricante 24. Uso patologista marcado lâminas como guias para a identificação de focos de cancro da próstata, bem como o tecido normal adjacente. Use o feixe de laser em uma pulsos 10-20 mm de diâmetro com uma potência de 70-90 mW. </li><li> Áreas de captura de interesse com pulsos de laser infravermelho em bonés LCM. Combinar células de 2-5 cápsulas para a extração de miRNA por amostra. Para garantir a integridade de ARN extraído, imediatamente processar células capturadas para extracção miARN. </li><li> Alternativamente, as células lisam em tampão de extracção de miARN (de acordo com o protocolo do fabricante) e STOre lisados ​​a -80 ºC. </li></ol></li><li> miARN Extracção e análises de LCM microdissecadas tecidos <ol><li> Extrair o ARN total a partir de tecidos FFPE microdissected utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. Nota: O rendimento de RNA de captura a laser miscrodissection é geralmente baixa. Portanto, o RNA é fluido em volumes baixos (20-30 ul) e utilizada para criação de perfil de expressão, utilizando ensaios de expressão de microRNA Taqman seguintes instruções do fabricante (também descrito na seção 2.2). Optimização de ARN de entrada para detecção por PCR em tempo real de miARNs maduras sugere que o 5 ul do ARN eluído é óptima para cada reacção de transcrição reversa miARN-específicos. Como um controle endógeno, RNU48 / RNU24 é usado. Para as reacções de controlo, 2 ul do ARN eluído foi utilizado para a reacção de transcrição reversa. </li></ol></li></ol></li><li> Isolamento de miRNA de cancro da próstata tecidos congelados <ol><li> Homogenhecer tecidos da próstata ressecados congelados por trituração dos tecidos em azoto líquido usando um almofariz e pilão. Transferir tecido homogeneizado para um tubo de microcentrífuga utilizando uma espátula arrefecida. Manter a argamassa / pilão e uma espátula à mesma temperatura por imersão em azoto líquido então homogeneizado de tecido pode ser facilmente transferido. </li><li> Adicionar comercial de isotiocianato de guanidina-fenol reagente (1 mL / 0,1 g de tecido) para o tecido homogeneizado e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Nota: Os tecidos homogeneizados em reagente isotiocianato de guanidina-f enol comercial pode ser armazenado a -80 ° C durante vários meses. </li><li> Adicionar clorofórmio ao homogeneizado (0,2 ml de clorofórmio / mL) e agitar vigorosamente durante 30 segundos. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 3-5 minutos, seguido por centrifugação a 10.000 xg durante 20 min a 4 ºC. </li><li> Transferir a fase aquosa superior a um tubo de 1,5 ml estéril fresco livre de RNase. </li><li> Adicionar um volume igual de álcool isopropílico. Misturar e incubar por 10 miN, à TA, seguido por centrifugação a 12.000 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar a ARN. </li><li> Aspirar o sobrenadante e lavar o sedimento de ARN com 1 mL de etanol a 70%. Centrifuga-se a 12000 xg durante 10 min a 4 ºC. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Sedimentos de RNA secar à temperatura ambiente durante 5-10 min. Dissolver RNA em 50-100 ul de água livre de nuclease. </li><li> Realizar quantificação de ARN utilizando um espectrofotómetro NanoDrop determinar a integridade de ARN e com um Bioanalyzer. Ajustar a concentração de ARN e 10 ng / ul. Use 10-50 ng RNA para miRNA- reação cDNA específico seguido por análises em tempo real PCR (Seção 2.2). </li></ol></li></ol></li><li> PCR quantitativa em tempo real para análises de expressão de miARN Nota: miARNs maduros ensaio utilizando um protocolo de duas etapas de RT-PCR tal como descrito abaixo. <ol><li> Transcrição Reversa (RT) <ol><li> Realizar a transcrição reversa de ARN a partir de ADNc utilizando um kit de transcrição reversa miARN em conformidade com as instruções do fabricante.Use de 10-50 ng de ARN total com miARN iniciador específico do kit MicroRNA Ensaios e RT. Use RNU48 / RNU24 / RNU6B como controles. Dilui-se ADNc de 1: 5 a 1:10 (dependendo da abundância de miARN analisados) e utilizar na detecção em tempo real de PCR tal como descrito no passo seguinte. </li></ol></li><li> PCR em tempo real para detecção de miRNA maduro <ol><li> Amplificar produtos de PCR de amostras de ADNc utilizando os ensaios MicroRNA com uma mistura mestre universal de modo rápido de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar amostras para RNU48 / RNU24 controle / RNU6B. Usar o método comparativo Ct (limiar de ciclo) para calcular as alterações relativas na expressão do gene no rápido tempo real do sistema de PCR. Analisar cada amostra em triplicado. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. miRNA expressão análises por hibridação in situ (ISH) <ol><li> Pré-tratamento de tecidos <ol><li> Corte 5 mm de blocos de tecido de câncer de próstata FFPE usando um micrótomo. </li><li&gt; Fix secções de tecido através da incubação das lâminas a 56 ° C durante 1 h. Nota: As lâminas podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante várias semanas para análises miARN. </li><li> Deparrafinize os tecidos por imersão das lâminas com xileno (2 x), durante 15 min cada. </li><li> Reidratar os tecidos através da incubação das lâminas durante 5 min cada em etanol graduado (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), seguido por água destilada (5 minutos). </li><li> Fixar as lâminas com paraformaldeído a 4% em PBS à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Lavam-se as lâminas com PBS (2x) à temperatura ambiente durante 5 min cada. </li><li> Tratar as lâminas com 10 ug / ml de Proteinase K a 37 ° C durante 10 min em tampão de proteinase K pré-aquecido (5 mM Tris-HCl pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl a 1 mM). </li><li> Seguindo o tratamento com proteinase-K, enxaguar as lâminas com 0,2% de glicina em PBS durante 30 segundos. </li><li> Lavagem das lâminas em PBS (1x) à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Fixar as lâminas com paraformaldeído 4% em PBS durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas comPBS durante 5 min. </li></ol></li><li> Hibridização <ol><li> Pré-hibridar as lâminas com solução de pré-hibridação durante 3-4 horas a 55 ° C numa câmara humidificada. Use lenços de laboratório de tecido embebido em formamida 50% / 50% 5x SSC para manter a câmara úmida. </li><li> Use 5 &#39;sondas marcadas com digoxigenina a uma concentração de 20-50 nM em tampão de hibridação. Diluir sonda específica para miRNA (20-50 nM) e sonda de controlo U6 pequeno RNA nuclear (20 nM), aquecer a 90 ºC durante 4 minutos, coloque-o no gelo, e adicionar ao gelo tampão de hibridação frio (2-4 ng / mL ). </li><li> Remoção da solução de pré-hibridação, adicionar solução de hibridação (sonda + tampão de hibridação, 100 ul por slide), incubar durante 12-16 horas a sonda de temperatura específicas de hibridação (temperatura = hibridação sonda-21 Tm ºC). Realizar hibridações em uma câmara humidificada (50% de formamida / 50% 5x SSC). </li></ol></li><li> Lavar Passos <ol><li> Lavam-se as lâminas com 2x SSC durante 10 min a 45 ºC. </li><li> Wash tele desliza com SSC 1,5x durante 10 minutos a 45 ºC. </li><li> Lavar as lâminas com SSC 0,2x (2x) a 37 ºC durante 20 minutos cada. </li><li> Incubar as lâminas com solução de bloqueio 1x durante 1-2 horas à temperatura ambiente </li></ol></li><li> Detecção <ol><li> Incubar as lâminas com 1: 100 PBS diluído anticorpo anti-digoxigenina conjugado AP-para 1-4 horas ou durante a noite a 4 ºC. </li><li> Lavam-se as lâminas com PBS (3x), temperatura ambiente, durante 10 min cada. </li><li> Lavar as lâminas (2x) com fosfatase alcalina de tampão (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20) à temperatura ambiente durante 5 min cada. </li><li> Incubar as lâminas em substrato BM roxo AP no escuro à temperatura ambiente durante 1-20 horas. </li><li> Lavar as lâminas com PBS contendo 0,1% de Tween-20 e de lavagem (2x) em água. </li><li> Montar as lâminas utilizando uma mídia de montagem aquosas e examinar ao microscópio. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm divulgações financeiras.

Neste artigo, descrevemos um fluxo de trabalho simplificado para criação de perfil de expressão de miRNA em FFPE arquivados ou tecidos clínicos de câncer de próstata fresco congelado. No cancro da próstata, diversos estudos sugerem um papel importante na iniciação da microARNs cancro da próstata, progressão e metástase. No entanto, resultados conflitantes são frequentemente obtidos em um determinado miRNA 22 desde a extração de miRNA e analisa métodos diferem amplamente. Em vista da evidência emergente apoiar...

O câncer de próstata é um tumor maligno masculino comumente diagnosticado que é uma das principais causas de mortalidade relacionada com câncer entre os homens. Nos EUA, uma 220,800 novos casos estimados e 27.540 mortes serão relatados em 2015 1. O câncer de próstata é uma doença heterogênea com doença altamente variável course- tumores podem ser indolente ou muito agressivo. Um desafio crítico no manejo clínico do câncer de próstata é representada pela inadequação dos atualmente utilizados métodos / biomarcadores para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento 2. Métodos de rastreio atuais incluem antígeno (PSA), em específico da próstata e um exame de toque retal (DRE), seguido de biópsias de próstata 3. Antígeno específico da próstata (PSA) é o biomarcador de câncer de próstata mais amplamente utilizado que revolucionou significativamente a gestão clínica e melhoria das taxas de sobrevivência 4. No entanto, devido às limitações inerentes de PSA incluindo lack de especificidade, o rastreio baseada em PSA levou a mais de diagnóstico e tratamento ao longo da doença. Em vista disso, os esforços intensivos estão sendo direcionados para a busca de biomarcadores de câncer de próstata alternativos, especialmente aqueles que podem prever a agressividade da doença e tomar melhores decisões de tratamento 4,5. Ao longo dos últimos anos, microRNAs (miRNAs) surgiram como promissoras biomarcadores de câncer de próstata suplentes. Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe evolutivamente conservadas de pequenos RNAs não-codificantes que suprimem a expressão gênica pós-transcricionalmente através de interacções específicas para a sequência com os 3&#39;- não traduzidas (UTRs regiões) de alvos de RNAm cognatos. Estima-se que&gt; 60% de mRNAs são alvos de miARNs 6 conservada. miRNA genes estão localizados em regiões intergénicas ou dentro de exões intrões ou de proteína / proteína não-codificantes genes 7. Estes genes são preferencialmente transcrito pela ARN-polimerase II em primamiRNAs ry (pri-miRNAs, vários quilobases de comprimento) que as estruturas secundárias de loop haste em forma de forma hairpin. Estes miRNAs pri-são transformados em miRNAs precursoras (pré-miRNAs, 60-75 nucleótidos de comprimento) que são exportados para o citoplasma e novamente transformadas em miRNAs maduros (18-25 nucleótidos de comprimento) 8-10. miARNs regular processos celulares chave, incluindo a proliferação, desenvolvimento, diferenciação e apoptose 11. Estudos sugerem uma desregulação generalizada de perfis de expressão de miARN em várias malignidades humanas, incluindo cancro da próstata 12-15. perfis de expressão de miARN têm sido relatados para ser amplamente desregulado no cancro da próstata primário e metastático. MiRNA expressão alterada têm sido relacionados com a progressão do câncer de próstata, agressividade e recorrência destacando o potencial prognóstico de miRNAs 12,14,16-19. Um crescente corpo de evidências indicam que os miRNAs desempenham papéis importantes mecanicistas na iniciação do câncer de próstata, o desenvolvimento, o progressoião e metástase. No geral, os miRNAs estão emergindo como biomarcadores alternativas promissoras para o diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata que podem distinguir entre tecidos e ajuda normais e cancerosas na estratificação de tumores de próstata 12. Além disso, os miRNAs são alvos importantes para o desenvolvimento de terapias eficazes contra o câncer de próstata 20. Devido ao seu pequeno tamanho e resistência à actividade da RNase endógena, miARNs biomarcadores são estáveis ​​que podem ser facilmente detectadas em tecidos fixados em formalina 21 e 22 em biópsias da próstata. Além disso, os perfis de expressão miARNs foram comparadas em tecidos congelados e fixados em formalina e foram encontrados para ser fortemente correlacionada 21. No entanto, a expressão miRNA perfis em tecidos clínicos de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O desenvolvimento de miRNAs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata fortemente reliES na sua detecção precisa em tecidos clínicos. Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho simplificado utilizado em nosso laboratório para a expressão miRNA de perfis FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado. Nós empregar uma combinação de PCR quantitativo em tempo real e a hibridização in situ para miARN análises de amostras clínicas, com a ex-rendendo mais informações quantitativas e o último para visualizar a expressão diferencial de biomarcadores potenciais miARN em uma variedade de tecidos. Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e tecidos da próstata congelados, analisa expressão por Taqman-sonda baseada miRNA RT-PCR e miRNA in situ utilizando técnica de hibridização de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) à base de sondas 23. Sondas à base de LNA oferecem maior sensibilidade e especificidade em relação ao ADN ou RNA-sondas base e permite a detecção robusta de todas as seqüências de miRNA, independentemente do seu conteúdo GC e também permitir que discriminação de famílias de miARN. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA), com este último que oferece o potencial para acelerar miARN descoberta biomarcador.

<table><tbody><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix para LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternativamente, o sistema Arcutus Xt da Life Technolgies pode ser usado.&nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>Kit miRNeasy FFPE&nbsp;</td>Sistema de PCR em tempo real <td>rápido Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500</td>Kit <td>de</td> Transcrição Reversa de MicroRNA Taqman 4351106 <td></td>da <td>Applied Biosystems/ Life</td></tr><tr><td>Technologies&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR master mix&nbsp;</td>Sonda LNA com etiqueta DIG <td>da</td> <td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td> 4352042 <td></td></tr><tr><td>para U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Substrato AP roxo</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Solução de pré-hibridização&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>Solução de hibridização&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>Solução de bloqueio&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>AP-conjugado anticorpo anti-digoxigenina</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem aquoso&nbsp;</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>H-5501&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (reagente de isotiocianato de guanidina-fenol)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxilina</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosina&nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

as análises de expressão de mirna no câncer de próstata tecidos clínicos

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Um desafio crucial no cancro da próstata (PCA) manejo clínico é representada pela inadequação dos biomarcadores atualmente utilizados para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento. Nos últimos anos, microARNs (miARNs) surgiram como biomarcadores alternativos promissores para o diagnóstico e prognóstico do cancro da próstata. No entanto, o desenvolvimento de miARNs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata depende fortemente de sua detecção precisa em tecidos clínicos. analisa miRNA em amostras clínicas de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O objetivo deste artigo é descrever um fluxo de trabalho simplificado para análises de miRNA em FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado usando uma combinação de -PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) e hibridação in situ (ISH). Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e congelado tissu próstataes e expressão análises por sonda Taqman-base miRNA RT-PCR. Além disso, nós descrevemos um método otimizado para ISH analisa detecção formiRNA em tecidos da próstata, utilizando ácido nucleico bloqueado (LNA) - sondas de base. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA).

Perfil de expressão de miR-203 em amostras clínicas LCM cancro da próstata primário por RT-PCR análises (Figura 1) Análises de RT-PCR da expressão relativa de miR-203 em LCM tecidos de cancro da próstata primário e as regiões adjacentes normais correspondentes foi realizada como descrito no Saini et ai. RNU48 15 foi utilizada como um controlo. A tabela abaixo resume a expressão de miR-203 em relação a tecidos de tumor de cancro da próstata relativamente a...

Aqui descrevemos um protocolo simplificado para análises de expressão de microRNA (miRNA) em tecidos clínicos arquivados de câncer de próstata (CaP) fixados em formalina, embebidos em parafina (FFPE) ou frescos congelados empregando PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) e hibridização in situ (ISH).

As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

O objetivo geral deste vídeo é descrever um fluxo de trabalho simplificado para análises de microRNA em espécimes clínicos arquivados de câncer de próstata, utilizando uma combinação de PCR quantitativa em tempo real e hibridização NC dois com a utilização de sondas baseadas em ácido nucleico bloqueado. Isso é alcançado primeiramente isolando tecido de cortes FFPE de câncer de próstata por meio de microdissecção a laser com captura, seguido pela extração de microRNA. Em seguida, utiliza-se PCR-R-T-P-C-R em duas etapas para quantificar o microRNA no tecido e, para localizar o microRNA, realiza-se análise de hibridização C dois com sondas LNA marcadas com digoxigenina e detecção por anticorpo conjugado a fosfatase alcalina com revelação pelo BM purple.Os resultados apresentados mostram a expressão de um microRNA em tecidos clínicos de câncer de próstata. Usando essas técnicas, recentemente os microRNAs surgiram como biomarcadores promissores alternativos para o câncer de próstata. No entanto, a análise da expressão de microRNAs em espécimes clínicos de câncer de próstata é frequentemente desafiadora devido a fatores de confusão, como a heterogeneidade dos tumores prostáticos e contaminação estromal.Estamos trabalhando na área de microRNA e RNA não codificante há 10 anos. Otimizamos as condições para a expressão de microRNA em diferentes estágios do câncer de próstata avançado. Acreditamos que a expressão de microRNA pode ser utilizada como biomarcador diagnóstico e prognóstico, pois se correlaciona com o desfecho clínico do câncer de próstata.Acreditamos também que o microRNA pode ser utilizado no tratamento do câncer de próstata com o uso da tecnologia de nanopartículas. O perfil de expressão preciso no carcinoma de próstata é frequentemente dificultado pela heterogeneidade das lesões. Isso é parcialmente superado pelo uso da microdissecção a laser, ou LCM, para coletar células epiteliais benignas ou malignas puras e reduzir sua mistura com as células estromais.Microdissecção a laser de tecidos FFP arquivados, seguida de perfilagem da expressão de microRNAs, demonstrou ser uma técnica sensível, confiável e economicamente eficaz como método complementar. A hibridização otimizada em C oferece uma visão do local onde os microRNAs são expressos. Uma vez que os tecidos tenham sido coletados e cortados em seções de 10 mícrons, remova a parafina em capela, mergulhe as lâminas em xilenos por 10 minutos duas vezes e, em seguida, reidrate os tecidos transferindo-os para uma série de banhos de álcool progressivamente aquosos. Em seguida, aplique uma coloração com hematoxilina por 30 segundos e enxágue as lâminas em água.Agora, reidrate os tecidos em uma nova série de álcoois graduados, começando com 70%. Em seguida, banhe as seções em xilenos por cinco minutos e deixe secar ao ar. Leve as lâminas secas ao instrumento de microdissecção por captura a laser. Utilize lâminas marcadas por patologista para identificar os focos de câncer de próstata e as áreas benignas ou normais.Siga as orientações do fabricante para realizar a microdissecção a laser. Ajuste a largura do feixe entre 10 e 20 mícrons e aplique pulsos de 70 a 90 miliwatts. Utilize pulsos de infravermelho para capturar as áreas de interesse nas tampas de microdissecção a laser.Para cada amostra, adicione o conteúdo da tampa a um tubo de coleta e processe imediatamente as células para extração de micro RNA. Extraia o RNA total utilizando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante. Elua o RNA em 20 a 30 microlitros de água livre de nucleases e prossiga rapidamente.Em seguida, utilize um kit de reação de transcriptase reversa para produzir cDNAs usando primers específicos para microRNA. Prepare cada reação utilizando de 10 a 100 nanogramas de RNA total. Após a obtenção, dilua o cDNA em um fator de cinco a 10, obtendo uma concentração de cerca de um a 20 nanogramas.Agora, prepare as reações de PCR em triplicata a partir do ADNc utilizando ensaios de microRNA com uma mistura mestra universal rápida para o controle. Utilize RNU 48 como modelo para calcular a variação relativa na expressão gênica. Utilize o método de CT comparativo para pré-tratar cortes de tecido com espessura de cinco mícrons.Fixe as lâminas a 56 graus celsius por uma hora. Em seguida, desparafine as lâminas com dois banhos de xilol de 15 minutos cada à temperatura ambiente. Após os banhos de xilol, hidrate os tecidos por meio de uma série graduada de etanol. Em seguida, mergulhe os tecidos em água por cinco minutos.Em seguida, fixe os tecidos com PFA 4% em PBS à temperatura ambiente por 20 minutos. Remova o fixador com duas lavagens de cinco minutos em PBS. Agora, adicione a protease K potente a 10 microgramas por mililitro no tampão de protease K pré-aquecido e incube os tecidos a 37 graus Celsius por 10 minutos.Após o tratamento, enxágue as lâminas com glicina 0,2% em PBS por 30 segundos e lave as lâminas em PBS à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, mergulhe-as novamente em PFA 4% por 15 minutos. Novamente, remova o fixador com duas lavagens em PBS de cinco minutos cada.Os tecidos estão agora prontos para serem hibridados. Primeiro, desenhe um círculo hidrofóbico ao redor do tecido usando uma caneta de contorno para garantir que a solução nas etapas subsequentes permaneça na seção do tecido. Incube os tecidos no tampão de pré-hibridização por três a quatro horas a 55 graus Celsius.Realize isso em uma câmara umidificada com toalhas, embebidas com 50% formamida, 50% solução XSSC a 5. Agora prepare o diggen e a sonda marcada específica para micro RNA e a sonda controle. Planeje fazer uma diluição de 20 a 50 nanomolar, mas primeiramente dilua as sondas com apenas 25 microlitros de tampão de hibridização a menos do que o necessário para a diluição final. Em seguida, aqueça as sondas a 90 graus Celsius por aproximadamente quatro minutos.Em seguida, coloque as sondas no gelo. Por fim, dilua ainda mais as sondas com tampão de hibridização gelado até as concentrações finais de 20 a 50 nanomolares. Agora, aplique de 100 a 400 microlitros da solução de sonda em cada lâmina.Em seguida, incube-os por 12 a 16 horas na temperatura apropriada de hibridização. No dia seguinte, realize uma lavagem com solução SSC em várias etapas após as hibridizações. Incube as lâminas em solução bloqueadora à temperatura ambiente por uma a duas horas após o bloqueio.Sature os tecidos em uma solução de anticorpo conjugado com antígeno AP na proporção de 1 para 100 em PBS. Faça isso por uma a quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Posteriormente, remova o anticorpo em excesso com três lavagens em PBS, sendo 10 minutos por lavagem.Realize duas lavagens de cinco minutos em um tampão de urina à temperatura ambiente. Em seguida, incube as lâminas em BM purple, substrato de fosfatase alcalina protegido da luz à temperatura ambiente, por uma a 20 horas. No dia seguinte, remova o BM purple com uma lavagem em PBS 0,1% entre 20.Em seguida, lave-os duas vezes em água e monte-os com meio de montagem aquoso utilizando o protocolo descrito de extração de microRNA e R-T-P-C-R. O microRNA 2 0 3 foi analisado em tecidos de câncer de próstata e tecidos adjacentes normais. A expressão relativa variou em uma fração substancial dos tecidos.RNU 48 foi utilizado como controle. Os tecidos de câncer de próstata foram microdissecados ao microscópio ou submetidos à microdissecção a laser (LCM) e, em seguida, analisados quanto à expressão relativa de microRNA. A expressão de 3 83 nos tecidos tumorais foi comparada aos controles normais pareados.O tecido preparado com LCM detectou a expressão de microRNA de forma mais confiável. Em C, hibridização com o microRNA 2 0 3 foi realizada em tecido de câncer de próstata normal e com metástase óssea. U seis.A detecção de RNA foi utilizada como controle com base na intensidade da coloração. A expressão do microRNA 2 0 3 foi pontuada de um a quatro nas células de cada tecido. Assim, observou-se que a expressão era estatisticamente menor no tecido metastático ósseo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a expressão de microRNA em espécimes clínicos de câncer de próstata durante todo o fluxo de trabalho. É de extrema importância manter um ambiente livre de RNase. Além disso, trabalhar com paraformaldeído e solução salina pode ser extremamente perigoso, e precauções, como trabalhar em capela de exaustão e usar equipamentos de proteção individual, devem ser sempre adotadas ao realizar este procedimento.Após este procedimento, realizamos análise estatística para avaliar se os padrões de expressão de microRNAs estão correlacionados com as variáveis clínico-patológicas da doença, o que nos ajuda a responder perguntas fundamentais, como se a expressão de um microRNA específico possui potencial prognóstico ou diagnóstico associado. Nosso protocolo otimizado de hibridização in situ de microRNA pode ser aplicado a lâminas de tecido de câncer de próstata ou a microarranjos de tecido de câncer de próstata. Este protocolo também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos com otimização.

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Quantitativa em Tempo Real reacção em cadeia da polimerase (qPCR) é um método rápido e sensível para investigar os níveis de expressão de vários microRNA (miRNA) moléculas em amostras de tumor. Usando este método de expressão de centenas de moléculas miRNA diferentes pode ser amplificado, quantificado e analisado a partir do mesmo modelo cDNA.

Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

Retrovírus humanos endógenos (HERV), que ocupam a 8% do genoma humano, manter reduzidas capacidades de codificação, mas a centenas de milhares de repetições terminais longas (LTRs). Um costume microarray Affymetrix foi desenhado para identificar indivíduo expressão HERV lugar e foi usado em tecidos de câncer de próstata como uma prova de conceito para futuros estudos clínicos.

Identificação baseada em Microarray de Individual HERV Loci Expressão: Aplicação a descoberta de biomarcadores em câncer de próstata

Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

O objetivo deste protocolo é usar a microdissecção por captura a laser como um método eficaz para isolar populações puras de tipos de células de tecidos heterogêneos da próstata para análise de RNA a jusante.

Captura de Laser Microdissection de Próstata Humano Epithelium para Análise de RNA

A imuno-histoquímica é uma poderosa técnica de laboratório para avaliar a localização e expressão de proteínas nos tecidos. Os métodos semiautomatizados atuais de quantificação introduzem subjetividade e muitas vezes criam resultados irreproduzíveis. Aqui, descrevemos métodos para imuno-histoquímica multiplexada e quantificação objetiva da expressão e co-localização de proteínas usando imagens multiespectrais.

A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia

Aqui apresentamos um protocolo para detectar a expressão de miRNAs em amostras de pacientes com câncer de mama usando hibridização in situ de miRNA.

Análise clínico-patológico de miRNA Expressão em cancro da mama tecidos usando miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

Este protocolo de extracção modificado melhora RNA e DNA rendimentos provenientes de regiões mais precisamente alvo de interesse nos blocos de tecido histopatológicos.

Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction

Degradação do ácido nucleico em tecido arquivamento, heterogeneidade do tumor e a falta de amostras de tecido congelado fresco pode afetar negativamente o serviços de diagnóstico de câncer em laboratórios de patologia em todo o mundo. Este manuscrito descreve a otimização de um painel de biomarcadores usando um ensaio de multiplex do grânulo magnético para classificar os cancros da mama.

Otimização de um ensaio de expressão baseada em RNA Multiplex usando Material de arquivo de câncer de mama

Apresentamos um protocolo para avaliar os níveis de expressão de microRNA (miRNAs) em circulação em amostras de plasma de pacientes com câncer. Em particular, usamos um kit comercialmente disponível para circulação miRNA extração e transcrição reversa. Finalmente, analisamos um painel de 24 miRNAs selecionados usando placas personalizadas em tempo real sonda pre-manchado.

Deteção de um painel personalizado de MicroRNA circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático

A resistência terapêutica muitas vezes se desenvolve em pacientes com câncer de próstata avançado e, em alguns casos, o câncer progride para um subtipo letal chamado câncer de próstata neuroendócrino. Avaliar as pequenas alterações moleculares mediadas por RNA não codificadoras que facilitam essa transição permitiria uma melhor estratificação e identificação de mecanismos causais que levam ao desenvolvimento de câncer de próstata neuroendócrino.

Sequenciamento de RNA não codificador de tecidos reparados em formalina e exossomos derivados do soro de pacientes com câncer de próstata resistentes à castração

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a analisar a expressão de miRNA em tecidos clínicos de câncer de próstata usando PCR em tempo real e hibridização in situ com sondas de ácido nucleico bloqueado. Este protocolo simplificado permite quantificar e localizar biomarcadores em amostras FFPE arquivadas.

As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos

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