Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

Neste vídeo, mostraremos como preparar e caracterizar o bilar lipídico suportado planar biofuncionalizado. Também descreveremos em detalhes a arquitetura de um microscópio de reflexão interna total com recursos de detecção de molécula única. Vamos medir a densidade de potência de excitação, a fluidez e a densidade de proteína do blay lipídico.

Vamos começar com a breve introdução ao blay lipídico suportado por vidro planar. Quando pequenas vesículas unilanares encontram uma superfície de vidro limpa, elas estouram e se espalham para formar uma bicamada lipídica contígua. Em uma almofada de água, normalmente escolhemos o material da palma da mão.

A fosfocolina Ole ou POPC tem o lipídio predominante porque dá origem a bicamadas lipídicas fluidas à temperatura ambiente e a 37 graus Celsius. Para a funcionalização, adicionamos antioxidante de níquel, um lipídio sintético com um grupo de cabeça quelante de níquel, que se liga às proteínas da etiqueta de poli-histamina. Por exemplo, a molécula co-estimulatória B seven one, a molécula de adesão, ICAM one e a molécula MHC carregada com peptídeo marcado com fluorescência para reconhecimento de células T, como mostrado aqui, no entanto, esse sistema de bicamada pode, em princípio, ser empregado para abordar processos totalmente diferentes em uma variedade de sistemas biológicos.

Devido à natureza do sistema planar, os eventos de fluorescência podem ser monitorados no modo de reflexão interna total, o que reduz substancialmente o fundo celular e é muito adequado para microscopia de fluorescência de molécula única Para a preparação de lipídios, é necessário os lipídios, POPC e níquel antiox clorofórmio, e um frasco de fundo redondo limpo dissolver os lipídios na proporção desejada e clorofórmio e secá-los sob vácuo, como mostrado aqui. Após o tratamento a alto vácuo durante a noite, os lipídios formam uma película no interior do frasco. Para reidratação lipídica, use Degas PBS a 10 mililitros do Degas PBS para a mistura lipídica seca.

Não misture. Agora, para evitar a oxidação lipídica, encha o frasco com um gás inerte, como nitrogênio ou argônio, gire o frasco. Os lipídios formam uma suspensão leitosa.

Pegue uma pequena amostra como um branco para o espectrofotômetro para evitar trocas gasosas durante a próxima etapa. É muito importante selar adequadamente o frasco que contém a suspensão lipídica. Use uma fita adesiva estável ao calor, por exemplo, fita de autoclave onde a proteção do ar durante a formação física usando um banho ultrassônico fechado.

Após a montagem do balão, iniciar o procedimento de sonicação a uma potência máxima de 170 watts. Sonic Cade por 60 minutos. Devido à formação física, a turbidez caiu significativamente.

Isso pode ser verificado por espectrofotometria a 550 nanômetros. Utilizar a alíquota tomada antes da sonicação como um branco. A densidade óptica em 230 nanômetros, que é indicativa da quantidade de lipídios, deve permanecer constante.

Aqui Enchemos pequenos tubos de ultra centrifugação com uma suspensão visl de mililitro e os colocamos em um rotor de ângulo fixo de uma ultracentrífuga de mesa. É muito importante usar apenas pequenas vesículas uni laina para a preparação da bicamada. Vesículas multilaina maiores e mais densas, que também são formadas durante a sonicação, interferem na fluidez da bicamada e, portanto, devem ser empalidecidas e removidas por centrifugação.

Primeiro, giramos por uma hora a 150.000 G em temperatura ambiente. O snat resultante é então centrifugado por mais oito horas a 288.000 G a quatro graus Celsius. As luzes de vidro devem estar muito limpas antes que as vesículas lipídicas possam se espalhar sobre elas para formar uma bicamada contígua e fluida.

Para isso, colocamos lamínulas em um monte de Teflon, Que então colocamos em um exercício de recipiente de vidro. Grande cuidado onde a proteção dos olhos, luvas de proteção e um jaleco e trabalhar em um armário químico. Adicionamos uma parte de peróxido de hidrogênio a 30% e, em seguida, três partes de ácido sulfúrico concentrado para dar origem a um ácido perio mono sulfúrico muito reativo e oxidativo.

Essa mistura reage violentamente com substâncias orgânicas, incluindo as da pele, olhos e roupas. Aquece imediatamente. Incube as lâminas por 30 minutos.

Pegue a lamínula com uma pinça Lave bem o ácido em ambos os lados da lamínula limpa usando água destilada ou sindicalizada de alta qualidade. Em seguida, coloque a lâmina em um suporte de Teflon e deixe secar por no máximo 10 minutos para poder produzir várias bicamadas lipídicas individuais de uma só vez. Colamos lamínulas secas com endurecimento rápido.

Cola epóxi de dois componentes para uma câmara de tecnologia de laboratório de oito ou 16 poços. Primeiro, remova a lâmina de vidro original com cuidado de sua moldura. Misture os dois componentes da cola na proporção de um para um.

Espalhe-o uniformemente nas ranhuras inferiores da estrutura da câmara. Coloque a lamínula limpa na parte inferior coberta com cola da estrutura da câmara. Certifique-se de que a cola esteja espalhada uniformemente entre a lâmina de vidro e a moldura de plástico.

Deixe a cola endurecer por 30 minutos. Diluir a suspensão física lipídica em PBS de um a 10 e filtrá-la através de um filtro de 0,2 mícron a 120 microlitros desta diluição para cada poço de uma câmara de oito poços ou 60 microlitros para cada poço de uma câmara de 16 poços. Certifique-se de que toda a superfície do vidro esteja coberta e aguarde 20 minutos.

A bicamada agora se formou Para se livrar dos resíduos, enxágue cada poço com 30 mililitros de PBS. Evite a exposição do ar da superfície do vidro a qualquer custo. Isso destruiria instantaneamente a bicamada para garantir que cada poço contenha o mesmo volume de tampão Para a próxima etapa de decoração de proteínas, encha cada poço completamente e remova a cúpula líquida.

Retire 330 microlitros. Isso deixará cerca de 350 microlitros dentro de cada um. Bem, para decorar a bicamada com proteínas, prepare uma mistura principal contendo proteínas tecnológicas de poli-histamina de sua escolha e adicione 50 microlitros a cada poço.

As proteínas se ligam ao grupo de níquel anti-cabeça do lipídio escuro para garantir resultados reprodutíveis misturados completamente, mas com cuidado, e sempre incubar por 60 minutos para remover proteínas não ligadas. Lave novamente com 30 mililitros de PBS. Vamos agora nos concentrar no hardware da microscopia.

Primeiro, ilustraremos os requisitos da microscopia de reflexão interna total para microscopia de relva baseada em objetivos. É necessária uma objetiva de imersão em óleo com uma alta abertura numérica. O feixe de excitação do laser de entrada é refletido pelo espelho dicróico e focalizado por meio de um conjunto de duas ou três lentes apenas no plano focal traseiro da objetiva.

Em seguida, a luz do laser conduz a objetiva como um feixe revestido ao longo do eixo óptico. Desta forma, o espécime fluorescente é iluminado em toda a sua profundidade. Quando você transloca o feixe perpendicularmente ao eixo óptico, o feixe permanece agrupado, mas deixa a objetiva de forma inclinada.

Se você continuar translocando, alcançará em algum ponto o ângulo crítico no qual o feixe é totalmente refletido na interface entre a lamínula de vidro e a amostra. A intensidade da onda evanescente resultante decai exponencialmente e apenas o piso quatro, que está nas proximidades da interface até várias centenas de nanômetros, é excitado. Agora, ilustramos como focar o feixe de laser manualmente no plano focal traseiro da objetiva.

Usando três ou duas lentes com as duas primeiras lentes, o diâmetro do feixe de laser é aumentado. A proporção de sua distância focal determina o tamanho do ponto de iluminação no plano da amostra. Para garantir que o feixe permaneça agrupado, ajuste a distância entre essas lentes para que seja igual à soma de ambas as distâncias focais.

A terceira lente é usada para focar o feixe de ampliação no plano focal traseiro da objetiva. Como a distância focal dessa lente precisa acomodar as dimensões do corpo do microscópio e de um periscópio associado, ela deve ser muito maior no nosso caso, variando 75 centímetros. A distância entre as lentes dois e três não tem influência nas propriedades do feixe.

Portanto, o espaço infinito entre eles pode ser usado para modificar o feixe de maneira definida sem distorções. Por exemplo, você pode inserir uma abertura e projetar com precisão no plano da amostra. Em essência, você pode conseguir o mesmo com o uso de duas lentes em vez de três.

O sistema de duas lentes é menos definido, mas introduz menos aberrações nas lentes. Recursos simples, como uma abertura, ainda podem ser muito bem implementados para modulação temporal. Um laser de gás, ferro ou estado sólido deve ser colocado na frente de um obturador de faixa de milissegundos, por exemplo, um obturador mecânico ou um modulador óptico al.

Uma boa alternativa é um laser de diodo, que pode ser modulado eletronicamente e não precisa de desligamento externo. Dois espelhos são suficientes para direcionar o feixe para qualquer lugar e em qualquer direção. Como discutido anteriormente, as duas lentes são usadas para ampliar o feixe e focalizá-lo no plano focal traseiro do microscópio. Objetivo.

Podemos translocar o feixe para a configuração do gramado deslocando o espelho inferior do periscópio em um trilho óptico. Para detecção de imagem, usamos uma câmera altamente sensível. Por exemplo, um dispositivo acoplado de carga multiplicadora de elétrons ou um segundo feixe de laser CCDA em um comprimento de onda diferente pode ser alinhado no caminho do feixe.

Com o uso de espelhos e uma sobreposição dicróica. Para detecção simultânea de duas cores, colocamos um dispositivo de divisão de feixe disponível comercialmente no caminho de emissão. Para experimentos, é muito útil ter dois caminhos de feixe de excitação independentes no lugar.

Por exemplo, um para imagens de grama e um segundo para fotobranqueamento ou ativação direcionada. Isso pode ser facilmente alcançado implementando um conjunto de 2 50 50 divisores de feixe. Conforme mostrado em nossa ilustração, dois sistemas diferentes de ajuste de lentes e espelhos darão origem a dois perfis de feixe e ângulos de feixe individuais.

Por exemplo, um ampliado para imagens em grama e um mais focado para branqueamento ou ativação em não grama. Uma abertura pode ser colocada no feixe sem grama para moldar com precisão o ponto de branqueamento ou ativação. Dois obturadores adicionais, um para cada caminho do feixe Ative o interruptor de controle independente no feixe de laser, deixando a objetiva em um caminho reto e não inclinado.

Ligue o medidor de potência e ajuste-o para o comprimento de onda do laser correspondente. Meça a potência da luz do laser na objetiva e anote-a. Agora, transloque o espelho atrás do microscópio para inclinar o feixe de laser na objetiva para a posição de grama.

Nunca olhe diretamente para a luz do laser. No canto inferior direito, você vê o perfil de intensidade do laser de excitação visualizado através da emissão de uma bicamada decorada com proteínas fluorescentes. Aqui, usamos uma representação de cores falsas para destacar regiões de diferentes intensidades.

Meça a intensidade média do fundo dentro de uma região de interesse grande o suficiente. Este valor depende de configurações específicas da câmera, como ganho EM e velocidade de leitura, e terá que ser subtraído de todas as intensidades medidas. Determine a intensidade média em toda a área iluminada.

Escolha o diâmetro grande o suficiente para que os valores de intensidade na periferia sejam semelhantes aos do fundo da câmera para medir a intensidade média da área central. Esta área define a região de interesse na qual os experimentos de microscopia serão realizados posteriormente. Agora, subtraia o valor médio da intensidade de fundo das intensidades da área eliminada e central.

Em seguida, multiplique as intensidades corrigidas do plano de fundo pelo número de pixels correspondente do tamanho da região para chegar às intensidades integradas. Defina a intensidade integrada da área iluminada como um e calcule a fração para a área central. A potência medida com o medidor de potência.

No nosso caso, cinco miliwatts é diretamente proporcional à intensidade integrada de toda a área iluminada. Multiplique esse valor pela fração de potência da área central para determinar a potência dentro da área central. Em nosso exemplo, 1,15 miliwatt, o fator para converter o número de pixels em mícrons quadrados depende do tamanho real do pixel do chip da câmera e da ampliação do caminho de emissão.

Pode ser facilmente determinado com uma lâmina micrométrica. Em nosso exemplo, a área central corresponde a 170,8 mícrons quadrados. A densidade de potência refere-se à potência medida dividida pela área e, portanto, é igual a 1,15 miliwatt dividido por 170,8 mícrons quadrados ou 0,007 miliwatt por mícron quadrado.

Isso é 0,7 quilowatt por centímetro quadrado. Para determinar a fluidez da bicamada, realizamos uma recuperação de fluorescência após o experimento de fotobranqueamento do envoltório. Como mostrado no filme inferior esquerdo, nós

No filme inferior direito, você pode ver a câmara técnica de laboratório correspondente no microscópio. Em seguida, branqueamos uma área circular com os pulsos curtos de alta densidade de potência e monitoramos a recuperação em baixa densidade de potência. Novamente, a montagem fornece uma visão geral do experimento para diferentes pontos de tempo, com tempo zero sendo os pulsos de alvejante.

Quantificamos a intensidade média de fluorescência corrigida de fundo dentro do círculo de marca e normalizamos todas as intensidades medidas para a intensidade no início do experimento. Antes dos pulsos de branqueamento, plotamos os valores de intensidade normalizados em relação ao tempo. O valor de saturação representa a fração móvel em nosso caso acima de 90% Primeiro, tire uma imagem da bicamada em baixa densidade de potência de excitação.

Por exemplo, ao colocar um filtro de densidade óptica com um valor de atenuação logarítmica de dois, isso reduz a potência por um fator de 100. O tempo de exposição deve ser constante durante todo o procedimento e suficiente para obter imagens da força do fluido único na densidade de potência não atenuada em nosso caso, 10 milissegundos a 0,7 quilowatt por centímetro quadrado. Use a representação de cores falsas para destacar áreas de diferentes intensidades.

Escolha uma região de interesse na qual as medições de uma única molécula serão realizadas posteriormente e uma região do mesmo tamanho. Para subtração de fundo, calcule a intensidade integrada subtraída de fundo. Agora remova o filtro de densidade óptica do caminho do feixe de excitação, branqueie a área e tire uma imagem.

Você verá a força da gripe individual se difundindo na área branqueada. A força de gripe única é limitada por difração com um diâmetro típico de dois a três pixels, leva uma região de sete por sete pixels ao redor de cada sinal de molécula única e a segunda região próxima. Para subtração de fundo, é importante quantificar apenas o sinal de uma única força de flúor.

Portanto, é melhor obter imagens de proteínas na camada BI com uma proporção de proteína para proteína inferior a um ou para proteínas especificamente marcadas com SAT. Ainda mais proporção de dieta para proteína de um, como mostrado em nosso exemplo, meça as intensidades integradas para ambas as regiões e subtraia o fundo do sinal para não tomar o último evento observado mostrado em nosso exemplo, pois o branqueamento provavelmente ocorreu durante a média de exposição. Os sinais corrigidos aqui, fazemos isso para uma gripe de quatro, que observamos em nove quadros.

No entanto, este procedimento deve ser realizado para pelo menos várias centenas de eventos de molécula única. Vamos voltar à nossa imagem original de bicamada observada na densidade de potência de excitação atenuada. A densidade molecular é determinada corrigindo a intensidade integrada da região de interesse para baixa densidade de potência de excitação através da multiplicação por cem e dividindo-a pela intensidade média de uma única molécula e pela área.

Estamos lidando com uma densidade de 421,4 Fluor force por mícron quadrado. Em nosso exemplo, com uma proporção de dieta para proteína de um, isso equivale ao mesmo número de moléculas por mícron quadrado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de preparar e caracterizar uma bicamada lipídica funcionalizada por proteína usando microscopia de fluorescência de molécula única.

Além disso, você deve estar familiarizado com os princípios básicos para modificar e atualizar um microscópio padrão para essa finalidade. Posteriormente, usaremos essa metodologia para determinar a cinética de ligação do antígeno ligado à bicamada aos receptores de células T ligados à célula, mas muitas outras aplicações baseadas nisso são certamente viáveis.