A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um modelo de lesão da orelha interna por meio da administração estratégica de agentes ototóxicos diretamente na região da janela redonda da cóclea do camundongo. Isso é realizado primeiramente pela dissecação da camada de gordura subcutânea e retirada suave do corpo muscular para expor o periósteo da bula timpânica. O segundo passo consiste em destampar a bula removendo gradualmente fragmentos ósseos até que a região da janela redonda seja exposta.

Em seguida, o fluido visível da orelha média e do nicho da janela redonda é completamente seco, permitindo uma visualização ideal do nicho da janela redonda. O passo final consiste em preencher o nicho da janela redonda com o agente ototóxico selecionado sem perturbar a artéria pedicular da STA, seguido pelas repetições apropriadas de acordo com as especificações do agente. Por fim, procedimentos funcionais, incluindo resposta auditiva do tronco encefálico e avaliação morfológica, são utilizados para demonstrar a preservação seletiva ou degeneração da microarquitetura coclear.

A principal vantagem desta técnica, nossa medida existente, é que este procedimento permite uma excelente exposição do nicho da janela oval e do órgão espiral, de modo que o agente tóxico seletivo possa ser aplicado diretamente. As vantagens desta técnica incluem a preservação da microarquitetura da orelha interna, a eliminação da toxicidade sistêmica, o início rápido do efeito, a degeneração seletiva de certos tipos celulares cocleares e resultados reprodutíveis. Esta técnica pode ser aplicada com poucas alterações entre outras espécies de roedores, incluindo ratos, porquinhos-da-índia e gerbos.

Agora demonstrarei o procedimento em meu laboratório. Todos os aspectos da pesquisa com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do comitê institucional apropriado de cuidado e uso de animais. Todos os procedimentos experimentais com vértebras descritos aqui foram aprovados sob as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul.

Após anestesiar o animal de acordo com os procedimentos aprovados, administre analgésico pré-operatório na dose de 0,1 miligrama por quilograma. A buprenorfina é utilizada neste caso. Verifique se o animal atingiu o plano cirúrgico de anestesia.

Não deve haver resposta ao aperto nos dedos dos pés, e o reflexo de escrita deve estar ausente em camundongos, como visto aqui. Aspire 0,2 mililitros de uma solução aquosa contendo o agente ototóxico selecionado em uma seringa tuberculínica de um mililitro equipada com uma agulha romba de 28 graus e meia polegada, eliminando qualquer ar dentro da seringa, pois as bolhas podem impedir a aplicação adequada do agente. Use tesouras elétricas para remover o pêlo da região que se estende desde a prega occipital até a cintura escapular, dorsalmente.

Estenda a remoção de pelos da linha média sagital dorsal até o ângulo mandibular lateralmente. Utilize uma lâmina descartável para garantir uma preparação bem raspada. Esterilize a pele da área preparada de acordo com os protocolos institucionais.

Aqui, Betadine alternado com etanol é aplicado topicamente de maneira circular durante dois minutos. Coloque uma pequena manta térmica sob o corpo para manter a temperatura corporal do animal. A 36 a 38 graus Celsius, fixe a cabeça do animal por meio de um aparelho segurador de cabeça.

Aperte suavemente um pequeno grampo sobre o dorso do focinho do animal para mantê-lo no lugar. Confirme que o suporte da cabeça está rigidamente conectado ao centro de um braço articulado em formato de U. Fixe uma haste com um centímetro de largura ao braço esquerdo do U para ser usada como apoio para o lado esquerdo da cabeça, permitindo acesso ao lado direito.

Uma vez firmemente fixado no suporte de cabeça, posicione o camundongo em decúbito lateral esquerdo. Posicione cuidadosamente o corpo sobre a superfície plana de operação para garantir estabilidade durante todo o procedimento e evitar estresse torcional excessivo nas vértebras cervicais. Posicione um microscópio cirúrgico com capacidade de ampliação de 10x e 20x sobre o campo cirúrgico.

Confirme que o microscópio pode manter sua posição de forma independente, permitindo que ambas as mãos sejam usadas para a cirurgia enquanto se trabalha com ampliação microscópica. Use tesoura afiada ou lâmina de bisturi para criar uma incisão pós-auricular de um a 1,5 centímetro, aproximadamente seis a oito milímetros cefálicos ao sulco auricular. Evite cortar profundamente para preservar as estruturas vasculares subjacentes.

Disseque em plana romba através da camada de gordura subcutânea. Se estiver dissecação na direção ventral para medial, tenha cuidado para evitar a veia jugular externa. Se houver sangramento, utilize esponjas de gelatina absorvível ou pelotas de algodão para conter o fluxo.

Uma vez que a camada de gordura esteja adequadamente dividida, exponha a musculatura cervical. Um marco anatômico importante é um pequeno ramo nervoso do nervo craniano 11 que envolve a borda posterior do processo mastóideo do C CTO. Para avançar em direção à orelha, utilize um afastador auto-retrátil para retrair suavemente o corpo muscular da miosite do processo mastóideo do CTO em direção posterior.

Divida suavemente a fáscia transparente, que envolve o corpo muscular. Retraia também suavemente a glândula parótida e a veia jugular externa em direção oposta. Com uma boa retração do corpo muscular Masto CTO, a cúpula brilhante do periósteo da bula timpânica é visível no aspecto coddle da bula, onde se insere um músculo cervical mais profundo.

A mastoidite esternocleidomastoideana entrará em vista. Posicione um afastador auto-retenível para manter o mastóide CTO afastado utilizando uma técnica com as duas mãos, use delicadamente bisturi bipolar para dividir o periósteo do tímpano e expor o osso subjacente. Em seguida, utilize pinça ou uma cureta otológica para elevar e empurrar suavemente o periósteo em direção periférica, expondo completamente a cúpula do tímpano.

Agora, utilize uma broca dentária acionada por correia com ponta cônica de um ou dois milímetros para cuidadosamente fazer um furo piloto de dois milímetros através do osso da bula. Faça o furo entre a margem coddle da cúpula e a linha visivelmente opaca que se estende pela face rostral da bula. Em seguida, faça com cuidado um segundo furo piloto próximo ao primeiro. Para facilitar a remoção da tampa do osso da bula, use uma pinça de ponta fina e remova a cobertura do osso da bula em direção dorsal e coddle.

Tenha cuidado para não perfurar a artéria EDL, que está localizada diretamente abaixo da cápsula do bigode. Minimize a quantidade de osso removida para evitar a entrada excessiva de fluido na orelha média antes da aplicação do agente. Use um pavio de papel para remover todo o fluido visível na orelha média e na nicho da janela redonda até que o osso seco fique visível.

Esta etapa é crucial para o sucesso do protocolo. Enquanto observa a área com ampliação máxima, utilize uma agulha de calibre fino acoplada a uma seringa tuberculínica de um mililitro para aplicar uma gota do agente ototóxico diretamente na reentrância da janela redonda, preenchendo-a completamente. Deixe o agente repousar na reentrância da janela redonda por 10 minutos.

Nos estágios iniciais, observe atentamente a substituição de um pequeno reflexo luminoso na base da niche seca por um menisco de fluido opaco e turvo. Isso indica que a niche está preenchendo adequadamente. Após decorridos completamente 10 minutos, remova completamente o agente com um cotonete e substitua por uma nova aplicação do mesmo agente.

O número de aplicações depende do agente utilizado. O tempo de exposição geralmente varia entre 30 e 60 minutos. Após a aplicação final, mantenha o touro sem o capuz e use pinça para fechar o tecido mole sobre o local cirúrgico.

Use sutura monofilamentar não absorvível de quatro zero para fechar a pele sobre o local cirúrgico. Permita que o animal se recupere da anestesia em uma gaiola doméstica limpa, que deve ser equipada com cama e alimento macio. Monitore os animais diariamente até o sacrifício e a coleta de tecido coclear de adultos C-B-A-C-A-J.

Camundongos de ambos os sexos foram expostos ao agente ototóxico Hept etanol. A difusão pela janela redonda. Aumentos significativos nos limiares de RAB foram observados em camundongos tratados com Hept do primeiro ao 14º dia pós-operatório, em comparação com animais controle submetidos a cirurgia simulada com administração de solução salina em vez de Hept.

O etanol não demonstrou deslocamentos significativos do limiar em nenhuma frequência testada. A imunomarcação contra um canal de potássio retificador interno mostrado em verde serviu como um método indireto para visualizar os danos e a recuperação das estruturas cocleares. A intensidade da marcação foi acentuadamente reduzida dentro das teria vais.

No primeiro dia pós-operatório, evidências de integridade nuclear rompida e condensação cromossômica, típicas da apoptose celular, também foram observadas na coloração de contraste nuclear mostrada em vermelho. Quando a intensidade da coloração dos canais de potássio foi quantificada nas áreas dos ouvidos tratados com estrato, demonstrou-se um declínio inicial seguido por uma mudança significativa de volta à intensidade do controle sete dias após a exposição ao hept, com recuperação contínua a partir de então. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em 30 a 60 minutos, se executado corretamente.

É importante lembrar que exposições adicionais ou reposições podem ajudar a evitar a diluição indesejada do agente auto-tóxico por condensação sanguínea ou fluido intersticial. No entanto, deve-se ter cautela com essa abordagem, pois ela tende a aumentar o risco de lesar acidentalmente a artéria cedal ou introduzir fluido intersticial na niche da janela redonda. Essa técnica minimamente invasiva permite o estudo detalhado de delicados processos bioquímicos e tem sido fundamental para avançar nossa pesquisa voltada à compreensão do potencial regenerativo coclear in vivo.