Medição de TCR-pMHC Binding

Neste vídeo, mostraremos como medir a cinética entre o receptor de antígeno de célula T e o complexo principal de histocompatibilidade carregado com peptídeo, ou PMHC, em C dois, que está dentro da sinapse imunológica entre uma célula T e uma bicamada lipídica planar suportada. Orientaremos brevemente sobre aspectos importantes da produção de proteínas e da verificação da integridade funcional da bicamada lipídica por meio de medidas de fluxo de cálcio. Para obter informações mais detalhadas sobre como preparar a bicamada lipídica e como configurar um microscópio de fluorescência de molécula única, consulte nossa contribuição paralela no Journal of Visualized Experiments. Em seguida, explicaremos em detalhes como realizar e analisar medições de transferência de energia por ressonância de Förster em conjunto e em nível de molécula única.

Para deduzir a cinética da ligação sináptica do receptor de célula T ao PMHC e explicar nossa estratégia baseada em FRET usada em nossa abordagem geral, começamos com a estrutura cristalina do receptor de célula T, ou TCR, aqui em azul, enquanto ele se liga ao seu antígeno, a molécula de MHC carregada com peptídeo ou PMHC mostrada em amarelo e vermelho. Também introduzimos um fragmento de cadeia simples dos domínios variáveis de um anticorpo reativo ao receptor de célula T beta denominado age 57. Para medições quantitativas baseadas em FRET, é obrigatório marcar tanto o doador de FRET, em nosso caso o fragmento de cadeia simples, quanto o receptor de FRET, o PMHC, de maneira específica ao sítio.

Isso é viável para proteínas recombinantes mediante a introdução de uma cisteína não emparelhada, que pode então ser ligada covalentemente ao fluoróforo conjugado ao ácaro. Como mostrado, ligamos o doador Alexa Fluor 5 5 5 ou side three ao fragmento de cadeia simples e ao aceptor fret. Alexa flow 6, 4 7 ou SI cinco à extremidade C do peptídeo ligado ao MHC.

A distância Indy conforme mostrada nesta estrutura composta é de aproximadamente 41 angstrons, ainda menor que o primeiro raio, a distância de transferência máxima de energia pela metade entre os dois corantes. Em nossos experimentos, utilizamos bicamadas lipídicas suportadas em vidro plano como células apresentadoras de antígeno simuladas. Estas são funcionalizadas com PMXC, a molécula sinalizadora B sete um e a molécula de adesão I quim um.

Dessa forma, a imagem pode ser obtida no modo de fluorescência por reflexão interna total, que ilumina o fluoróforo em proximidade próxima à interface, reduzindo substancialmente o fundo celular. A ressonância de transferência de energia de fluorescência (FRET) só é detectável quando os fragmentos de cadeia simples marcados de TCRs estão se ligando às HCPs da membrana incorporadas na camada. Isso nos permite visualizar a ligação TCR-PMHCP e, em seguida, calcular a cinética de ligação na TCM de histogênio adequadamente dobrada.

As porções extracelulares da P sete um e da I quim um são purificadas a partir de sobrenadantes de culturas de células de inseto infectadas com o vírus BUC correspondente. A purificação é realizada em três etapas, iniciando com cromatografia de afinidade por níquel anti aros, seguida por troca iônica e cromatografia de exclusão por tamanho. Heterodímeros de MHC Classe dois com marcação por histidina são expressos em e coli como corpos de inclusão e renaturados in vitro a quatro graus Celsius e na presença de um peptídeo espaçador por meio de diluição rápida em tampão redox.

O peptídio espaço reservado será posteriormente clivado mediante exposição à luz UV. Complexos PMHC corretamente dobrados são então purificados e concentrados com o espaço reservado. O peptídio é clivado e substituído em pH 5,2 pelo peptídio fluorescente.

O produto final é purificado por tamanho. O fragmento de cadeia simples é expresso com uma cisteína não pareada como corpos de inclusão em *E. coli*, refoldado *in vitro* por diálise em etapas e purificado por tamanho. Em seguida, é marcado por meio de sua cisteína não pareada com um corante conjugado a maleimida e novamente purificado por tamanho.

Todas as proteínas recombinantes são finalmente submetidas à diálise contra PBS contendo 50% de glicerol, concentradas até um miligrama de proteína por mililitro e armazenadas a longo prazo a menos 20 graus Celsius. Utilize o corante ratiométrico URA dois para medir os níveis intracelulares de cálcio em linfócitos T como forma de verificar a potência estimulatória do lipossoma. Incube os linfócitos T ativados com o éster da URA 2.

Esse composto entra nas células por meio de seu grupo AM, mas é então retido no interior pela ação de esterases, que removem a parte AM. Adicione fira 2:00 AM a cerca de 3 milhões de linfócitos T em uma concentração final de cinco micromol por litro. Transfira as células da placa de 24 poços para um novo tubo e incube à temperatura ambiente por 30 minutos.

Lave as células uma vez com tampão de imagem contendo solução salina tamponada com Hank, incluindo cálcio e magnésio, e 1% de albumina. Para monitorar o cálcio intracelular, utilize um sistema automatizado de microscópio invertido com capacidade para luz ultravioleta. Inicie o protocolo de cronometragem e adicione menos de duas células T carregadas à bicamada lipídica funcionalizada posicionada em foco na platina do microscópio, adquirindo em intervalos regulares de tempo uma imagem de contraste de interferência diferencial (DIC) e duas imagens fluorescentes excitadas com luz ultravioleta de 340 e 380 nanômetros.

Imediatamente após o contato com a bicamada, os linfócitos T adotam níveis elevados de cálcio, conforme indicado pela razão URA dois, 15 minutos após o início do experimento. Adicione um anticorpo bloqueador às células, que satura todos os antígenos PMHC. Como consequência, os níveis intracelulares de cálcio diminuem até os valores do estado não ativado, os quais servirão posteriormente como referência.

Assim que os níveis do anticorpo bloqueador presentes diminuírem para um valor que reflita o estado não ativado, que normalizamos como um para as medições de FRET, as células T precisam ser coradas com uma sonda de fragmento de cadeia simples reativa ao TCR para FRET em cada experimento, transfira cerca de 1 milhão de células para um tubo e centrifugue-as a 400 ×g. Decante o meio e remova as gotas residuais de meio, secando as paredes internas com uma toalha de papel. Isso garante um volume de incubação mínimo de cerca de 30 microlitros, como mencionei anteriormente.

O fret prope é armazenado na concentração de um miligrama por mililitro e 50% de glicerol a menos 20 graus Celsius. É marcado especificamente no local com Alexa, flu de 5, 5 5, também três Na proporção proteína-anticorpo de um por 0,3 microlitros da sonda por células. Agite suavemente o pellet várias vezes e incube as células por 20 minutos no gelo.

Lave as células com tampão de imagem frio. Repita este procedimento de lavagem uma vez. A incubação, a centrifugação e o armazenamento em baixa temperatura garantem que os linfócitos T não internalizem a sonda fluorescente enquanto expostos a ela.

Isso resultaria em fluorescência de fundo elevada. Além disso, os linfócitos T não perdem a sonda no frio durante a lavagem e o armazenamento antes de colocar a câmara contendo o bicamada na platina do microscópio. Substitua o PBS sucessivamente pelo tampão de imagem, evitando a exposição do bicamada ao ar a todo custo, pois isso o destruiria.

Para reduzir o fundo celular, utilizamos iluminação por reflexão interna total. Para isso, posicionamos o feixe de excitação em um ângulo crítico no qual ocorre reflexão interna total. Desligue a excitação, ligue a luz ampla e adicione o linfócito T à câmara ltec, deixando-os assentarem sobre a bicamada lipídica.

Ative a excitação e foque em uma iluminação não difusa. A membrana celular é observada como um anel ao longo do eixo óptico em todos os planos focais; apenas na região difusa é visível a membrana basal em contato com a bicamada. Planos focais superiores já não são excitados e, portanto, não são visíveis.

O protocolo de temporização inicia com as pilhas de excitação vermelha e verde para a aquisição de imagens de PMHC e TCR, seguido por um pulso de branqueamento vermelho para ablação do aceitador P-M-H-C-F. Um pulso verde para imagens do TCR após o branqueamento do aceitador F fat, e um pulso vermelho para verificar a ablação do aceitador F são realizados em uma escala de tempo inferior a um segundo, com o menor atraso possível entre o primeiro e o segundo pulso verde. Opcionalmente, uma imagem DIC pode ser obtida no início; a separação de imagens em duas cores permite a detecção simultânea dos canais do doador marcado e do aceitador marcado.

A excitação do aceitador indica mostra a acumulação de pMHC na sinapse de células T. Esta imagem pré-bleaching verifica a presença de pMHCs e indica ligação já mediada pelo TCR. Excitante. O doador indica gera imagens em ambos os canais.

O sinal do canal doador alimentado é reduzido em intensidade até certo ponto devido à transferência de energia para o canal aceptor F. O sinal do canal aceptor fret é composto pelo vazamento fret do doador alimentado e pela excitação cruzada do aceptor fret. De qualquer forma, esta imagem não será utilizada para análise.

No protocolo atual, uma pilha de alvejamento rápida segue e elimina toda a força fluoro F aceita. A intensidade da imagem do doador F após o alvejamento aceitável por fret agora é recuperada para níveis mais altos sem perda de intensidade no canal fre.

A expectativa do aceptor de FRET verifica o branqueamento completo do aceptor de gordura F. Vamos ampliar a sinapse para quantificar a recuperação do doador alimentado. Determine a intensidade média de fundo, uma constante independente do aceptor de FRET.

Fotobranqueamento, em seguida, determina-se a intensidade média da sinapse e a de um agrupamento representativo de TCR. O rendimento de FRET é então calculado normalizando a diferença antes e após a ablação do aceptor F. No nosso exemplo, medimos 16% FRET para toda a sinapse e 26% FRET para o representativo.

Os rendimentos de FRET dos agrupamentos de TCR serão posteriormente convertidos em ocupações de TCR, que permitem obter dados de molécula única da constante de dissociação sináptica bidimensional. Isso nos permite deduzir a cinética da ligação sináptica de TCR ao peptídeo-MHC em experimentos de FRET de molécula única. Utilizamos os mesmos reagentes e estratégia laboratorial do que anteriormente.

No entanto, para garantir que realmente observamos a interação entre um único TCR e um único peptídeo MHC, optamos por atender ao seguinte critério. Um evento candidato a uma única molécula fre deve coincidir com a molécula aceitadora fre ou doadora fre de única molécula. Aqui empregamos um único PMHC como molécula aceitadora fre para verificar a natureza de molécula única do evento fre observado, mas com a lógica oposta.

Usar doadores com excitação em comprimentos de onda mais altos e aceitores com excitação em comprimentos de onda mais baixos é certamente uma opção. Normalmente, expomos células T em contato com um lipídio estimulatório usando excitação em 514 e 647 nanômetros, com excitação sequencial e repetitiva de doador e aceitador, seguida por um atraso de tempo mínimo de um milissegundo. Esse tempo de atraso pode ser variado de acordo com os requisitos do experimento.

Para obter um sinal fluorescente suficientemente forte para a detecção individual de um dado dentro de milissegundos da excitação, precisamos aplicar altas densidades de potência de excitação, variando entre um e cinco quilowatts por centímetro quadrado. Devido ao fotodesvanecimento, o número de moléculas aceptoras de fluorescência PMHC visíveis diminui rapidamente para um nível em que a força fluorescente individual do aceptor FRET se torna distinguível em uma bicamada contendo 30 ou mais PMHCs marcados por micrômetro quadrado. Um exemplo é mostrado aqui para um atraso temporal total de 42 milissegundos.

Um único evento de fret marcado com o círculo vermelho torna-se visível no segundo e terceiro ponto temporal. Ele co-localiza com uma única molécula de S cinco marcada com um círculo verde. Neste exemplo, o evento de fret observável possui um comprimento de traçado igual a dois; colete mais traçados de fret de molécula única conforme mostrado na tabela com um total de 128 traçados.

Em seguida, calcule a soma cumulativa complementar dos traços conforme indicado pelos números verdes e normalize-os conforme mostrado nos valores normalizados do gráfico e ajuste-os com uma função exponencial mono. O valor esperado é um pouco mais de 1,5 intervalos de tempo. Esse valor depende da ligação do peptídeo TCR ao MHC e do fotodesvanecimento; para ser capaz de discriminar entre essas duas contribuições, o valor esperado deve ser calculado para pelo menos três tempos diferentes.

Os gráficos agora representam todos os valores esperados em função dos respectivos intervalos de tempo e ajustam os pontos de dados à função apresentada, que contém aqui o tempo de vida de 2,12 segundos e o valor esperado para FOTODESFALECIMENTO f Fred. A recuperação do doador após o esgotamento aceitável de f Fred, conforme mostrado aqui e com mais detalhes anteriormente, pode ser utilizada para determinar em apenas alguns passos as constantes de dissociação bidimensionais conforme são efetivas na sinapse imunológica.

Aqui focamos nossa análise no engajamento do TCR e nos aglomerados de TCR onde a ligação T-C-R-P-M-H-C é mais acentuada. Como se torna evidente a partir das medições mostradas, os valores de F FRED variam substancialmente para aglomerados individuais de TCR.

A multiplicação de F fred pelo fator de proporcionalidade C resulta na ocupação do TCR, um termo que descreve a razão entre o número de TCRs ligados ao pMHC e seu número total. C deve ser determinado uma vez para um conjunto específico de pares fre e para o sistema FRE empregado. No final desta apresentação, explicaremos com mais detalhes como determinar C, por exemplo, o que envolve o SI três e o SI cinco posicionados especificamente no fragmento de anticorpo monoclonal reativo ao TCR e na extremidade C do peptídeo ligado ao MHC. Isso equivale a cerca de duas sinapses; constantes de dissociação bidimensionais podem ser calculadas a partir da ocupação do TCR denominada A e da densidade inicial de pMHCs presentes na bicamada lipídica.

A relação exibida é derivada da lei da ação das massas e é explicada em mais detalhes no artigo que acompanha este vídeo. No nosso exemplo, a densidade inicial de pmcs corresponde a 30 moléculas por micrômetro quadrado. Chegamos a uma distribuição de kds 2D, que são eficazes na sinapse de células T com um valor mediano de cerca de 34 moléculas por micrômetro quadrado.

A distribuição da taxa de associação pode ser calculada a partir da distribuição de KD 2D sináptica e da taxa de dissociação correspondente aqui, 0,41 por segundo, conforme determinado por meio de análise de traços de fret de molécula única a 24 graus Celsius. O valor mediano é de aproximadamente 0,01 micrômetro quadrado por molécula por segundo. Em resumo, as medidas de fret entre TCR e peptídeo MHC permitem uma análise abrangente de todos os parâmetros cinéticos que descrevem a dinâmica da reação em C dois.

Essa metodologia pode, em princípio, ser generalizada para a análise de outras interações entre receptores e ligantes, pois elas podem ser fundamentais para o reconhecimento entre célula e célula. Por último, mas não menos importante, discutimos como derivar experimentalmente a constante C, que é necessária para converter os rendimentos de gordura em ocupações de TCR. Esse procedimento precisa ser realizado apenas uma vez.

A constante determinada C pode então ser empregada em todos os experimentos subsequentes nos quais o mesmo sistema de fret com os mesmos fluoróforos for aplicado. Neste procedimento, baseamo-nos essencialmente nos rendimentos de fret medidos em aglomerados individuais de TCR por meio da recuperação do doador após o branqueamento fotônico do aceptor, correlacionando-os aos valores de intensidade correspondentes detectados no canal de fret sensibilizado. Como discutido anteriormente, o rendimento de fret é determinado a partir das imagens do canal doador de fret corrigidas para fundo, antes e após a ablação do aceptor de fret.

O canal de fret sensibilizado precisa ser alinhado com o canal doador F e corrigido para X, Y e para o fundo. O extravasamento do doador Fred e a excitação cruzada do aceitador Fred, conforme mostrado aqui. Uma descrição detalhada de como corrigir o extravasamento do doador Fred e a excitação cruzada do aceitador Fred é fornecida no artigo.

Acompanhando este vídeo, calcule agora para cada agrupamento de TCR a razão entre o sinal do marcador da imagem FRET corrigida e a respectiva imagem do doador FRET corrigida. Determine o sinal médio corrigido para doadores FRET individuais e para eventos FRET de molécula única e calcule a razão. A ocupação de TCR é então obtida multiplicando-se ambas as razões.

Agora, plote os rendimentos de fret determinados para clusters individuais de TCR em função de suas ocupâncias de TCR. Em seguida, C é determinado por meio de regressão linear, conforme mostrado aqui. No nosso exemplo, corresponde a aproximadamente dois.

Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de utilizar uma bicamada lipídica funcionalizada com proteína em combinação com microscopia de fluorescência de molécula única para medir a cinética de ligação sináptica entre PMHC e TCR. Todos os passos necessários, incluindo a produção da proteína, a marcação de linfócitos T e as medições finais de fret, foram discutidos. Além disso, a análise de imagem foi mostrada em detalhes, fornecendo curvas de ativação de linfócitos T e valores de fret.

Por fim, foi apresentada a metodologia subjacente à determinação das taxas cinéticas de ligação e dissociação. Uma abordagem análoga pode, em princípio, ser utilizada para determinar outras interações entre receptores sinápticos e ligantes, embora possam ser necessárias modificações apropriadas.