Name: Fototrombose induzida por isquemia focal como um Modelo de Lesão Medular em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a induzir fototrombose focal na medula espinhal de ratos como modelo de lesão medular isquêmica. Este método minimamente invasivo permite estudar mecanismos de lesão e testar intervenções terapêuticas neuroprotetoras.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health [Grant não. R01NS069726] e da Associação Americana do Coração, em Grant Grant Aid [Grant não. 13GRNT17020004] para SD.

Nota: Os ratinhos (C57BL / 6J, macho) envelhecido 10 - 12 semanas, foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pela Universidade de Missouri Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 1. Pré-Surgery <ol><li> No dia antes da cirurgia autoclave e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos. Enrole os instrumentos e autoclave a 121 ° C a 15 psi durante 30 min seguido por 30 min de secagem (121 ° C, 15 psi, 30/30 ciclo). Coloque os instrumentos em um ambiente limpo e esterilizado até à sua utilização. </li><li> Solução fresca Rosa Bengala (RB) (20 mg / ml em solução salina estéril) toda vez que antes da cirurgia se preparar. Para dissolver completamente RB, o tubo de vórtice, em seguida, seguido por sonicação durante 5 min a 50/60 Hz, com potência de 19 W. Envoltório do tubo em folha de alumínio e proteger da luz de saída até novo utilizado durante surGery. </li><li> Prepara-se uma mistura de cetamina / xilazina em solução salina estéril. Adicionar 125 ul de xilazina (concentração estoque: 20 mg / ml) e 325 ul de ketmaine (concentração estoque: 100 mg / ml) e 550 ul de solução salina estéril para perfazer um volume final de 1 mL de mistura de anestésicos. </li><li> Pré-aquecer a almofada de aquecimento homeotérmicos. </li><li> Pré-aquecer a lâmpada de iodetos metálicos (fonte de luz para FN1 epi-microscópio de fluorescência) durante 30 minutos para estabilizar a potência da lâmpada. </li><li> Ajustar o tamanho da região iluminada a um diâmetro de 1 mm, utilizando uma objectiva 10X e retículo ajustando o diafragma de campo na vertical FN1 epi-microscópio de fluorescência. </li></ol> 2. Procedimento Cirúrgico <ol><li> Anestesiar o rato com uma dose de cetamina (130 mg / kg B. peso.) E xilazina (10 mg / kg B. peso.). Com base no cocktail em 1,3, 4 ul por g de rato B. peso. são precisos. Esterilizar o local da injecção com um algodão com álcool e administrar os anestésicos através do intra-peritoneal rota (IP). Tome cuidado para não injetar os anestésicos para os vasos sanguíneos do músculo ou como isso iria atrasar a indução e recuperação do animal. </li><li> Aplicar pomada lágrima artificial para ambos os olhos do rato para evitar a secagem e colocar o animal no almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. </li><li> Preparação de animais <ol><li> Verifique o animal para a anestesia adequada nível cirúrgico usando a resposta toe pitada. </li><li> Uma vez que o animal atingiu o nível cirúrgico de anestesia, cortar o cabelo na superfície dorsal em torno da linha média do animal usando um aparador de cabelo elétrico. Esfregar o local cirúrgico com etanol a 70% seguido por solução de betadine três vezes. Cubra o local com um campo cirúrgico estéril até o próximo passo. </li></ol></li><li> Procedimento cirúrgico para afinar o osso para expor a medula espinhal <ol><li> Colocar o rato em uma posição de bruços através da almofada de aquecimento homeotérmica na plataforma cirúrgica (Figura 1A). Corretamente proteger o ratopostura usando uma braçadeira de focinho para manter uma região de pescoço alongado (Figura 1A, B). </li><li> Faça uma incisão (cerca de 1 cm de comprimento) usando tesouras cirúrgicas ao longo de meados da linha dorsal que se estende desde o T9 vértebras torácicas para T12. Afastar a pele para expor a área cirúrgica. </li><li> Usando um bisturi, cuidadosamente limpar o músculo para expor as espinhas dorsais na T9 - T12 vértebras. Parar o sangramento em cada etapa aplicando uma pressão suave com cotonete estéril. T10 separado - T12 vértebras do músculo circunvizinho e fixá-los usando uma braçadeira vertebral para estabilizar e impedir qualquer movimento (Figura 1A, B). </li><li> Usando uma broca de alta velocidade com osso polimento broca, com cuidado e fina suavemente a superfície dorsal da vértebra T10 ou T11 para visualizar a veia vertebral posterior e outras embarcações pequenas na superfície dorsal do SC (Figura 1C). </li><li> Para evitar danos térmicos, devido ao calor gerado durante o processo de desbaste,aplicar uma corrente suave e constante de solução salina normal juntamente com sucção constante para remover os detritos. </li><li> Usando um bisturi cuidadosamente alisar a superfície do osso até que o recipiente principal é claramente visível. Tome cuidado para não danificar a medula espinhal durante este processo. </li><li> Uma vez que o vaso sanguíneo é visualizado, RB administrar a uma dose de 30 mg / kg (peso corporal) por via do seio retro-orbital usando uma seringa de insulina. </li><li> Medir o fluxo sanguíneo através de um medidor de fluxo laser de Doppler após 3 min após a injecção, se necessário, RB (Figura 2A, B). Manter a assepsia durante o procedimento inteiro. </li></ol></li></ol> 3. Indução de PT <ol><li> Colocar o animal numa fase ajustável posição XY ao longo de um Lab-Jack que pode ajustar a altura. Ajuste a posição do mouse para que a região exposta do T11 medula espinhal está diretamente sob a objetiva de 10x do microscópio FN1 epi-fluorescência (Figura 3A). </li><li> Defina o poder do lifonte GHT a 12% e irradiar a região T11 com um diâmetro de 0,75 milímetros no meio da medula espinal diluído (Nota: esta região inclui a veia vertebral posterior e outros capilares) com uma luz verde (comprimento de onda de 540-580 nm, que é conseguido pelo cubo de filtro no microscópio) através da objectiva 10X durante 2 min. Captar imagens no início e no fim de irradiação (Figura 3B, C) ​​e registar o tempo da experiência neste ponto. </li><li> Medir o fluxo de sangue de novo durante 10 minutos, se necessário, através da colocação da sonda Doppler de laser para a mesma posição acima da medula espinhal como em 2.4.8 (Figura 2A, B). </li><li> Após o check-irradiação para qualquer hemorragia e se nenhum encontrado proceder à sutura do animal. Sutura da fáscia superficial juntamente com os músculos de cada lado da medula espinhal do usando uma sutura absorvível ou tamanho 4-0 sutura de seda. Tome cuidado para não danificar o SC exposta. Sutura da pele com fio de seda 4-0. Aplicar Betadine ou iodopara as bordas da pele após a sutura. </li></ol> 4. Pós-cirurgia Cuidados <ol><li> Após a sutura, coloque o animal na almofada de aquecimento para a recuperação. Após a recuperação dos animais para verificar sinais de déficits neurológicos, observando o movimento de ambas as traseiras-membros. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> Transferir os animais para a gaiola. Não devolva o animal que foi submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. </li><li> Confira os animais em intervalos regulares. Em caso de déficits neurológicos graves, fornecer o cuidado adequado, como evacuação de bexiga, administração de analgésicos (buprenorfina, 0,05-0,1 mg / kg). Verifique se há desidratação e administrar por via subcutânea soro fisiológico normal em caso grave. Normalmente, a buprenorfina (0,1 mg / kg), será administrada após a sutura para aliviar a dor no local da cirurgia. </li><li> Se os animais não são imediatamentesacrificados após a cirurgia, vamos colocar alto teor de água dieta no chão da gaiola, para que os animais possam alcançar o alimento facilmente. </li></ol> 5. transcardial Perfusão, coloração Nissl e Immunostaining <ol><li> Transcardialmente perfundir o animal, como descrito anteriormente 17-20. <ol><li> Anestesiar o animal, tal como descrito anteriormente no protocolo e perfundir transcardíaca com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4), seguido de gelado paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS. </li><li> Após a perfusão, remover a medula espinhal (SC) e pós fixar-lo em PFA 4% em PBS a 4 ° CO / N. Transferir o SC fixo em PBS com 30% de sacarose e mantê-lo por 2 - 3 dias até que se deposita no fundo do tubo. </li><li> Usando um criostato corte da espinal medula em 30 mm de espessura e colocá-los em série em um revestido com gelatina em lâminas de vidro ou uma placa de 48 poços com 0,01 M de PBS. </li></ol></li><li> Coloração de Nissl: Para inspecionar o prejuízo causado pela PT realizar uma Nissl staining em secções da espinal medula como descrito previamente 17-20. <ol><li> Resumidamente, recolher cada quinta fatia da medula espinhal nas lâminas de vidro e mancha com 0,25% de cresilo violeta. Tome imagens dos cortes corados (Figura 4). </li></ol></li><li> A imunocoloração: Tal como anteriormente descrito utilizando um método secção 17,18,20 flutuante. <ol><li> Resumidamente, corar as secções da espinal medula por incubação O / N a 4 ° C com anticorpo de coelho anti-glia proteína fibrilar ácida (GFAP) anticorpo policlonal (1: 300), anticorpo de coelho anti-NeuN (1: 300), e anti-coelho anticorpo Iba1 (1: 500) seguido de anti-coelho de burro conjugado com Alexa 568-IgG (1: 400) de anticorpos secundários durante 4 h à TA. Captar imagens com um microscópio de fluorescência (Figura 5). </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Neste estudo, descrevemos um modelo photothrombotic de SC isquemia. Devido aos avanços na engenharia genética, tem havido uma onda de camundongos transgênicos comercialmente disponível que tornou possível estudar o impacto de genes específicos envolvidos na fisiopatologia isquêmico no SC. O objectivo do estudo foi o de desenvolver um modelo reprodutível rato de isquemia medular. Aqui nós adaptamos um modelo cortical PT para induzir SCI em camundongos. No seguimento da cirurgia da coluna vertebral e a ve...

Traumática lesão medular (LM) é uma condição clínica devastador que afeta as funções sensório-motoras e autonômicas do SC. Pacientes sobreviventes SCI muitas vezes são deixados com paraplegia debilitante que afeta significativamente suas atividades diárias e qualidade de vida 1. Modelos Experimental SCI têm sido uma ferramenta indispensável na investigação científica para compreender a fisiopatologia da SCI e processos de reparação neural associados. Estes modelos também foram utilizados para testar a eficácia pré-clínica de diversas intervenções neuroprotectores experimentais que são destinadas a recuperação funcional. Atualmente, a maioria dos modelos SCI, na prática, empregar o uso da força física sem corte para perturbar e prejudicar o SC mecanicamente. Estes métodos incluem contusão, compressão, deslocamento e transecção do SC 2. Tem sido sugerido que após o insulto mecânica primária uma lesão secundária sob a forma de conjuntos de isquemia no lesada no SC<html> 3,4. A etiologia da isquemia secundária inclui extensa degeneração do tecido, hemorragia parenquimatosa e às vezes por obstrução de vasos sanguíneos por edema do tecido 5-7. Como resultado da lesão secundária a integridade de SC é mais afectada, neurónios e células gliais são severamente prejudicada em função e viabilidade e sofrem apoptose que leva a um crescimento de infarto durante a fase crónica da lesão, análogo ao crescimento de penumbra de isquemia pós-AVC 8,9. Vários mecanismos como excitotoxicidade, produção de radicais livres, e inflamação foram relatados para ser responsável pela morte celular isquémica após uma lesão medular 10,11. Além disso, SC isquemia é uma complicação grave de cirurgias tóraco-abdominal do aneurisma da aorta, que muitas vezes levam a paraplegia nos pacientes 12,13. Apesar de tão alto impacto clínico muito poucos modelos de isquemia medular com alta reprodutibilidade estão disponíveis no momento. nt &quot;&gt; Indocianina (PT) é um método vulgarmente utilizado para a indução de isquemia focal no cérebro 14-20. A técnica é relativamente não invasivo e altamente reprodutível e produz uma lesão isquémica focal exacta da área exposta do cérebro 17 -21. Isto é conseguido por administração sistémica de corantes fotoactivos como Rose Bengal (RB) ou 16-20,22 eritrosina B 23 seguido por irradiação localizada de vasos sanguíneos com fonte de luz adequada. A fotoactivação do corante faz com que a geração de radicais livres que interromper a integridade do endotélio vascular liso, e fazer com que as plaquetas se acumulam, que subsequentemente forma um trombo. A obstrução do fluxo de sangue pelos resultados do trombo em um enfarte na região fornecido pelo vaso 24. Devido à facilidade de controlo sobre o intensidade e da duração da irradiação este procedimento produz um enfarte altamente uniforme e reprodutível. Além disso, este método pode ser empregue para induzir um enfartet em várias posições anatómicas permitindo espacial (por exemplo, substância cinzenta vs matéria branca) compreensão do efeito da isquemia. O objetivo do presente estudo é desenvolver um modelo fácil e altamente reprodutível de SC isquemia em ratinhos. Nós descrevemos o procedimento de um modelo PT de SC isquemia em ratinhos. Os resultados de histologia e imunocoloração demonstrou que a PT pode efectivamente induzir enfarte do SC, perda neuronal e gliose reactiva.

<table><tbody><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330000</td><td>20 mg/ml em solução salina estéril</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson lab</td><td>664</td><td>22 - 25 g</td></tr><tr><td>Cetamina&nbsp;</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-996-06</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Xilazina&nbsp;</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-234-11</td> Solução Betadine <td>100 mg/ml</td></tr><tr><td></td><td>Purdue</td><td>NDC-67618-150-01</td><td>Solução tópica de iodopovidona 10%</td></tr><tr><td>Solução salina normal</td><td>Abott Laboratories</td><td>04930-04-10</td><td>Para diluir RB, anestesia e para prevenir a secagem do tecido Pomada para</td></tr><tr><td>lágrimas artificiais&nbsp;</td><td>Rugby</td><td>NDC-0536-6550-91</td><td>83% de petrolato branco</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon laboratórios. Inc</td><td>2716</td><td>70% etanol para desinfecção</td></tr><tr><td>Lâmpada de iodetos metálicos</td><td>EXFO, Canadá</td><td>X-Cite 120 PC&nbsp;</td><td>Defina a potência em 12%</td></tr><tr><td>Tesoura de mola&nbsp;</td><td>Ferramenta de Ciência Fina</td><td>15000-10</td><td>para dissecção menor</td></tr><tr><td>Tesoura (inclinada para o lado)</td><td>Ferramenta de Ciência Fina</td><td>14063-011</td><td>No. 3 punho</td></tr><tr><td>Bisturi padrão Ferramenta</td> de <td>Ciência Fina</td><td>10003-12</td><td>para remover músculo</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi</td><td>Pena</td><td>2976</td><td>No. 10</td></tr><tr><td>Fórceps (curvo)</td><td>Ferramenta de Ciência Fina</td><td>11150-10</td><td>para segurar tecido</td></tr><tr><td>Fórceps (reto)</td> <td>Ferramenta de Ciência Fina</td><td>11151-10</td><td>para segurar tecido</td></tr><tr><td>Porta-agulhas&nbsp;</td><td>Ferramenta Fine Science</td><td>12002-12</td><td>para sutura</td></tr><tr><td>Cola adesiva de tecido</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td>para aderir às bordas da pele cortada</td></tr><tr><td>Polipropileno monofilamento&nbsp;</td><td>Suturas USSC</td><td>VP-521</td><td>Tamanho = 4-0 (para fáscia)</td></tr><tr><td>Perma-hand silk</td><td>Ethicon</td><td>683G</td><td>Tamanho = 4-0 (para pele)</td></tr><tr><td>Micro broca</td><td>Roboz Surgical Instrument Co. Inc.</td><td>RS-6300</td><td>com broca de polimento</td></tr><tr><td>ósseo Medidor de fluxo doppler a laser</td><td>Moor Instruments</td><td>moorVMS-LDF1</td><td>para monitorar mudanças no fluxo sanguíneo</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Ferramenta de Ciência Fina</td><td>21052-00</td><td>para prevenir hipotermia</td></tr><tr><td>Lab-Jack</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td>14-673-50</td><td>Placa de 4 x 4 pol para ajustar a altura do estágio</td></tr> de <tr><td>deslizamento X-Y do animal&nbsp;</td><td>Amscope</td><td>GT100</td><td>para posicionar o animal sob microscópio&nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

fototrombose induzida por isquemia focal como um modelo de lesão medular em ratos

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

A lesão medular (LM) é uma condição clínica devastadora que causa alterações permanentes nas funções sensório-motoras e autonômicas da medula espinhal (SC) abaixo do local da lesão. A isquemia secundária que se desenvolve após o insulto mecânico inicial é uma complicação séria da LME e prejudica gravemente a função e a viabilidade das células neuronais e não neuronais sobreviventes no SC. Além disso, a isquemia também é responsável pelo crescimento da lesão durante a fase crônica da lesão e interfere nos processos de reparo e cicatrização celular. Assim, há a necessidade de desenvolver um modelo de isquemia da medula espinhal para estudar os mecanismos da patologia induzida por isquemia. A isquemia focal induzida por fototrombose (TP) é um procedimento minimamente invasivo e muito bem estabelecido usado para investigar a patologia da morte celular induzida por isquemia no cérebro. Aqui, descrevemos o uso de TP para induzir uma lesão isquêmica na medula espinhal de camundongos. Após a injeção retro-orbital do seio de Rosa Bengala, a veia espinhal posterior e outros capilares na superfície dorsal do SC foram irradiados com uma luz verde, resultando na formação de um trombo e, portanto, isquemia na região afetada. Os resultados de estudos histológicos e imunoquímicos mostram que a isquemia induzida por TP causou infarto da medula espinhal, perda de neurônios e gliose reativa. Usando esta técnica, um modelo altamente reprodutível e relativamente fácil de LME em camundongos pode ser alcançado, o que serviria ao propósito de investigações científicas sobre os mecanismos de morte celular induzida por isquemia, bem como a eficácia de drogas neuroprotetoras. Este modelo também permitirá a exploração das alterações patológicas que ocorrem após a LME em camundongos vivos, como degeneração e regeneração axonal, sinalização neuronal e astrocítica de Ca2+ usando microscopia de dois fótons.

O objetivo deste estudo foi o de produzir isquemia medular em ratos usando um modelo PT. Após a região desejada do osso por cima da medula espinhal (T10 - T12) foi diluído, Rosa de Bengala foi injectado por via sinus retro-orbital, e a isquemia foi induzida pela PT A Figura 1A e B mostram o rato posicionado numa cirúrgico feito por encomenda. plataforma durante a cirurgia. O rato foi mantido no lugar por um grampo focinho e dois grampos vertebrado ajustável para estabilizar a coluna vertebral A ...

A fototrombose é um procedimento minimamente invasivo e altamente reprodutível para induzir isquemia focal na medula espinhal e serve como modelo de lesão medular em camundongos.

Fototrombose induzida por isquemia focal como um Modelo de Lesão Medular em Ratos

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um modelo fácil e altamente reprodutível de isquemia da medula espinhal em camundongos. Isso é realizado primeiramente realizando uma dissecação cirúrgica da superfície dorsal do camundongo para expor as vértebras de T9 a T12. Na segunda etapa, utiliza-se uma broca de alta velocidade para afinar a superfície dorsal das vértebras T10 ou T11, expondo os vasos espinhais posteriores.Um corante fotossensível é então administrado por via retro-orbital para marcar os vasos sanguíneos. Na etapa final, os vasos espinhais posteriores na superfície dorsal da medula espinhal são irradiados para induzir fototrombose no vaso sanguíneo exposto. Por fim, o resultado da lesão medular é avaliado por meio da coloração de Nissl e de imunohistoquímica.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia da isquemia da medula espinhal, pois ela pode ser usada para testar a eficácia de várias drogas neuroprotetoras destinadas a melhorar a sobrevivência celular e a recuperação após lesão medular. A demonstração do procedimento será feita por Nana, uma pesquisadora doutoranda do meu laboratório, ri ambos do laboratório da dra. She.Antes de iniciar a cirurgia, pré-aqueça a lâmpada de metal por 30 minutos para estabilizar a potência da lâmpada. Em seguida, utilizando a objetiva de 10x e a abertura de campo teórica, ajuste a abertura de campo em um microscópio de fluorescência epiluminiscente FN um ereto para definir o tamanho da região iluminada em um diâmetro de 0,75 milímetro. A seguir, aplique pomada de lágrima artificial em ambos os olhos de um camundongo anestesiado e posicione o animal sobre uma placa aquecida pré-aquecida.Confirme o estado apropriado de anestesia pela ausência de resposta ao aperto nos dedos dos pés. Em seguida, use uma máquina elétrica de corte de pelos para aparar os pelos na superfície dorsal do animal ao redor da linha média. Limpe o local cirúrgico com etanol 70%, seguido por solução de Betadine três vezes, e então cubra o animal com campo cirúrgico.Agora, posicione o animal em posição prona sobre uma plataforma cirúrgica com um tapete aquecedor homeotérmico, utilizando um prendedor de focinho para fixar o animal e manter a região do pescoço alongada. Em seguida, inicie a cirurgia fazendo uma incisão ao longo da linha média dorsal, desde a vértebra torácica T9 até a T12. Retire a pele para expor a área cirúrgica usando um bisturi, limpe cuidadosamente o músculo para expor as espinhas dorsais das vértebras T9 a T12 e estanque o sangramento conforme necessário, aplicando suavemente um cotonete estéril.Em seguida, separe as vértebras T10 a T12 do músculo circundante e fixe-as com uma pinça vertebral para estabilizar o animal e evitar qualquer movimento, utilizando uma broca de alta velocidade equipada com uma ponteira para polimento ósseo. Agora, adelgace cuidadosa e suavemente a superfície dorsal da vértebra T10 ou T11 para visualizar a veia espinhal posterior e outros pequenos vasos na superfície dorsal da medula espinhal. Tenha cuidado durante este passo, pois pressão excessiva pode fazer com que a broca penetre na cavidade espinhal e danifique a medula espinhal, enquanto um adelgaçamento ósseo irregular pode resultar na eliminação inadequada e na formação de infartos irregulares.Para prevenir danos térmicos durante o procedimento de desgaste, aplique um fluxo suave e constante de solução salina normal juntamente com sucção constante para remover os detritos. Em seguida, utilizando um bisturi, alise cuidadosamente a superfície óssea até que o vaso principal fique claramente visível, tomando cuidado para não danificar a medula espinhal.Uma vez que o vaso sanguíneo esteja visível, utilize uma seringa de insulina para administrar o corante fotossensível através do seio retro-orbital. Três minutos após a injeção, meça o fluxo sanguíneo com um medidor de fluxo a laser Doppler para induzir a fototrombose. Posicione o animal sobre uma platina ajustável em posição XY, sobre um suporte laboratorial com altura regulável, movimentando o camundongo até que a região exposta da medula espinhal esteja diretamente sob a objetiva de 10 x do microscópio.Defina a potência da fonte de luz em 12% e irradie a região exposta no meio da medula espinhal através da objetiva de 10x por dois minutos. Obtenha imagens no início e no final da irradiação, registrando o horário de cada captura de imagem. Caso nenhum sangramento seja observado, utilize um fio absorvível tamanho quatro para fechar a fáscia superficial juntamente com os músculos em ambos os lados da medula espinhal, seguido pelo fechamento da pele com o mesmo fio, então aplique antisséptico nas bordas da pele e retorne o animal para o tapete aquecido.Quando o animal tiver se recuperado completamente. Verifique sinais de déficits neurológicos observando o movimento dos dois membros posteriores para confirmar a indução da isquemia. As alterações no fluxo sanguíneo podem ser medidas com um medidor de fluxo a laser Doppler antes e após a fototrombose.Como acabou de ser demonstrado neste experimento, o fluxo sanguíneo caiu para cerca de 20% imediatamente após a iluminação com luz em comparação com o nível basal aqui; imagens fluorescentes dos vasos sanguíneos da medula espinhal no início e no fim da fototrombose são mostradas. Observe a formação de um coágulo sanguíneo após o período de iluminação de dois minutos, sugerindo a indução de isquemia e compatível com a redução do fluxo sanguíneo medida pelo fluxômetro a laser Doppler. Nesta série de cortes transversais da medula espinhal, do segmento rostral ao segmento caudal, nos centros epicentrais normais e com fototrombose induzida três dias após a fototrombose, pode-se observar uma região de infarto claramente delimitada, indicando a presença de lesão no tecido da medula espinhal e morte celular nos tecidos iluminados pela luz.De fato, a imunomarcação do tecido da medula espinhal três dias após a trombose revelou uma perda de novos neurônios positivos para end em substância cinzenta do núcleo isquêmico. Embora a expressão de GFAP tenha aumentado na borda do núcleo isquêmico, as microglías positivas para IBA1 também exibiram morfologia G OID, bem como aumento na expressão de IBA1, com um aumento geral na expressão de GFAP e IBA1 em toda a região per-infarcto, indicando morte neuronal e gliose reativa na penumbra após isquemia medular. Além disso, foram observados déficits funcionais substanciais, como a incapacidade de movimento das patas traseiras um dia após a fototrombose, nos animais lesionados.Após este procedimento, métodos como a microscopia de duas fotonos podem ser realizados para responder perguntas adicionais, tais como: quais são os papéis da degeneração axonal, regeneração e sinalização de cálcio neuronal no acidente isquêmico medular? Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como afinar a superfície dorsal das vértebras T10 e L11, e como irradiar os vasos sanguíneos espinhais posteriores expostos.

photothrombosis-induced-focal-ischemia-as-model-spinal-cord-injury

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra o procedimento para gerar AVC fototrombótico em um modelo de camundongo por iluminação a laser de um crânio intacto após a administração de corante fotossensível.

Modelagem de AVC Fototrombótico em Modelo de Camundongo: Uma Técnica de Iluminação a Laser Através do Crânio de Camundongo Após Administração de Corante Fotossensível para Induzir Fototrombose

Fonte: Elzat, E. Y. Y., et al., Estabelecendo um modelo de lesão medular por contusão em camundongos com base em uma técnica minimamente invasiva. J. Vis. Exp. (2022). Este vídeo demonstra o método para induzir uma lesão de contusão na medula espinhal no nível T9 em um modelo de camundongo, usando uma plataforma coaxial de lesão da medula espinhal. Um peso é colocado na medula espinhal de nível T9 que cria uma contusão que causa imediatamente descoloração e inchaço do tecido.

Induzindo uma contusão da medula espinhal em um modelo de camundongo usando uma plataforma coaxial de lesão da medula espinhal

Fototrombose é uma técnica rápida, minimamente invasiva para induzir pequena e bem delimitada infarto em áreas de interesse de maneira altamente reprodutível. É particularmente adequado para o estudo de respostas celulares e moleculares subjacentes plasticidade cerebral em ratinhos transgénicos.

Isquemia Photothrombotic: Um Modelo de lesão cortical fotoquímica Minimamente Invasiva e reprodutível para mouse Estudos curso

A falta de entendimento mecanicista da medula espinhal lesão de isquemia-reperfusão tem dificultado mais adjuntos para evitar paraplegia após operação da aorta alto risco. Assim, o desenvolvimento de modelos animais é imperativo. Este manuscrito demonstra reprodutível menor paralisia extremidade após oclusão da aorta torácica em um modelo murino.

Reproducable Paraplegia por Thoracic Aorta Oclusão em um modelo murino de Medula Espinhal A isquemia-reperfusão

A lesão medular é uma condição traumática que causa grave morbidade e mortalidade elevada. Neste trabalho, descrever em detalhes um modelo contusão de lesão medular em ratos, seguido por um transplante de células-tronco neurais.

Neural Stem Cell Transplantation em Experimental contusão Model of Spinal Cord Injury

Apresentamos um modelo de lesão medular contundente baseado em deslocamento de tecido que pode produzir uma lesão contundente consistente da medula espinhal em camundongos adultos.

Um Modelo de Lesão Medular Contusiva Baseado em Cilindrada de Tecidos em Ratos

Este protocolo descreve como criar uma laminectomia precisa para indução de lesão medular do tipo transecção estável no modelo do camundongo, com danos colaterais mínimos para a pesquisa de lesão medular.

Indução da lesão da medula espinhal tipo transssecção completa em camundongos

Descrito aqui é o modelo de derrame fototrombótico, onde um derrame é produzido através do crânio intacto induzindo a oclusão microvascular permanente usando iluminação laser após a administração de um corante fotossensível.

Modelagem de AVC em Camundongos: Lesões Corticais Focais por Fototrombose

Técnicas minimamente invasivas e um simples dispositivo laboratorial melhoram a reprodutibilidade do modelo de lesão medular, reduzindo os danos operatórios aos animais experimentais e permitindo a manutenção da morfologia anatômica. O método vale a pena porque os resultados confiáveis e o procedimento reprodutível facilitam as investigações dos mecanismos de reparação da doença.

Estabelecendo um Modelo de Lesão da Medula Espinhal por Contusão de Camundongo Baseado em uma Técnica Minimamente Invasiva

O presente protocolo simulando a síndrome da medula central (SCC) em camundongos melhorou a repetibilidade e minimizou os danos operacionais aos animais experimentais, evitando a ruptura excessiva da estrutura anatômica. A estratégia deste estudo é vantajosa, pois permite a pesquisa dos mecanismos de lesão ao produzir resultados consistentes.

Estabelecimento do Modelo de Síndrome do Cordão Central em Camundongos C57BL/6J

Usando uma abordagem totalmente óptica, o AVC isquêmico é induzido enquanto registra simultaneamente a atividade neuronal de Ca2+ usando um biossensor fluorescente no núcleo emergente do AVC de um camundongo acordado e comportado.

Fototrombose Simultânea e Fotometria de Fibra para Induzir e Monitorar AVC Isquêmico em Camundongos em Comportamento

Aprenda a induzir fototrombose focal na medula espinhal de ratos como modelo de lesão medular isquêmica. Este método minimamente invasivo permite estudar mecanismos de lesão e testar intervenções terapêuticas neuroprotetoras.

Fototrombose induzida por isquemia focal como um Modelo de Lesão Medular em Ratos

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