Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

Neste vídeo, mostraremos como preparar e caracterizar bicamadas lipídicas suportadas planares biofuncionalizadas. Também descreveremos em detalhes a arquitetura de um microscópio de reflexão total interna com capacidade de detecção de molécula única. Mediremos a densidade de potência de excitação, a fluidez e a densidade de proteína da bicamada lipídica.

Vamos começar com uma breve introdução aos bicamadas lipídicas suportadas em vidro plano. Quando vesículas unilamelares pequenas encontram uma superfície de vidro limpa, elas se rompem e se espalham, formando uma bicamada lipídica contínua. Sobre uma camada de água, geralmente escolhemos materiais de palmitato.

O POPC, ou fosfatidilcolina 1-palmitoil-2-oleoil, é o lipídio predominante porque dá origem a bicamadas lipídicas fluidas à temperatura ambiente e a 37 graus Celsius. Para funcionalização, adicionamos niquel nitrilotriacetato, um lipídio sintético com um grupo funcional quelante de níquel, que se liga a proteínas marcadas com poli-histidina. Por exemplo, a molécula coestimuladora B7-1, a molécula de adesão ICAM-1 e a molécula de MHC carregada com peptídeo marcado fluorescentemente para reconhecimento por linfócitos T, como mostrado aqui. No entanto, esse sistema de bicamada pode, em princípio, ser empregado para investigar processos completamente diferentes em uma variedade de sistemas biológicos.

Devido à natureza do sistema planar, os eventos de fluorescência podem ser monitorados em modo de reflexão total interna, o que reduz substancialmente o fundo celular e é muito adequado para microscopia de fluorescência de molécula única. Para o preparo dos lipídios, são necessários os lipídios, POPC e cloreto de níquel em clorofórmio, e um frasco de fundo redondo limpo. Dissolva os lipídios na proporção desejada em clorofórmio e seque-os sob vácuo, conforme mostrado aqui. Após o tratamento sob alto vácuo durante a noite, os lipídios formam uma película na parte interna do frasco. Para a reidratação dos lipídios, utilize PBS desgaseificado, adicionando 10 mililitros do PBS desgaseificado à mistura de lipídios seca.

Não misture. Agora, para evitar a oxidação dos lipídios, encha o frasco com um gás inerte, como nitrogênio ou argônio, e gire o frasco. Os lipídios formam uma suspensão esbranquiçada.

Retire uma pequena amostra como branco para o espectrofotômetro para evitar a troca de gases durante o próximo passo. É muito importante vedar adequadamente o frasco contendo a suspensão lipídica. Utilize uma fita adesiva resistente ao calor, por exemplo, fita para autoclave, para proteção contra o ar durante a formação física usando um banho ultrassônico fechado.

Após montar o frasco, inicie o procedimento de sonicação com potência máxima de 170 watts. Sonique por 60 minutos. Devido à formação física, a turbidez diminuiu significativamente.

Isso pode ser verificado por espectrofotometria a 550 nanômetros. Utilize a alíquota retirada antes da sonicação como branco. A densidade óptica a 230 nanômetros, que é indicativa da quantidade de lipídios, deve permanecer constante.

Aqui, preenchemos pequenos tubos de ultracentrifugação com um mililitro de suspensão de vesículas e os colocamos em um rotor de ângulo fixo de uma ultracentrífuga de bancada. É muito importante usar apenas vesículas pequenas unilamelares para a preparação da bicamada. Vesículas maiores e mais densas, multilamelares, que também são formadas durante a sonicação, interferem na fluidez da bicamada e devem, portanto, ser separadas e removidas por centrifugação.

Primeiro, centrifugamos por uma hora a 150.000 G em temperatura ambiente. O sobrenadante resultante é então centrifugado por mais oito horas a 288.000 G a quatro graus Celsius. Os lamínulas de vidro devem estar muito limpos antes que vesículas lipídicas possam espalhar-se sobre eles para formar uma bicamada contínua e fluida.

Para isso, colocamos lamínulas em um suporte de teflon, que posteriormente é colocado em um recipiente de vidro. Grande cautela deve ser tomada, utilizando proteção ocular, luvas de proteção e jaleco laboratorial, e trabalhando dentro de uma cabine química. Adicionamos uma parte de peróxido de hidrogênio a 30% e, em seguida, três partes de ácido sulfúrico concentrado, gerando ácido peroximonossulfúrico, altamente reativo e oxidativo.

Essa mistura reage violentamente com substâncias orgânicas, incluindo as presentes na pele, olhos e roupas. Ela aquece imediatamente. Incube as lâminas por 30 minutos.

Segure a lamínula com uma pinça. Lave completamente o ácido de ambos os lados da lamínula limpa utilizando água destilada ou desionizada de alta qualidade. Em seguida, coloque a lamínula sobre um suporte de teflon e deixe secar por não mais de 10 minutos, para poder produzir várias bicamadas lipídicas individuais ao mesmo tempo. Colamos as lamínulas secas com cola de endurecimento rápido.

Cola epóxi de dois componentes para uma câmara Lab Tech de oito ou 16 poços. Primeiro, remova cuidadosamente a lâmina de vidro lept do seu suporte. Misture os dois componentes da cola em uma proporção de um para um.

Espalhe uniformemente nos sulcos inferiores do quadro da câmara. Coloque a lamínula limpa sobre a parte inferior do quadro da câmara coberta com cola. Certifique-se de que a cola esteja uniformemente distribuída entre a lâmina de vidro e o quadro de plástico.

Deixe a cola endurecer por 30 minutos. Dilua a suspensão física de lipídios em PBS na proporção de 1 para 10 e filtre-a através de um filtro de 0,2 mícron, adicionando 120 microlitros dessa diluição a cada poço de uma câmara de oito poços ou 60 microlitros a cada poço de uma câmara de 16 poços. Certifique-se de que toda a superfície de vidro esteja coberta e aguarde 20 minutos.

A bicamada agora se formou. Para eliminar os resíduos remanescentes, lave cada poço com 30 mililitros de PBS. Evite a exposição ao ar da superfície de vidro a todo custo. Isso destruiria instantaneamente a bicamada. Garanta que cada poço contenha o mesmo volume de tampão. Para a próxima etapa de marcação com proteína, preencha completamente cada poço e remova a cúpula líquida.

Retire 330 microlitros. Isso deixará cerca de 350 microlitros em cada poço. Para decorar a bicamada com proteínas, prepare uma mistura-mestra contendo as proteínas de escolha com poli-histidina e adicione 50 microlitros dela a cada poço.

As proteínas ligam-se ao grupo anti-cabeça de níquel do lipídio escuro para garantir resultados reprodutíveis, misturando bem, mas com cuidado, e incubando sempre por 60 minutos para remover proteínas não ligadas. Lave novamente com 30 mililitros de PBS. Vamos agora nos concentrar no hardware de microscopia.

Primeiro, ilustraremos os requisitos da microscopia de reflexão interna total para a microscopia turf baseada em objetiva. É necessário um objetivo de imersão em óleo com alta abertura numérica. O feixe de excitação a laser incidente é refletido pelo espelho dicróico e focalizado por meio de um conjunto de duas ou três lentes apenas no plano focal traseiro do objetivo.

Em seguida, a luz do laser conduz a objetiva como um feixe revestido ao longo do eixo óptico. Dessa forma, o espécime fluorescente é iluminado em toda a sua profundidade. Quando você desloca o feixe perpendicularmente ao eixo óptico, o feixe permanece colimado, mas sai da objetiva de maneira inclinada.

Se você continuar transladando, chegará a um determinado ponto ao ângulo crítico no qual o feixe é totalmente refletido na interface entre a lamínula de vidro e o espécime. A intensidade da onda evanescente resultante decai exponencialmente, e apenas estruturas próximas à interface, até algumas centenas de nanômetros, são excitadas. Agora, ilustramos como focar manualmente o feixe laser no plano focal traseiro da objetiva.

Usando três ou duas lentes com as duas primeiras lentes, o diâmetro do feixe de laser é aumentado. A razão entre seus comprimentos focais determina o tamanho do ponto de iluminação no plano do espécime. Para garantir que o feixe permaneça colimado, ajuste a distância entre essas lentes de modo que seja igual à soma dos dois comprimentos focais.

A terceira lente é usada para focalizar o feixe alargado no plano focal traseiro da objetiva. Como a distância focal dessa lente precisa acomodar as dimensões do corpo do microscópio e de um periscópio associado, ela deve ser muito mais longa em nosso caso, variando 75 centímetros. A distância entre a segunda e a terceira lente não influencia as propriedades do feixe.

Portanto, o espaço infinito entre eles pode ser utilizado para modificar o feixe de maneira definida, sem distorções. Por exemplo, é possível inserir uma abertura e projetá-la com precisão sobre o plano do espécime. Em essência, pode-se obter o mesmo resultado utilizando duas lentes em vez de três.

O sistema com duas lentes é menos definido, mas introduz menos aberrações de lente. Recursos simples, como uma abertura, ainda podem ser muito bem implementados para modulação temporal. Um laser a gás, de ferro ou estado sólido deve ser colocado diante de um obturador de escala de milissegundos, por exemplo, um obturador mecânico ou um modulador óptico total.

Uma boa alternativa é um laser de diodo, que pode ser modulado eletronicamente e não necessita de obturador externo. Dois espelhos são suficientes para direcionar o feixe para qualquer local e em qualquer direção. Como discutido anteriormente, duas lentes são usadas para ampliar o feixe e focalizá-lo no plano focal traseiro da objetiva do microscópio.

Podemos transladar o feixe para configuração em forma de camada ao deslocar o espelho inferior do periscópio sobre um trilho óptico. Para detecção de imagem, utilizamos uma câmera altamente sensível. Por exemplo, um dispositivo acoplado por carga com multiplicação eletrônica ou em CCD, ou um segundo feixe a laser de comprimento de onda diferente pode ser alinhado ao percurso do feixe.

Com o uso de espelhos e uma sobreposição dicróica. Para detecção simultânea em duas cores, colocamos um dispositivo divisor de feixe comercialmente disponível no trajeto de emissão. Para experimentos, é muito útil ter dois trajetos de feixe de excitação independentes em funcionamento.

Por exemplo, um para imageamento de campos e um segundo para fotobranqueamento ou ativação direcionados. Isso pode ser facilmente alcançado implementando um conjunto de 2 divisores de feixe 50/50. Conforme mostrado em nossa ilustração, dois sistemas diferentes de ajuste de lentes e espelhos darão origem a dois perfis de feixe e ângulos de feixe individuais.

Por exemplo, uma abertura alargada para imageamento em áreas extensas e uma mais focalizada para branqueamento ou ativação em áreas não extensas. Uma abertura pode ser colocada no feixe não extenso para moldar com precisão o ponto de branqueamento ou ativação. Duas obturadores adicionais, um para cada trajeto do feixe, permitem controle independente da comutação do feixe a laser, mantendo a objetiva em um trajeto reto e não inclinado.

Ligue o medidor de potência e ajuste-o ao comprimento de onda do laser correspondente. Meça a potência da luz do laser na objetiva e anote-a. Agora, translade o espelho atrás do microscópio para inclinar o feixe do laser na objetiva até a posição turf.

Nunca olhe diretamente para a luz do laser. No canto inferior direito, você vê o perfil de intensidade do laser de excitação, visualizado por meio da emissão de uma bicamada revestida com proteínas fluorescentes. Aqui, utilizamos uma representação em cores falsas para destacar regiões de diferentes intensidades.

Meça a intensidade média do fundo em uma região de interesse suficientemente grande. Esse valor depende das configurações específicas da câmera, como ganho EM e velocidade de leitura, e terá que ser subtraído de todas as intensidades medidas. Determine a intensidade média em toda a área iluminada.

Escolha um diâmetro grande o suficiente para que os valores de intensidade na periferia sejam semelhantes ao do fundo da câmera; meça a intensidade média da área central. Esta área define a região de interesse na qual os experimentos de microscopia serão realizados posteriormente. Agora, subtraia o valor médio de intensidade de fundo das intensidades tanto da área eliminada quanto da área central.

Em seguida, multiplique as intensidades corrigidas do fundo pelo número correspondente de pixels do tamanho da região para obter as intensidades integradas. Defina a intensidade integrada da área iluminada como um e calcule a fração para a área central. A potência medida com o medidor de potência.

No nosso caso, cinco miliwatts é diretamente proporcional à intensidade integrada de toda a área iluminada. Multiplique este valor pela fração de potência da área central para determinar a potência dentro da área central. No nosso exemplo, 1,15 miliwatt, o fator para converter o número de pixels em micrômetros quadrados depende do tamanho real do pixel do chip da câmera e da ampliação do caminho de emissão.

Pode ser facilmente determinado com uma lâmina micrométrica. No nosso exemplo, a área central corresponde a 170,8 micrômetros quadrados. A densidade de potência refere-se à potência medida dividida pela área e, portanto, equivale a 1,15 miliwatt dividido por 170,8 micrômetros quadrados ou 0,007 miliwatt por micrômetro quadrado.

Isso equivale a 0,7 quilowatt por centímetro quadrado. Para determinar a fluidez da bicamada, realizamos uma recuperação de fluorescência após o experimento de clareamento fotônico. Conforme mostrado no filme na parte inferior esquerda, imageamos a bicamada fluorescente com baixa densidade de potência.

No filme inferior direito, é possível observar a câmara correspondente do técnico de laboratório ao microscópio. Em seguida, realizamos a fotobranqueamento de uma área circular com pulsos curtos de alta densidade de potência e monitoramos a recuperação com baixa densidade de potência. Novamente, o mosaico fornece uma visão geral do experimento em diferentes pontos temporais, sendo o tempo zero os pulsos de fotobranqueamento.

Quantificamos a intensidade média de fluorescência corrigida para o fundo dentro do círculo marcado e normalizamos todas as intensidades medidas à intensidade no início do experimento. Antes dos pulsos de branqueamento, plotamos os valores de intensidade normalizados em função do tempo. O valor de saturação representa, no nosso caso, a fração móvel acima de 90%. Primeiro, obtenha uma imagem do bicamada com baixa densidade de potência de excitação.

Por exemplo, ao colocar um filtro de densidade óptica com um valor de atenuação logarítmica igual a dois, isso reduz a potência por um fator de 100. O tempo de exposição deve ser constante durante todo o procedimento e suficiente para imagens de força fluida única na densidade de potência não atenuada, no nosso caso, 10 milissegundos a 0,7 quilowatt por centímetro quadrado. Utilize representação em cores falsas para destacar áreas de diferentes intensidades.

Escolha uma região de interesse na qual serão realizadas posteriormente medições de molécula única e uma região do mesmo tamanho. Para a subtração do fundo, calcule a intensidade integrada subtraída do fundo. Agora, remova o filtro de densidade óptica do trajeto do feixe de excitação, bata a área e adquira uma imagem.

Você verá forças individuais de fluoro difundindo-se na área clareada. Cada força individual de fluoro é limitada pela difração, com um diâmetro típico de dois a três pixels; selecione uma região de sete por sete pixels ao redor de cada sinal de molécula única e uma segunda região próxima. Para a subtração do fundo, é importante quantificar apenas o sinal de forças individuais de fluoro.

Portanto, é melhor imaginar proteínas na camada BI com uma razão de proteína por proteína inferior a um ou para proteínas especificamente marcadas com SAT. Ainda mais importante do que uma razão de dieta por proteína igual a um, conforme mostrado em nosso exemplo, meça as intensidades integradas para ambas as regiões e subtraia o fundo do sinal para não considerar o último evento observado em nosso exemplo, pois provavelmente ocorreu clareamento durante a exposição média. Os sinais corrigidos aqui, fazemos isso para um flúor em quatro, que observamos ao longo de nove quadros.

No entanto, este procedimento deve ser realizado para pelo menos várias centenas de eventos de molécula isolada. Vamos retornar à nossa imagem original da bicamada observada com densidade de potência de excitação atenuada. A densidade molecular é determinada corrigindo a intensidade integrada da região de interesse para baixa densidade de potência de excitação, multiplicando-a por cem e dividindo-a pela intensidade média de molécula única e pela área.

Estamos lidando com uma densidade de 421,4 unidades de força Fluor por micrômetro quadrado. No nosso exemplo, com uma razão de dieta para proteína de um, isso equivale ao mesmo número de moléculas por micrômetro quadrado. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de preparar e caracterizar uma bicamada lipídica funcionalizada com proteína utilizando microscopia de fluorescência de molécula única.

Além disso, você deve estar familiarizado com os princípios básicos para modificar e aprimorar um microscópio padrão para esse fim. Utilizaremos posteriormente esta metodologia para determinar a cinética de ligação do antígeno ligado à bicamada aos receptores de células T ligados à célula, mas muitas outras aplicações baseadas nisso são certamente viáveis.