Medição de TCR-pMHC Binding In Situ Usando a microscopia Ensaio de FRET

Neste vídeo, mostraremos como medir a cinética entre o receptor de antígeno de célula T e o complexo principal de histocompatibilidade carregado com peptídeo ou PMHC em C dois que está dentro da sinapse imunológica entre uma célula T e um blay lipídico com suporte planar. Vamos guiá-lo brevemente através de aspectos importantes da produção de proteínas e verificar a integridade funcional do blay lipídico por meio de medições de fluxo de cálcio. Para obter informações mais detalhadas sobre como preparar o blay lipídico e como configurar um microscópio de fluorescência de molécula única, consulte nossa contribuição paralela No Journal of Visualized Experiments, explicaremos em detalhes como conduzir e analisar medições de transferência de energia de primeira ou ressonância em bug e em um nível de molécula única.

Para deduzir a cinética da ligação do receptor de células T sinápticas PMHC para explicar nossa estratégia baseada em trastes usada em nossa abordagem geral, começamos com a estrutura cristalina do receptor de células T ou TCR aqui em azul à medida que se liga ao seu antígeno, a molécula de MHC carregada com peptídeo ou PMHC mostrada em amarelo e vermelho. Também introduzimos um fragmento de cadeia única dos domínios variáveis de um anticorpo beta reativo do receptor de células T denominado idade 57. Para medições quantitativas baseadas em fre, é obrigatório rotular tanto o doador de fre, no nosso caso, o fragmento de cadeia única quanto o receptor de fre, o PMHC de maneira específica do local.

Isso é viável para proteínas recombinantes através da introdução de uma cisteína não arejada, que pode então ser ligada covalentemente à força de flúor conjugada com ácaros. Conforme mostrado, anexamos o doador alimentado Alexa Fluor 5 5 5 ou lado três ao fragmento de cadeia única e ao aceitador de traste. Alexa flui 6, 4, 7 ou SI cinco para o terminal C do peptídeo ligado ao MHC.

A distância de Indy, conforme mostrado nesta estrutura composta, é de cerca de 41 angstrum, ainda menor que o primeiro raio, a distância de metade da transferência máxima de energia entre as duas tinturas. Em nossos experimentos, empregamos lipídios bilares suportados por vidro planar como células apresentadoras de antígenos substitutos. Estes são funcionalizados com PMXC, a molécula ativa B sete um e a molécula de adesão I química um.

Desta forma, a imagem pode ser realizada no modo de fluorescência de reflexão interna total, que ilumina a força de flúor nas proximidades da interface, reduzindo substancialmente o fundo celular. O traste só é detectável quando os TCRs rotulados como fragmento de cadeia única estão engajados por hcs PM incorporados em camada. Isso nos permite visualizar a ligação T-C-R-P-M-H-C E então calcular a cinética de ligação em C dois histogene Tact devidamente dobrado.

Porções extracelulares de P seven one e I chem one são purificadas a partir de sobrenadantes de culturas de células de insetos infectadas com o vírus BUC correspondente. A purificação é realizada em três etapas, começando com cromatografia de afinidade anti-aros de níquel, seguida por uma cromatografia de troca de ferro e exclusão de tamanho. Os heterodímeros de classe dois são expressos em e coli como corpos de inclusão e redobrados in vitro a quatro graus Celsius e a presença de um peptídeo detentor de espaço por meio de diluição rápida em tampão redox.

O peptídeo do suporte do espaço será posteriormente clivado por meio da exposição à luz UV. Complexos PMHC devidamente dobrados, em seguida, purificaram e concentraram o suporte de espaço. O peptídeo é clivado e substituído em pH 5,2 pelo peptídeo fluorescente.

O produto final é o tamanho do suporte purificado. O fragmento de cadeia única é expresso com uma cisteína não arejada como corpos de inclusão em e coli redobrada in vitro por meio de diálise gradual e tamanho purificado. Em seguida, é rotulado por meio de sua cisteína não arejada com um corante conjugado de donzela e purificado por tamanho. Outra vez.

Todas as proteínas recombinantes são finalmente dialisadas contra PBS contendo 50% de glicerol concentrado em um miligrama de proteína por mililitro e começam a longo prazo em menos 20 graus Celsius. Use a razão métrica URA dois corante Para medir os níveis de cálcio intracelular nas células T como meio de verificar a potência estimulatória do blay lipídico. Carregue o jateamento de células T com o éster URA 2:00 AM.

Este composto entra nas células através de seu moty AM, mas é então preso dentro através da ação de esterases, que clivam a parte AM. Adicione fira 2:00 AM a cerca de 3 milhões de células T a uma concentração final de cinco micrômetros MO por litro. Transfira as células da placa de 24 poços para um novo tubo e incube em temperatura ambiente por 30 minutos.

Lave as células uma vez em tampão de imagem contendo solução salina tamponada com Hanks, incluindo cálcio e magnésio e 1% de albumina. Para monitorar o cálcio intracelular, use um sistema automatizado de microscópio invertido com capacidade UV. Inicie o protocolo de temporização e adicione menos duas células T carregadas à bicamada lipídica funcionalizada colocada em foco no estágio do microscópio, adquira em intervalos de tempo regulares, uma imagem DIC e duas imagens fluorescentes excitadas com luz UV de 340 e 380 nanômetros.

Imediatamente após fazer contato com a bicamada, as células T adotam níveis elevados de cálcio, conforme lido pela proporção URA dois 15 minutos após a corrida. Adicione um anticorpo bloqueador às células que satura todos os antígenos PMHC. Como consequência, os níveis de cálcio intracelular caem para os do estado não ativado, que servem posteriormente de referência.

Assim que os níveis atuais do anticorpo de bloqueio diminuem para um valor, que reflete o estado não ativado, que normalizamos para um para medições de trastes, as células T precisam ser coradas com uma sonda de traste de fragmento de cadeia única reativa TCR para cada experimento, transferir cerca de 1 milhão de células para um tubo e girá-las a 400 G. Decantar o meio e drenar as gotículas de meio restantes. Colando nas paredes internas com uma toalha de papel. Isso garante um volume mínimo de incubação de cerca de 30 microlitros que mencionei anteriormente.

O traste prope é armazenado na concentração de um miligrama por mililitro e 50% de glicerol a menos 20 graus Celsius. É especificamente rotulado com Alexa, gripe de 5, 5 5, também três Em uma proporção de proteína dito de um a 0,3 microlitros da sonda para as células. Agite o pellet cuidadosamente várias vezes e incube as células por 20 minutos no gelo.

Lave as células em tampão de imagem gelado. Repita este procedimento de lavagem uma vez. A incubação e o armazenamento por centrifugação em baixa temperatura garantem que as células T não internalizem a sonda fluorescente enquanto estiverem expostas a ela.

Isso resultaria em fluorescência de fundo elevada. Além disso, as células T não perdem a sonda no frio durante a lavagem e armazenamento antes de colocar a câmara de contenção bilar na troca de estágio do microscópio. O PBS sucessivamente com tampão de imagem evita a exposição da bicamada ao ar a todo custo, pois isso a destruiria.

Para reduzir o fundo celular, empregamos iluminação de grama. Para isso, posicionamos o feixe de excitação em um ângulo crítico no qual ocorre a reflexão interna total. Desligue a excitação, acenda a luz ampla e adicione a célula T à câmara ltec e deixe-a assentar no blay lipídico.

Ligue a excitação e foque uma iluminação que não seja de grama. A membrana celular é observada como um anel ao longo do eixo óptico em cada plano focal na grama, apenas a membrana basal em contato com a bicamada é observável. Os planos focais acima não são mais excitados e, portanto, não são visíveis.

O protocolo de temporização começa com as pilhas de excitação vermelha e verde para imagens PMHC e TCR, seguidas por um pulso de alvejante vermelho para ablação do abacor PMHCF. Um pulso verde para obter imagens do TCR após o branqueamento do aceptor de gordura F e um pulso vermelho para verificar se os experimentos de ablação do aceptor F são realizados em uma escala de tempo inferior a um segundo com o menor atraso possível entre o primeiro e o segundo pulsos verdes. Opcionalmente, uma imagem DIC pode ser obtida no início da divisão de duas cores da imagem permite a detecção simultânea do doador alimentado e do canal do aceitador alimentado.

A excitação do aceitador alimentado mostra o acúmulo de P HCS na sinapse das células T. Esta imagem anterior verifica a presença de pmcs e indica que a ligação PMHC já mediada por TCR. Excitante. O doador alimentado dá origem a imagens em ambos os canais.

O sinal do canal doador alimentado é, até certo ponto, reduzido em intensidade devido à transferência de energia para o canal F aceito. O sinal do canal aceito pelo traste é composto de sangramento do traste do doador alimentado e excitação cruzada do aceitador do traste. De qualquer forma, esta imagem não será usada para análise.

No protocolo atual. Uma pilha rápida de alvejante segue e elimina toda a força fluorada aceita por F. A intensidade da imagem do doador F Fed após o branqueamento aceitável do traste agora é recuperada para níveis mais altos sem perda de intensidade no canal de fre.

A expectativa do aceitador de trastes a seguir verifica o branqueamento completo do aceitador de gordura F. Vamos ampliar a sinapse para quantificar a recuperação de doadores alimentados. Determine a intensidade média de fundo uma constante, independentemente do aceptor de fre

O fotobranqueamento determina então a intensidade média da sinapse e a de um cluster TCR representativo. O rendimento do traste é então calculado normalizando a diferença antes e depois da ablação do aceptor f. Em nosso exemplo, medimos 16%fret para toda a sinapse e 26% fret para o representante.

Os rendimentos de trastes do cluster TCR serão posteriormente convertidos em ocupações de TCR, que dão origem a dados bidimensionais de molécula única da constante de dissociação sináptica. Sirva-nos para deduzir a cinética da ligação do peptídeo TCR sináptico MHC para experimentos de ameaça de molécula única F. Usamos os mesmos reagentes e estratégia de trabalho de antes.

No entanto, para garantir que realmente observemos a interação entre um único TCR e um único peptídeo MHC, optamos por atender ao seguinte critério. Um evento candidato para uma única molécula fre tem que coloquialmente com o único aceptor fre ou molécula doadora de fre. Aqui, empregamos um único PMHC como molécula aceptora de fre para verificar a natureza de molécula única do evento fre observado, mas o oposto racional.

Usar aceitadores alimentados em botões mais altos e doadores Fred e botões baixos é certamente uma opção. Normalmente expomos células T em contato com um blay lipídico estimulatório com excitação de 514 e 647 nanômetros, excitação sequencial e repetitiva de doador e aceitador com um intervalo de tempo mínimo de um milissegundo é seguida por tempo de atraso. Isso pode ser variado de acordo com os requisitos do experimento.

Para obter um sinal fluorescente forte o suficiente para detecção de matriz única em milissegundos de excitação, precisamos aplicar altas densidades de potência de excitação variando entre um e cinco quilowatts por centímetro quadrado. Devido ao fotobranqueamento, o número de moléculas aceptoras de trastes PMHC visíveis cai rapidamente para um nível em que a força de flúor do aceitador de trastes único se torna distinguível em uma bicamada contendo 30 ou mais PMCS marcadas por mícron quadrado. Um exemplo é mostrado aqui para um intervalo de tempo geral de 42 milissegundos.

Um único evento de traste marcado com o círculo vermelho torna-se visível no segundo e terceiro ponto de tempo. Ele colocaliza com uma única molécula S cinco marcada com um círculo verde. Neste exemplo, o evento de traste observável tem um comprimento de traço de dois, colete mais traços de trastes de molécula única, conforme mostrado na tabela em cerca de 128 traços.

Em seguida, calcule a soma cumulativa complementar dos traços conforme mostrado pelos números verdes e normalize-os conforme mostrado plote os valores normalizados e ajuste-os com uma função exponencial mono. O valor esperado é um pouco mais de 1,5 prazos. Este valor depende do peptídeo TCR, da ligação do MHC e do fotobranqueamento para poder discriminar entre essas duas contribuições, o valor esperado deve ser calculado para pelo menos três tempos diferentes.

Os atrasos agora plotam todos os valores esperados em relação aos seus respectivos intervalos de tempo e ajustam os pontos de dados à função mostrada que contém o tempo de vida aqui. 2,12 segundos e o valor esperado para PHOTOBLEACHING f Fred. A recuperação do doador após o branqueamento aceitável de F Fred, como mostrado aqui e em mais detalhes antes, pode ser usada para determinar em apenas alguns passos as constantes de dissociação bidimensionais, pois são eficazes dentro da sinapse imunológica.

Aqui, concentramos nossa análise no engajamento do TCR e nos clusters do TCR onde a ligação T-C-R-P-M-H-C é mais proeminente. Como fica evidente a partir das medições mostradas, os rendimentos do F FRED variam substancialmente. Para clusters TCR individuais.

Multiplicando os rendimentos de F fred pelo fator de proporcionalidade C dá origem à ocupação do TCR, Um termo que descreve a razão entre o número de TCRs ligados ao PMHC e seu número total C deve ser determinado uma vez para um conjunto específico de pares de fre e o sistema FRE empregado. No final desta apresentação, explicaremos com mais detalhes como determinar C, por exemplo, que envolve SI três e SI cinco colocados especificamente no fragmento de anticorpo de cadeia única reativo TCR R e no terminal C do peptídeo ligado ao MHC. Isso equivale a cerca de duas constantes de dissociação sinápticas e bidimensionais que podem ser calculadas a partir da ocupação do TCR denominada A e da densidade inicial de pmcs presentes no lipídio blay.

A relação exibida é derivada da lei da ação de massa e é explicada com mais detalhes no artigo que acompanha este filme. Em nosso exemplo, a densidade inicial de pmcs é de 30 moléculas por mícron quadrado. Chegamos a uma distribuição de kds 2D, que são eficazes na sinapse de células T com um valor médio de cerca de 34 moléculas por mícron quadrado.

A distribuição da taxa de ativação pode ser calculada a partir da distribuição sináptica 2D KD e da taxa de desligamento correspondente aqui, 0,41 por segundo, conforme determinado por meio da análise de traço de traste de molécula única a 24 graus Celsius. O valor médio é de cerca de 0,01 mícron quadrado por molécula em segundo. Em resumo, as medições de ameaça F entre TCR e peptídeo MHC permitem uma análise abrangente de todos os parâmetros cinéticos que descrevem a dinâmica da reação em C dois.

Esta metodologia pode, em princípio, ser generalizada para a análise de outras interações de ligantes receptores, pois podem ser essenciais para o reconhecimento de células celulares. Por último, mas não menos importante, discutimos como derivar experimentalmente a constante C, que é necessária para converter a produção de gordura em ocupações de TCR. Este procedimento precisa ser realizado apenas uma vez.

A constante determinada C pode então ser empregada para todos os experimentos subsequentes nos quais o mesmo sistema de trastes com os mesmos quatro fluor é aplicado. Neste procedimento, retransmitimos essencialmente os rendimentos de trastes medidos em clusters TCR individuais por meio da recuperação do doador após o branqueamento da foto do aceitador para os valores de intensidade correspondentes detectados no canal de traste sensibilizado. Como discutido anteriormente, o rendimento do traste é determinado a partir das imagens do canal doador do traste corrigidas pelo fundo antes e depois da ablação do aceitador do traste.

O canal do traste sensibilizado precisa ser alinhado com o canal doador F e X e Y e corrigido para o fundo. O doador de Fred sangra e Fred aceita a excitação cruzada como mostrado aqui. Uma descrição detalhada de como corrigir o sangramento do doador Fred e a excitação cruzada aceita Fred é fornecida no artigo.

Acompanhando este vídeo, agora calcule para cada cluster TCR a proporção do sinal de bug da imagem corrigida do traste e a imagem doadora do traste corrigida correspondente. Determine o sinal médio corrigido para doadores de trastes únicos e eventos de trastes de molécula única e calcule a proporção. A ocupação do TCR é então derivada pela multiplicação de ambas as proporções.

Agora, plote os rendimentos de trastes determinados para clusters TCR individuais em relação às suas ocupações de TCR. C é então determinado por meio de regressão linear, conforme mostrado aqui. Em nosso exemplo, isso equivale a uma segunda rodada.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de utilizar uma bicamada lipídica funcionalizada por proteína em combinação com microscopia de fluorescência de molécula única para medir a cinética de ligação sináptica entre PMHC e TCR. Todas as etapas necessárias, incluindo produção de proteínas, marcação de células T e as medições finais de trastes foram discutidas. Além disso, a análise da imagem foi mostrada em detalhes, produzindo curvas de ativação de células T e valores de traste.

Finalmente, a metodologia subjacente à determinação das taxas cinéticas de ativação foi mostrada. Uma abordagem análoga pode, em princípio, ser usada para determinar outras interações de ligantes de receptores sinápticos, embora modificações apropriadas possam ser necessárias.