Name: Medição de TCR-pMHC Binding In Situ Usando a microscopia Ensaio de FRET (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 5 s
Description: Aprenda a medir a cinética de ligação TCR-pMHC in situ usando microscopia FRET em bilipídios suportados. Este método permite análise quantitativa de afinidade e taxas de associação em nível de molécula única.

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MA foi apoiado por uma bolsa de Schrödinger do Fundo austríaco Science (FWF, J3086-B11) e graças a Max-Planck-Sociedade de apoio financeiro e administrativo. GS e JH foram apoiados pelo Fundo de Ciência e Tecnologia de Viena (WWTF, LS13-030).

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Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.

Medição de interacções proteína-proteína in situ é altamente desejável, especialmente quando se lida com as interacções de baixa afinidade, tais como ligação de TCR-pMHC 11. Isto é porque a taxa de sobre-, bem como a estabilidade de tais interacções são significativamente influenciadas pelas circunstâncias particulares sob as quais ligação ocorre. Abordagens de imagem baseados em FRET minimamente invasivos são, portanto, em princípio, perfeitamente adequado para tais tarefas, ainda envolver uma série de obstáculos que devem ser superados primeiro. O ruído gerado por autofluorescência celular limita a sensibilidade das medidas e deve, portanto, ser mantidos a um mínimo. Microscopia TIRF serve essa necessidade muito bem 12, mas exige a funcionalização de vidro-slides, idealmente sob a forma de uma bicamada lipídica planar suportada em vidro decorado com proteínas de escolha 13-15. Outra vantagem de uma abordagem que é parcialmente reconstitutive parceiros FRET recombinantes bicamada residente pode ser muito mminério facilmente marcada em um, local específico forma quantitativa e racional com fluoróforos menores e mais brilhantes do que seria possível com proteínas expressas na superfície de células. TCRs são marcados com scFv recombinante s, que não influenciam o reconhecimento de células T, como foi anteriormente testada 2. Além disso, a composição de proteína do SLB, por exemplo, a densidade de pMHCs e a escolha dos factores de acessório pode ser ajustado para a necessidades específicas. Temos experiências previamente realizada com diferentes densidades de pMHCs estimulantes, mas não detectaram diferenças significativas em 2D-koff e 2D-K D 2. Até agora aqui o reconhecimento de moléculas do MHC da classe II tem sido tratado com apenas, principalmente por causa da natureza da sua fenda de ligação peptídeo, que é aberto em ambas as extremidades e, assim, acomoda péptidos maiores, incluindo um ligante para a fixação fluoróforo. Em alguns casos, esta abordagem pode também trabalhar para a rotulagem MHC class I moléculas 16, mas grande cuidado deve ser tomado para verificar a sua utilização em experiências. A sensibilidade das células T contra os antigénios, os quais podem ser medidos através de ensaios de proliferação de células T, assim como a cinética de ligação pMHC-TCR tal como medido in vitro por ressonância de plasma de superfície não deve ser afectada pela adição do ligante e fluoróforo para o péptido. Alternativamente, MHC de classe I próprias moléculas podem ser marcados de uma maneira específica do local, com a introdução de uma cisteína não emparelhado no interior da sequência da cadeia pesada (observações não publicadas). Com a utilização de sondas moleculares apropriados qualquer interacção proteína-proteína sináptica pode, em princípio, ser estudados de uma forma aqui descrita. Essas sondas, por exemplo, Proteínas Projetado Ankyrin Repetir (DARPins) 17, a SCF V s ou deveria ser monovalente e deve vincular seu alvo de forma estável, sem afetar a interação de interesse. Claro, informatio estruturaln é altamente desejável para a concepção racional de sonda, mas não absolutamente necessário. Ao estabelecer um novo par de FRET parceiros, recomenda-se para gravar e analisar FRET em grandes quantidades em primeiro lugar. Locais de ligação da etiqueta pode variar consideravelmente para maximizar o sinal de FRET e também para verificar que os rendimentos medidos FRET variar em função da distância inter-corante. Uma vez que o sistema é otimizado, única molécula FRET sinais podem ser gravados através da limitação da rotulagem do FRET parceiro alta abundância de 10-30% e branqueamento da FRET parceiro baixa abundância até moléculas individuais são resolvidos no campo da iluminação. Por último, mas não menos importante, deverá ser notado que SLBS aproximar alguns, mas não todos os aspectos da membrana plasmática fisiológico. Qualidades tais como curvatura da membrana e flexibilidade, domínio compartimentalização, rearranjos do citoesqueleto e a motilidade celular, bem como uma elevada variedade de proteínas de membrana de superfície não-expressos são representados por SLBS mas pode influenciar tele processar sob investigação. Muito esforço terá de ser investido para estabelecer modalidades de imagem que permitem a monitorização interações proteína-proteína com resolução molécula única em sinapses fisiológicas, que são inacessíveis a imagem TIRF.

Uma compreensão mais fundamental de como as células T reconhecem os antígenos requer olhar para o lugar certo, ou seja, dentro da sinapse imunológica formado entre a célula T e do APC. Aqui, a cinética de ligação molecular não são apenas determinadas pelas propriedades bioquímicas intrínsecas dos parceiros de interacção envolvidos, mas dependem em grande medida dos parâmetros celulares, que incluem forças celulares, a arquitectura da membrana e das interacções laterais entre as proteínas da membrana, bem como as restrições geométricas específicas da sinapse 3. Abordagens bioquímicas são limitados em potência de resolução como eles exigem a disrupção de, pelo menos, uma das membranas sinápticas envolvidas. Por esta razão, uma metodologia de imagem baseados em FRET foi desenvolvido para monitorar a ligação do TCR para pMHCs antigênicas 2. Aqui as células T são decorados com um recombinante e de site especificamente rotulado TCRβ-reativa de cadeia simples fragmento de anticorpo (SCF V) e confrontados com plano<html> AR bicamadas lipídicas suportada em vidro (SLBS), que abrigam as moléculas MHC de classe II carregadas com um péptido antigénico marcado por fluorescência, moléculas co-estimulatórias e proteínas de adesão. Synaptic ligação entre TCR e corante marcado marcadas com corante de resultados pMHC em FRET, que podem ser monitorados em um único volume e nível molécula pela Total Internal Reflection fluorescência microscopia (TIRF). Neste artigo é explicado em detalhe como utilizar SLBS para ensaiar sinapses das células T, verificar sua integridade através de um ensaio de cálcio-flux de células T funcional, conduta FRET medições a granel e com sensibilidade única molécula, e analisar os dados adquiridos. Recomendações são oferecidas para a produção de proteínas adequadamente conformado necessários para bicamada funcionalização. Para obter informações mais específicas sobre a formação de bicamada e configuração de um microscópio TIRF adequado, consulte a uma publicação JoVE acesso público adicional publicada volta para trás 4. tenda &quot;&gt; Nature de SLBS SLBS functionalizable pode ser prontamente gerado a partir de vesículas unilamelares (SUVs) que contém os dois lípidos 1-palmitoil-2-oleoil-sn-gylcero-3-fosfocolina (curto: POPC, 90-99%) e 1,2-sn dioleoyl- - glicero-3 - {[N- (5-amino-1-carboxipentil) ácido iminodiacético] succinil} (curto: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUVs, distribuídos em lâminas de vidro limpas para formar uma bicamada planar contígua 4. DGS-NTA-Ni serve para ancorar proteínas marcadas com poli-histidina-complexo através de formação mediada por poli-histidina, com o NTA-Ni que contém um grupo de cabeça (Figura 1A) sintético. Para uma associação estável substitui tipicamente o domínio transmembranar e a cauda citoplasmática nativa da proteína de adesão ICAM-1 e a molécula co-estimuladora B7-1 com uma etiqueta contendo doze histidinas (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (Figura 1B) . O péptido carregado-classe II K IE molécula contém duas cadeias polipéptido incorporado-membrana (α e β)s. Os transmembranares / domínios citoplásmicos de ambas as cadeias têm que ser substituídos com uma etiqueta de seis histidinas contendo cada (IE k α 6H β 6H k -2x6H ou IE). Como uma alternativa, que se prolonga a cadeia com doze α histidinas e deixando o domínio extracelular da cadeia β não marcado (dando origem a IE k α 0H 12H β ou IE k -12H) dá origem a resultados satisfatórios (Figura 1B). Rotulagem específica do local de pMHCs É importante para marcar o local e pMHC estequiometricamente-especificamente, a fim de ser capaz de converter os rendimentos medidos em FRET constantes de ligação de equilíbrio significativas. Isto pode ser conseguido pela marcação química de um péptido sintético que é carregado para a fenda de ligação ao péptido de recombinante marcada com histidina moléculas MHC de classe II 2,5. O péptido inclui todos os resíduos do epitopo de célula T como well como um curto C-terminal ligante (GGS) seguido por cisteína (por exemplo, a traça do citocromo c (MCC) péptido ANERADLIAYLKQATK- GGSC, o ligante é marcado em negrito). Esta cisteína é utilizado para marcar o péptido estequiometricamente com o uso de derivados de maleimida com corante. Neste ponto, cuidado extra deve ser dedicada à verificação quantitativa corante de acoplamento para o peptídeo contendo cisteína. HPLC de purificação do aducto de péptido-corante é recomendado e deve ser seguido por espectroscopia de massa por ionização por electropulverização. Quaisquer massas gravados correspondentes ao educto peptídeo (sem corante) refletem rotulagem incompleta. Se isto é verdade, o péptido purificado por HPLC-deve ser submetido a ciclos consecutivos de-marcação com corante até que a rotulagem é considerada quantitativa. Note-se que a espectroscopia de massa MALDI-TOF deve ser evitada dado que este método envolve a radiação laser para uma amostra de ionização. Este tratamento se desintegra as fluorophores sensíveis ligados antes de massa peptídeo é lido e, portanto, underrepre<html> graus Sents de dye-conjugação. Ainda marcação indirecta do local específico de TCR ligado de células com a utilização de fragmentos de cadeia simples Fv monovalente Ele ainda é um desafio para anexar corantes para celular proteínas associadas à superfície de células vivas de uma maneira específica do local. Para superar este obstáculo para TCRs expostos à superfície, uma versão monovalente de cadeia única (scFv) a partir dos genes do anticorpo monoclonal TCRβ Reativo H57-197 2 foi construído. A estrutura cristalina deste anticorpo em complexo com o TCR permite conceber racionalmente uma versão, na qual um resíduo de serina em estreita proximidade com o terminal C do péptido associado MHC (em que o corante parceiro de FRET correspondente está ligado) é substituído por um resíduo de cisteína. Este mutante de cisteína, em seguida, serve como um aceitador para a conjugação de corantes (Figura 2). Metodologias para gravar FRET nt &quot;&gt; valores FRET em massa são os mais adequados para verificar a relação entre as distâncias inter-dye escolhidos e FRET eficiências medidos neste TCR-pMHC sistema 2 vinculativa. Além disso, as medições FRET granel revelar diferenças qualitativas e quantitativas na sinápticas afinidades TCR-pMHC ( ver abaixo e secção protocolo 3.2). Várias abordagens para quantificar a eficiência FRET foram introduzidos na literatura 6. Neste artigo é registada por meio de FRET (a) doador recuperação após aceitante de branqueamento, e via (b) emissão de aceitador FRET sensibilizados. O primeiro método (a) exige a utilização de um aceitador FRET que pode ser facilmente Foto-descoloração, e um doador, a qual é bastante fotoestável. Além disso, é importante assegurar que o aceitador de Foto-descoloração não é mais capaz de extinguir a fluorescência do dador. À medida que o mesmo canal de detecção (doador) é usado para a quantificação, sem factores de correcção umd há aberrações cromáticas devem ser considerados, o que torna esta metodologia simples e confiável. No entanto, as medidas quantitativas não pode ser repetida no mesmo local de amostra e mudanças na FRET não podem ser gravadas ao longo do tempo. Para evitar efeitos causados ​​pela difusão molecular ou motilidade celular um passo de branqueamento rápido deve ser orientado para, o que minimiza o tempo que passa entre o primeiro doador FRET (antes receptor de branqueamento) e a segunda aquisição de imagens FRET doador (depois de FRET receptor de branqueamento). É recomendado empregar uma poderosa fonte de luz laser do comprimento de onda de excitação aceitador FRET, a fim de minimizar a iluminação e de branqueamento vezes. Em contraste, na abordagem da medição das emissões de FRET sensibilizado (b) o dador FRET é animado e a emissão do aceitador FRET é observado no canal aceitador FRET. Alterações na sinal aceitador FRET pode ser gravado, mas ao longo do tempo de emissão do doador FRET para o canal receptor vermelho-deslocada (termed exsudação) e FRET aceitante cross-excitação via doador excitação tem que ser determinado com exactidão e subtraído do canal receptor de FRET gravado. Para isso as imagens correspondentes aceitador FRET doador e traste tem que ser espacialmente alinhados. A detecção de única molécula (sm) FRET eventos Com o uso de lasers como fonte de excitação, uma câmara sensível e microscopia TIRF-ruído atenuado a fluorescência de fluoróforos individuais podem ser facilmente rastreada ao longo do tempo. Semelhante é verdadeiro para a detecção de eventos smFRET intermoleculares. No entanto, as complicações podem ser causados ​​por FRET exsudação dador e trans-excitação do aceitador FRET, e, assim, grande cuidado deve ser tomado ao ajustar as densidades fluoróforo na experiência smFRET. No protocolo fornecido abaixo (seção de protocolo 4) a TCR foi escolhido como FRET doadores em alta abundância e pMHC como FRET aceitante em baixa abundância. Para atenuar FRET doador suficientemente exsudação, decorar 10-30% dos TCRs com FCE fluorescente V e 90-70% dos TCRs com FCE não fluorescente V. Aqui, o canal de aceitador FRET foi escolhido como único canal molécula porque é confocal com a única molécula FRET canal. Isto ajuda a alinhar com eventos smFRET molécula única aceitadores de FRET, que é a base de validação smFRET. Extraindo-off taxas sinápticas através de medições smFRET Fotodegradação de ambos FRET doador e receptor FRET tem que ser contabilizado ao extrair a meia-vida de interações de única molécula FRET vestígios. O número de sinais observáveis ​​FRET no início da sua aparência como par dador-aceitador individuais n (0) é reduzido ao longo do tempo, tanto unbinding do fotobranqueamento e complexo ligando-receptor. O número de sobreviventes complexos num dado momento N (t) pode ser expresso matematicamente como se segue: No termo fotobranqueamento exp (-t / τ lixívia) o tempo t é descrita pelo produto do número de observações N e o tempo de iluminação t mal por causa da observação de modo não-contínua, discreta (isto é, de branqueamento ocorre apenas durante a iluminação ). Dentro do termo cinética exp- (t / τ desligado) o tempo t é o produto do número de observações n e t o intervalo de tempo para uma única observação FRET (isto é, acontece continuamente unbinding cinética). Equação 1 pode ser expressa como: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> O termo τ lixívia / τ doente describes o número de observações até branqueamento ocorre e é definido como o valor esperado &lt;n branquear&gt; da sua função exponencial. A equação 2 pode ser simplificada, como se segue: <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> O valor esperado &lt;N (t lag)&gt; do número de quadros de N (t) com FRET eventos observáveis ​​após o tempo t é determinado directamente a partir da experiência. Depende do tempo ajustável entre as observações (t lag) escolhidos no experimento e os valores desconhecidos para τ off (o inverso da taxa de off k off) e &lt;n branquear&gt;, o valor esperado do número de observações antes de ocorrer branqueamento . Assim, o cálculo do valor esperado &lt;N (t lag)&gt; para, pelo menos, dois valores de t <sub&gt; lag permite a determinação experimental de &lt;n branquear&gt; e τ off. Extraindo valores sinápticas 2D-K D através de medições baseadas em FRET Medindo uma ocupação de TCR, isto é, a razão entre os TCRs e ligados no total TCR, é fundamental para a determinação dos valores de K-sinápticos 2D d. De acordo com a equação 4 este termo é directamente proporcional à medida FRET produzir TCR, desde que serve como dadores e aceitantes pMHCs como FRET FRET. <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> com uma ocupação = TCR, C = fator de conversão C é uma constante, que depende do sistema de FRET e os fluoróforos utilizado. Ele pode ser determinado experimentalmente, conforme mostrado abaixo. um pode ser convertido num 2D-K D de acordo com a equação 5, quando odensidade inicial de ligandos de TCR, antes da adição de células T para a bicamada é conhecido. Isto é devido à grande mobilidade das proteínas SLB-inscritos e também porque SLBS fornecer um reservatório quase inesgotável de ligantes 2. <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> com [pMHC inicial] = densidade inicial de pMHC antes da adição de células T Com equações 4 e 5 pode-se agora facilmente determinar o sináptica 2D-K D entre TCR e pMHC. Isso é feito mais com medições FRET com base na recuperação de doadores após o clareamento receptor (ver seção de protocolo 3.1). No entanto, à medida C a relação entre a intensidade de FRET FRET I (corrigido para o fundo, de FRET exsudação dador e aceitador FRET cruzada excitação) e TCR ocupação um tem de ser determinado. Para isso, umaprecisa de saber a relação R entre a intensidade média de fluorescência de fluoróforos individuais TCR-associados FRET doadores (por exemplo, Cy3 ou AF555) sm I doador FRET e a intensidade média de molécula única FRET FRET I sm eventos. R depende do sistema de FRET em questão, e filtros de emissão de câmara utilizada para a detecção de fluorescência. A ocupação de um TCR pode então ser determinado directamente de acordo com a equação 6. <img alt="Equação 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> com R = sm I FRET doador / sm I FRET R foi determinado como 1,45 para o sistema de scFv H57 Cy3 / pMHC-Cy5 leva a: a = massa I FRET / bulk I TCR-cy3 • 1,45 A relação entre a ocupação de TCR a e o rendimento de FRET pode ser determinado por doador FRET recuperary aceitador após branqueamento. Para esta dois parâmetros são representados graficamente contra o outro para um número de TCR microclusters como mostrado na Figura 4A .A inclinação do ajuste linear indica o factor de conversão C (a partir da equação 4). Como demonstrado na Figura 4A, C ascende para (a) o V H57 scF - Cy3 / pMHC-Cy5 sistema FRET e (b) a configuração do sistema de microscópio aplicado a 1.995. A ocupação de um TCR pode ser facilmente deduzido da seguinte forma: A ocupação de um TCR = FRET produzir 1,995 •

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>expressão bacteriana</td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Life Technologies</td><td>10227402</td><td>meios de células de insetos para produção de vírus baculo</td></tr><tr><td>Insect-XPRESS com L-glutamina (Lonza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10564038</td><td>meios celulares de insetos para expressão de vírus baculo</td></tr><tr><td>Células Sf9</td><td>Life Technologies</td><td>11496-015</td><td>para vírus produção e expansão</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies</td><td>Células B855-02</td><td>para expressão de poteína</td></tr><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>expressão bacteriana</td></tr><tr><td>Centramate System</td><td>Pall</td><td></td><td>protein concentartion de grandes volumes</td></tr><tr><td>Centramate 10kDa cutoff</td><td>Pall</td><td>OS010T12</td><td>protein concentartion de grandes volumes</td></tr><tr><td>Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15</td><td>Concentração</td><td>de proteína UFC900308</td><td>EMD Millipore</td></tr><tr><td>Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-4 Concentração</td><td>de</td><td>proteína</td><td>UFC800308 EMD Millipore</td></tr><tr><td>Modelo de Célula de Ultrafiltração Agitada Amicon 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>concentração de proteína</td></tr><tr><td>&Auml; kta pure 25L</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td>purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5174-01</td><td>purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-01</td><td>purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 coluna</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Gilson Sistema HPLC</td><td>Gilson</td><td></td><td>purificação de peptídeos acoplados a fluorocromo</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &micro; m tamanho de partícula, 21,2 * 250 mm tamanho da coluna</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>purificação de peptídeos acoplados a fluorocromo</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 e micro; m tamanho de partícula, 21.2*50 mm tamanho da coluna</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>purificação de peptídeos acoplados a fluorocromo</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 coluna&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Gilson Sistema HPLC</td><td>Gilson</td><td></td><td>purificação de peptídeos acoplados a fluorocromo</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 e micro; m tamanho de partícula, 21,2 * 250 mm tamanho da coluna</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>purificação de peptídeos acoplados a fluorocromo</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 e micro; m tamanho de partícula, 21,2*50 mm tamanho da coluna</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>purificação de peptídeos acoplados a fluorocromo</td></tr><tr><td>maleimida Cy3</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>marcação de proteínas específicas do local por meio de cisteínas mutantes não pareadas</td></tr><tr><td>Maleimida GE</td><td>Healthcare</td><td>PA25031</td><td>marcação de proteínas específicas do local por meio de cisteínas mutantes não pareadas</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20346</td><td>marcação de proteína específica do local por meio de cisteínas mutantes não emparelhadas</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20347</td><td>marcação de proteína específica do local por meio de cisteínas mutantes não pareadas</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, corante</td> sensível ao cálcio Life <td>Technologies</td><td>F-1221</td><td>para marcação celular</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>para dissolução fura-2 am</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank mais tampão</td> de <td>imagem</td><td>de 10225362</td> de cálcio / magnésio <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Pó liofilizado de albumina de soro bovino</td><td>Suplemento Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>para tampão de imagem</td></tr><tr><td>14-4-4S anticorpo</td><td>affimetrix eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>anticorpo bloqueador para H2-I-Ek (reconhecido pelo 5c.c7, 2B4 e AND TCR)</td></tr><tr><td>Tubo de fundo redondo de polipropileno de 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m Unidade de filtro centrífugo Ultrafree-MC</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa 0.2&micro; m</td><td>Microesferas Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck, 0.1 &micro; m, azul fluorescente/verde/laranja/vermelho escuro</td> Microscópio <td>T-7279</td><td></td><td>da Life Technologies</td></tr><tr><td>para medições de cálcio à base de fura-2&nbsp;</td><td>Microscópio</td><td>LEICA DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>para medições de FRET (molécula única)</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td><td>para obter detalhes, consulte a contribuição paralela do JoVE de Axmann et al.</td><td></td></tr><tr>bicamadas <td></td><td>lipídicas planares suportadas</td><td>para obter detalhes, consulte a contribuição paralela do JoVE de Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, com L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td><td>meio de células T</td></tr><tr><td>aminoácido não essencial 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>suplemento de mídia de células T</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina/L-glutamina 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>suplemento de mídia de células T</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>Suplemento de mídia de células T</td></tr><tr><td>proteína recombinante BPS de interleucina-2 de camundongo</td><td>Bioscience</td><td>90185-B</td><td>Suplemento de mídia de células</td></tr><tr><td>T Grau de pesquisa Fetal bovino</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td>Suplemento de mídia de células T</td></tr><tr><td>Origem (programa de análise)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td> <td>ajuste não linear de dois parâmetros (tauoff, [ntlag])</td></tr></tbody></table>

medição de tcr-pmhc binding<em&gt; in situ</em&gt; usando a microscopia ensaio de fret

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

as células T são notavelmente específicas e eficazes no reconhecimento de antígenos na forma de peptídeos embutidos em moléculas de MHC (pMHC) na superfície das células apresentadoras de antígenos (APCs). Isso ocorre apesar dos receptores de antígeno de células T (TCRs) exercerem geralmente uma afinidade moderada (faixa de μM) ao antígeno quando a ligação é medida in vitro1. Tendo em vista os parâmetros moleculares e celulares que contribuem para a sensibilidade ao antígeno das células T, uma metodologia baseada em microscopia foi desenvolvida como meio de monitorar a ligação TCR-pMHC in situ, pois ocorre dentro da sinapse de uma célula T viva e uma bicamada lipídica planar (SLB) artificial e funcionalizada suportada em vidro, que imita a membrana celular de uma célula apresentadora de antígeno (APC) 2. As medições são baseadas na Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) entre um corante fluorescente com desvio para o azul e para o vermelho ligado ao TCR e ao pMHC. Como a eficiência do FRET é inversamente proporcional à sexta potência da distância entre corantes, pode-se empregar sinais FRET para visualizar a ligação sináptica TCR-pMHC. A abordagem sensível da microscopia suporta a detecção de eventos FRET de molécula única. Isso permite determinar a afinidade e a taxa de desligamento das interações sinápticas TCR-pMHC e, por sua vez, interpolar a taxa de ligação. Ensaios análogos podem ser aplicados para medir outras interações receptor-ligante em seu ambiente nativo.

A gravação de cálcio intracelular através do corante Fura-2 cálcio, bem como a análise celular subsequente para verificar a potência estimuladora e, consequentemente, a funcionalidade do SLBS são mostrados na Figura 4. Conforme se torna evidente, os níveis de cálcio aumentar em células T (expresso como a fura-2 340 nm razão normalizada / 380nm com linha de base sendo 1) imediatamente assim que resolver sobre as SLBS estimulantes. Os níveis de cálcio voltar aos níveis basais logo após a adição de um anticorpo que bloqueia pMHCs TCR de acoplamento e que termina a activação das células T. A Figura 6 ilustra uma experiência típica envolvendo recuperação dador FRET aceitador após o branqueamento, que é utilizado para medir o rendimento FRET e que serve para calcular os valores de 2D-K D (mostrada na Figura 4). Note que o aumento em intensidade dador FRET, que representa TCR marcado através de AF555, após ablação rápida e completa de uma a FRETespécies cceptor (aqui: AF647 associado com pMHCs). Também é evidente a redução forte no canal de FRET, ou seja, o canal de FRET-aceitador FRET sob doador de excitação, após aceitador FRET branqueamento. O sinal remanescente pouco visível corresponde a se preocupar doador exsudação. Rendimentos FRET dentro microclusters TCR individuais ou sinapses inteiras são calculados com base nos valores de intensidade medidos indicados (Figura 6B). A Figura 7 descreve uma trajectória e lapso de tempo de uma única molécula de evento de FRET visível em dois intervalos de tempo. Como descrito acima na introdução tal comportamento é causado por ambos decadência da sináptica TCR-pMHC vinculativo e fotodegradação. Para discriminar entre essas duas contribuições, os prazos de aquisição experimentais tem que ser variada de duração: enquanto fotodegradação continua a ser uma constante, mudanças na FRET comprimento evento trajetória só são causados ​​pelas cinética de ligação. Uma quantificação de tracelengths, W<html> hich constitui a base para o cálculo das taxas de fora do branqueamento e mostrados na Figura 7, são apresentados nas tabelas 1 a 3. Determinação do 2D-K D s exige a gravação de grandes quantidades FRET rendimentos para FRET doadores TCRs rotulados. Com a utilização do experimentalmente deduzida constante C (Figura 4), ​​com um rendimento de FRET medido para um microcluster TCR ou uma sinapse inteira pode ser convertido para o TCR de ocupação, um ou seja, a proporção de TCR pMHC-envolvidos e totais (Figura 4C) . Com densidades pMHC conhecidos presentes no SLB antes da adição das células-T, A valores podem ser utilizados para determinar os valores de KD 2D-sinápticos (Figura 4D). On-taxas pode ser calculado com a lei de ação de massas (2D-k on = 2D-koff / 2D-K D) da sináptica determinada off-rate e valores 2D-KD. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Diagrama esquemático do contorno da bicamada lipídica do sistema suportada em vidro plano (SLB). (A) SLBS são compostos de POPC (90-99%) e o lípido sintético DGS de Ni-NTA (1-10%) e formam-se espontaneamente quando as superfícies de vidro limpas são carregadas com vesículas unilamelares pequenas (SUVs) que consiste dos lípidos correspondentes. (B) Uma vez formados, tais SLBS pode ser funcionalizado com porções marcadas com poli-histidina solúveis extracelulares derivadas de co-estimuladoras B7-1 pMHCs, proteínas e proteínas de adesão ICAM-1, para servir como APCs para células-T. Para obter mais informações sobre como preparar SLBS consulte Axmann et al. 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> re 2. Energia de Förster Ressonância ensaio baseado em Transferência para quantificar a ligação de TCR-pMHC in situ. (A) Uma estrutura compósita de um TCR complexado com um fragmento de cadeia única H57 engatar um pMHC ilustra a abordagem baseada em FRET aqui descrito. Note-se a curta distância de cerca de 41a separa os dois fluoróforos correspondentes submetidos FRET. Sites receptora na fluoróforo-maleimidas são indicados em verde e vermelho. (B) O princípio de detecção de interacções TCR-pMHC in situ é ilustrada. Apenas scF V -decorated TCRs e pMHCs (IE aqui k), que formam complexos específicos, dar origem a um sinal FRET mensurável. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &quot;/&gt; Figura 3. Cromatogramas de ascensão último passo de filtração em gel para dar scFv monoméricos e s carregadas com péptido k -2x6H moléculas IE. Eixos X representam volume de retenção, em ml, eixos Y indicam absorvância a 280 nm em unidades arbitrárias (UA) . (A) Site-H57 especificamente scFv marcado com Alexa Fluor 555 maleimida foi submetido a cromatografia para separar S75 corante que não reagiu a partir da proteína (passo 1.2.5). As fracções correspondentes ao intervalo de retenção de 14 to15 ml (linhas tracejadas) representam marcado H57 scFv monomérico. (B), ou seja moléculas -2x6H k complexados com o ANP-péptido espaço titular UV clivável tinha sido irradiadas com UV, incubadas com o sítio-específico Alex 647 marcado com maleimida péptido e, finalmente, sujeito a cromatografia em S200 para separar a proteína do péptido livre (passo 1.1.2.4). O intervalo entre as linhas tracejadas contém adequadamente dobrados e pMHCs monoméricos. (A, B) </sTrong&gt; 0,7 ml da amostra foi aplicada na coluna no início do rum (0 ponto mL). As fracções recolhidas foram concentradas. A proporção entre proteína e corante foi determinada por photospectrometry antes da diálise contra PBS / glicerol a 50% (para o armazenamento a -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Figura 4. Determinação 2D-K D S e K em 2D-s. (A) A correlação entre o rendimento de FRET como determinado pela recuperação após branqueamento doador aceitador e TCR ocupação foi medida experimentalmente. TCR ocupação pode ser determinada para microclusters TCR individuais como explicado na secção 4.2. Um ajuste linear dos dados é apresentada pela linha, cuja inclinação é igual à relação entre C TCRocupação eo rendimento FRET. C é uma constante específica para o sistema FRET e os fluoróforos (aqui Cy3 e Cy5) empregados. Neste exemplo, produziu 1.988. (B) FRET dados de rendimento foram determinados por microclusters individuais TCR (N = 187, temperatura = 24 ° C) através da recuperação de doador aceitador de branqueamento. Números abaixo de barras de histograma indica o limite superior do intervalo dentro. (C) A conversão dos dados apresentados em (B) multiplicando os rendimentos medidos FRET com a constante C determinada em (a). Números abaixo de barras indicam o limite superior do intervalo dentro. (D) Histograma (semi-logarítmica, base = 4) que descreve a distribuição de 2D-K D s, medida por microclusters TCR individuais. A mediana 2D-K D é indicado no azul. Números abaixo de barras indicam o limite superior do intervalo dentro. (E) O histograma mostrado em (D) foi convertido intoa 2D-k em -histogram (semi-logarítmica, base = 4) utilizando o k sináptica off para 24 ° C (0,41 s -1). O 2D-k mediana determinado sobre o valor é indicada a azul. Os dados foram originalmente publicado em Huppa et al. 2 e são visualizados aqui em um novo formato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Figura 5. Validação funcional de SLBS empregue para a estimulação de células T e de imagem. (A) de blastos de células T transgénicas TCR-carregadas com Fura-2 foram confrontados com estimuladora SLB abrigando pMHCs antigénicos, ICAM-1 e B-7. Foram registrados celular fura-2 emissão animado a 340 nm e 380 nm, bem como imagens DIC. Conforme indicado, os valores da relação das intensidades de emissão animado aos 34 anos0 e 380 nm são apresentados no painel da direita. A adição de pMHC anticorpos de bloqueio 14 min para o ensaio experimental resultou numa diminuição nos níveis de cálcio intracelulares, comparável ao do descanso células-T. (B) Um perfil temporal típico de índices médios Fura-2 em células T em contacto com SLBS estimuladoras é caracterizada por um aumento inicial em uma intracelular de cálcio que é de 2 a 4 vezes mais elevada em comparação com a de células T não activadas ou células T privadas de antigénio após o bloqueio mediada por anticorpos. Círculos verdes indicam pontos no tempo em ilustrados (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Figura 6. massa FRET rendimentos, medida através da recuperação doador FRET FRET aceitante após o clareamento. <strong&gt; (A) é mostrado um exemplo de uma medição de FRET-sináptica normal. Como está indicado no lado esquerdo e na parte superior de uma série de imagens foi adquirida com o uso de um divisor de feixe de emissão dando origem a um dador FRET e um canal de FRET aceitador (para uma informação mais detalhada sobre divisores de feixe referem-se a Axmann et ai 4). A linha mostrada na imagem DIC esquerda indica o limite da sinapse de células T. Note-se a perda de intensidade dentro do canal aceitador FRET bem é o aumento da intensidade do canal de dador FRET após FRET aceitador de branqueamento (etapa 4). (B) FRET eficiências podem ser quantificados como indicado para as regiões sinápticas individuais ou em sinapses inteiras. Para consulta, as imagens antes e depois FRET receptor de branqueamento são mostrados com o uso de duas tabelas de pesquisa (LUTs, verde e física). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Figura 7. molécula única FRET eventos aparecem e desaparecem passos insingle e estão perfeitamente alinhados com um único fluoróforo aceitador FRET. O lapso de tempo do evento FRET única molécula é mostrado. As imagens foram obtidas utilizando uma câmara EMCCD retro-iluminado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Figura 8. Determinação τ off = 1 / k fora de trajetórias smFRET medidos. (A) As somas cumulativas normalizadas de sinais observáveis ​​(FRET derivados de H57 scF V -AF555 decorados 5c.c7 TCR blastos de células T transgênico reconhecendo IE &lt;sup&gt; K / K3-AF647 a 24 ° C) durante quatro desfasamentos de tempo diferentes (42 ms, 490 ms, 1007 ms, 1989 ms) foram representados graficamente como uma função do número total de observações. Funções de ajuste monoexponencial dar origem a que corresponde o inverso negativo dos valores esperados &lt;n (t lag)&gt;. (B) valores esperados foram plotados contra atrasos t lag e montado usando a equação &lt;n (t lag)&gt; = τ off / {(x off / &lt;n branquear&gt;) + t lag} para produzir τ off e &lt;n branquear&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este manuscrito descreve como conduzir ensaios baseados em Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) (molécula única) para medir a dinâmica de ligação entre o receptor de antígeno de célula T (TCR) e moléculas de MHC carregadas com peptídeos antigênicos à medida que ocorrem dentro da sinapse imunológica de uma célula T em contato com uma bicamada lipídica planar funcionalizada.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Neste vídeo, mostraremos como medir a cinética entre o receptor de antígeno de célula T e o complexo principal de histocompatibilidade carregado com peptídeo, ou PMHC, em C dois, que está dentro da sinapse imunológica entre uma célula T e uma bicamada lipídica planar suportada. Orientaremos brevemente sobre aspectos importantes da produção de proteínas e da verificação da integridade funcional da bicamada lipídica por meio de medidas de fluxo de cálcio. Para obter informações mais detalhadas sobre como preparar a bicamada lipídica e como configurar um microscópio de fluorescência de molécula única, consulte nossa contribuição paralela no Journal of Visualized Experiments. Em seguida, explicaremos em detalhes como realizar e analisar medições de transferência de energia por ressonância de Förster em conjunto e em nível de molécula única.Para deduzir a cinética da ligação sináptica do receptor de célula T ao PMHC e explicar nossa estratégia baseada em FRET usada em nossa abordagem geral, começamos com a estrutura cristalina do receptor de célula T, ou TCR, aqui em azul, enquanto ele se liga ao seu antígeno, a molécula de MHC carregada com peptídeo ou PMHC mostrada em amarelo e vermelho. Também introduzimos um fragmento de cadeia simples dos domínios variáveis de um anticorpo reativo ao receptor de célula T beta denominado age 57. Para medições quantitativas baseadas em FRET, é obrigatório marcar tanto o doador de FRET, em nosso caso o fragmento de cadeia simples, quanto o receptor de FRET, o PMHC, de maneira específica ao sítio.Isso é viável para proteínas recombinantes mediante a introdução de uma cisteína não emparelhada, que pode então ser ligada covalentemente ao fluoróforo conjugado ao ácaro. Como mostrado, ligamos o doador Alexa Fluor 5 5 5 ou side three ao fragmento de cadeia simples e ao aceptor fret. Alexa flow 6, 4 7 ou SI cinco à extremidade C do peptídeo ligado ao MHC.A distância Indy conforme mostrada nesta estrutura composta é de aproximadamente 41 angstrons, ainda menor que o primeiro raio, a distância de transferência máxima de energia pela metade entre os dois corantes. Em nossos experimentos, utilizamos bicamadas lipídicas suportadas em vidro plano como células apresentadoras de antígeno simuladas. Estas são funcionalizadas com PMXC, a molécula sinalizadora B sete um e a molécula de adesão I quim um.Dessa forma, a imagem pode ser obtida no modo de fluorescência por reflexão interna total, que ilumina o fluoróforo em proximidade próxima à interface, reduzindo substancialmente o fundo celular. A ressonância de transferência de energia de fluorescência (FRET) só é detectável quando os fragmentos de cadeia simples marcados de TCRs estão se ligando às HCPs da membrana incorporadas na camada. Isso nos permite visualizar a ligação TCR-PMHCP e, em seguida, calcular a cinética de ligação na TCM de histogênio adequadamente dobrada.As porções extracelulares da P sete um e da I quim um são purificadas a partir de sobrenadantes de culturas de células de inseto infectadas com o vírus BUC correspondente. A purificação é realizada em três etapas, iniciando com cromatografia de afinidade por níquel anti aros, seguida por troca iônica e cromatografia de exclusão por tamanho. Heterodímeros de MHC Classe dois com marcação por histidina são expressos em e coli como corpos de inclusão e renaturados in vitro a quatro graus Celsius e na presença de um peptídeo espaçador por meio de diluição rápida em tampão redox.O peptídio espaço reservado será posteriormente clivado mediante exposição à luz UV. Complexos PMHC corretamente dobrados são então purificados e concentrados com o espaço reservado. O peptídio é clivado e substituído em pH 5,2 pelo peptídio fluorescente.O produto final é purificado por tamanho. O fragmento de cadeia simples é expresso com uma cisteína não pareada como corpos de inclusão em *E. coli*, refoldado *in vitro* por diálise em etapas e purificado por tamanho. Em seguida, é marcado por meio de sua cisteína não pareada com um corante conjugado a maleimida e novamente purificado por tamanho.Todas as proteínas recombinantes são finalmente submetidas à diálise contra PBS contendo 50% de glicerol, concentradas até um miligrama de proteína por mililitro e armazenadas a longo prazo a menos 20 graus Celsius. Utilize o corante ratiométrico URA dois para medir os níveis intracelulares de cálcio em linfócitos T como forma de verificar a potência estimulatória do lipossoma. Incube os linfócitos T ativados com o éster da URA 2.Esse composto entra nas células por meio de seu grupo AM, mas é então retido no interior pela ação de esterases, que removem a parte AM. Adicione fira 2:00 AM a cerca de 3 milhões de linfócitos T em uma concentração final de cinco micromol por litro. Transfira as células da placa de 24 poços para um novo tubo e incube à temperatura ambiente por 30 minutos.Lave as células uma vez com tampão de imagem contendo solução salina tamponada com Hank, incluindo cálcio e magnésio, e 1% de albumina. Para monitorar o cálcio intracelular, utilize um sistema automatizado de microscópio invertido com capacidade para luz ultravioleta. Inicie o protocolo de cronometragem e adicione menos de duas células T carregadas à bicamada lipídica funcionalizada posicionada em foco na platina do microscópio, adquirindo em intervalos regulares de tempo uma imagem de contraste de interferência diferencial (DIC) e duas imagens fluorescentes excitadas com luz ultravioleta de 340 e 380 nanômetros.Imediatamente após o contato com a bicamada, os linfócitos T adotam níveis elevados de cálcio, conforme indicado pela razão URA dois, 15 minutos após o início do experimento. Adicione um anticorpo bloqueador às células, que satura todos os antígenos PMHC. Como consequência, os níveis intracelulares de cálcio diminuem até os valores do estado não ativado, os quais servirão posteriormente como referência.Assim que os níveis do anticorpo bloqueador presentes diminuírem para um valor que reflita o estado não ativado, que normalizamos como um para as medições de FRET, as células T precisam ser coradas com uma sonda de fragmento de cadeia simples reativa ao TCR para FRET em cada experimento, transfira cerca de 1 milhão de células para um tubo e centrifugue-as a 400 ×g. Decante o meio e remova as gotas residuais de meio, secando as paredes internas com uma toalha de papel. Isso garante um volume de incubação mínimo de cerca de 30 microlitros, como mencionei anteriormente.O fret prope é armazenado na concentração de um miligrama por mililitro e 50% de glicerol a menos 20 graus Celsius. É marcado especificamente no local com Alexa, flu de 5, 5 5, também três Na proporção proteína-anticorpo de um por 0,3 microlitros da sonda por células. Agite suavemente o pellet várias vezes e incube as células por 20 minutos no gelo.Lave as células com tampão de imagem frio. Repita este procedimento de lavagem uma vez. A incubação, a centrifugação e o armazenamento em baixa temperatura garantem que os linfócitos T não internalizem a sonda fluorescente enquanto expostos a ela.Isso resultaria em fluorescência de fundo elevada. Além disso, os linfócitos T não perdem a sonda no frio durante a lavagem e o armazenamento antes de colocar a câmara contendo o bicamada na platina do microscópio. Substitua o PBS sucessivamente pelo tampão de imagem, evitando a exposição do bicamada ao ar a todo custo, pois isso o destruiria.Para reduzir o fundo celular, utilizamos iluminação por reflexão interna total. Para isso, posicionamos o feixe de excitação em um ângulo crítico no qual ocorre reflexão interna total. Desligue a excitação, ligue a luz ampla e adicione o linfócito T à câmara ltec, deixando-os assentarem sobre a bicamada lipídica.Ative a excitação e foque em uma iluminação não difusa. A membrana celular é observada como um anel ao longo do eixo óptico em todos os planos focais; apenas na região difusa é visível a membrana basal em contato com a bicamada. Planos focais superiores já não são excitados e, portanto, não são visíveis.O protocolo de temporização inicia com as pilhas de excitação vermelha e verde para a aquisição de imagens de PMHC e TCR, seguido por um pulso de branqueamento vermelho para ablação do aceitador P-M-H-C-F. Um pulso verde para imagens do TCR após o branqueamento do aceitador F fat, e um pulso vermelho para verificar a ablação do aceitador F são realizados em uma escala de tempo inferior a um segundo, com o menor atraso possível entre o primeiro e o segundo pulso verde. Opcionalmente, uma imagem DIC pode ser obtida no início; a separação de imagens em duas cores permite a detecção simultânea dos canais do doador marcado e do aceitador marcado.A excitação do aceitador indica mostra a acumulação de pMHC na sinapse de células T. Esta imagem pré-bleaching verifica a presença de pMHCs e indica ligação já mediada pelo TCR. Excitante. O doador indica gera imagens em ambos os canais.O sinal do canal doador alimentado é reduzido em intensidade até certo ponto devido à transferência de energia para o canal aceptor F. O sinal do canal aceptor fret é composto pelo vazamento fret do doador alimentado e pela excitação cruzada do aceptor fret. De qualquer forma, esta imagem não será utilizada para análise.No protocolo atual, uma pilha de alvejamento rápida segue e elimina toda a força fluoro F aceita. A intensidade da imagem do doador F após o alvejamento aceitável por fret agora é recuperada para níveis mais altos sem perda de intensidade no canal fre.A expectativa do aceptor de FRET verifica o branqueamento completo do aceptor de gordura F. Vamos ampliar a sinapse para quantificar a recuperação do doador alimentado. Determine a intensidade média de fundo, uma constante independente do aceptor de FRET.Fotobranqueamento, em seguida, determina-se a intensidade média da sinapse e a de um agrupamento representativo de TCR. O rendimento de FRET é então calculado normalizando a diferença antes e após a ablação do aceptor F. No nosso exemplo, medimos 16% FRET para toda a sinapse e 26% FRET para o representativo.Os rendimentos de FRET dos agrupamentos de TCR serão posteriormente convertidos em ocupações de TCR, que permitem obter dados de molécula única da constante de dissociação sináptica bidimensional. Isso nos permite deduzir a cinética da ligação sináptica de TCR ao peptídeo-MHC em experimentos de FRET de molécula única. Utilizamos os mesmos reagentes e estratégia laboratorial do que anteriormente.No entanto, para garantir que realmente observamos a interação entre um único TCR e um único peptídeo MHC, optamos por atender ao seguinte critério. Um evento candidato a uma única molécula fre deve coincidir com a molécula aceitadora fre ou doadora fre de única molécula. Aqui empregamos um único PMHC como molécula aceitadora fre para verificar a natureza de molécula única do evento fre observado, mas com a lógica oposta.Usar doadores com excitação em comprimentos de onda mais altos e aceitores com excitação em comprimentos de onda mais baixos é certamente uma opção. Normalmente, expomos células T em contato com um lipídio estimulatório usando excitação em 514 e 647 nanômetros, com excitação sequencial e repetitiva de doador e aceitador, seguida por um atraso de tempo mínimo de um milissegundo. Esse tempo de atraso pode ser variado de acordo com os requisitos do experimento.Para obter um sinal fluorescente suficientemente forte para a detecção individual de um dado dentro de milissegundos da excitação, precisamos aplicar altas densidades de potência de excitação, variando entre um e cinco quilowatts por centímetro quadrado. Devido ao fotodesvanecimento, o número de moléculas aceptoras de fluorescência PMHC visíveis diminui rapidamente para um nível em que a força fluorescente individual do aceptor FRET se torna distinguível em uma bicamada contendo 30 ou mais PMHCs marcados por micrômetro quadrado. Um exemplo é mostrado aqui para um atraso temporal total de 42 milissegundos.Um único evento de fret marcado com o círculo vermelho torna-se visível no segundo e terceiro ponto temporal. Ele co-localiza com uma única molécula de S cinco marcada com um círculo verde. Neste exemplo, o evento de fret observável possui um comprimento de traçado igual a dois; colete mais traçados de fret de molécula única conforme mostrado na tabela com um total de 128 traçados.Em seguida, calcule a soma cumulativa complementar dos traços conforme indicado pelos números verdes e normalize-os conforme mostrado nos valores normalizados do gráfico e ajuste-os com uma função exponencial mono. O valor esperado é um pouco mais de 1,5 intervalos de tempo. Esse valor depende da ligação do peptídeo TCR ao MHC e do fotodesvanecimento; para ser capaz de discriminar entre essas duas contribuições, o valor esperado deve ser calculado para pelo menos três tempos diferentes.Os gráficos agora representam todos os valores esperados em função dos respectivos intervalos de tempo e ajustam os pontos de dados à função apresentada, que contém aqui o tempo de vida de 2,12 segundos e o valor esperado para FOTODESFALECIMENTO f Fred. A recuperação do doador após o esgotamento aceitável de f Fred, conforme mostrado aqui e com mais detalhes anteriormente, pode ser utilizada para determinar em apenas alguns passos as constantes de dissociação bidimensionais conforme são efetivas na sinapse imunológica.Aqui focamos nossa análise no engajamento do TCR e nos aglomerados de TCR onde a ligação T-C-R-P-M-H-C é mais acentuada. Como se torna evidente a partir das medições mostradas, os valores de F FRED variam substancialmente para aglomerados individuais de TCR.A multiplicação de F fred pelo fator de proporcionalidade C resulta na ocupação do TCR, um termo que descreve a razão entre o número de TCRs ligados ao pMHC e seu número total. C deve ser determinado uma vez para um conjunto específico de pares fre e para o sistema FRE empregado. No final desta apresentação, explicaremos com mais detalhes como determinar C, por exemplo, o que envolve o SI três e o SI cinco posicionados especificamente no fragmento de anticorpo monoclonal reativo ao TCR e na extremidade C do peptídeo ligado ao MHC. Isso equivale a cerca de duas sinapses; constantes de dissociação bidimensionais podem ser calculadas a partir da ocupação do TCR denominada A e da densidade inicial de pMHCs presentes na bicamada lipídica.A relação exibida é derivada da lei da ação das massas e é explicada em mais detalhes no artigo que acompanha este vídeo. No nosso exemplo, a densidade inicial de pmcs corresponde a 30 moléculas por micrômetro quadrado. Chegamos a uma distribuição de kds 2D, que são eficazes na sinapse de células T com um valor mediano de cerca de 34 moléculas por micrômetro quadrado.A distribuição da taxa de associação pode ser calculada a partir da distribuição de KD 2D sináptica e da taxa de dissociação correspondente aqui, 0,41 por segundo, conforme determinado por meio de análise de traços de fret de molécula única a 24 graus Celsius. O valor mediano é de aproximadamente 0,01 micrômetro quadrado por molécula por segundo. Em resumo, as medidas de fret entre TCR e peptídeo MHC permitem uma análise abrangente de todos os parâmetros cinéticos que descrevem a dinâmica da reação em C dois.Essa metodologia pode, em princípio, ser generalizada para a análise de outras interações entre receptores e ligantes, pois elas podem ser fundamentais para o reconhecimento entre célula e célula. Por último, mas não menos importante, discutimos como derivar experimentalmente a constante C, que é necessária para converter os rendimentos de gordura em ocupações de TCR. Esse procedimento precisa ser realizado apenas uma vez.A constante determinada C pode então ser empregada em todos os experimentos subsequentes nos quais o mesmo sistema de fret com os mesmos fluoróforos for aplicado. Neste procedimento, baseamo-nos essencialmente nos rendimentos de fret medidos em aglomerados individuais de TCR por meio da recuperação do doador após o branqueamento fotônico do aceptor, correlacionando-os aos valores de intensidade correspondentes detectados no canal de fret sensibilizado. Como discutido anteriormente, o rendimento de fret é determinado a partir das imagens do canal doador de fret corrigidas para fundo, antes e após a ablação do aceptor de fret.O canal de fret sensibilizado precisa ser alinhado com o canal doador F e corrigido para X, Y e para o fundo. O extravasamento do doador Fred e a excitação cruzada do aceitador Fred, conforme mostrado aqui. Uma descrição detalhada de como corrigir o extravasamento do doador Fred e a excitação cruzada do aceitador Fred é fornecida no artigo.Acompanhando este vídeo, calcule agora para cada agrupamento de TCR a razão entre o sinal do marcador da imagem FRET corrigida e a respectiva imagem do doador FRET corrigida. Determine o sinal médio corrigido para doadores FRET individuais e para eventos FRET de molécula única e calcule a razão. A ocupação de TCR é então obtida multiplicando-se ambas as razões.Agora, plote os rendimentos de fret determinados para clusters individuais de TCR em função de suas ocupâncias de TCR. Em seguida, C é determinado por meio de regressão linear, conforme mostrado aqui. No nosso exemplo, corresponde a aproximadamente dois.Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de utilizar uma bicamada lipídica funcionalizada com proteína em combinação com microscopia de fluorescência de molécula única para medir a cinética de ligação sináptica entre PMHC e TCR. Todos os passos necessários, incluindo a produção da proteína, a marcação de linfócitos T e as medições finais de fret, foram discutidos. Além disso, a análise de imagem foi mostrada em detalhes, fornecendo curvas de ativação de linfócitos T e valores de fret.Por fim, foi apresentada a metodologia subjacente à determinação das taxas cinéticas de ligação e dissociação. Uma abordagem análoga pode, em princípio, ser utilizada para determinar outras interações entre receptores sinápticos e ligantes, embora possam ser necessárias modificações apropriadas.

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

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