Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento

O objetivo geral deste procedimento é medir os recalcitrantes da pré-tratamento termoquímico e da hidrólise enzimática entre variantes relacionadas de biomassa. Isso é realizado primeiramente preparando as amostras de biomassa para teste quanto ao tamanho, redução e extração de amido e açúcares solúveis. O segundo passo é dispensar a biomassa com alta precisão em placas de reatores de alto rendimento compatíveis termoquimicamente.

As amostras são pré-tratadas em um reator a vapor. Em seguida, as amostras são digeridas com uma celulase comercial padrão durante três dias para hidrolisar a celulose e a hemicelulose. O passo final é a determinação da glicose e da xilose liberadas durante a hidrólise enzimática utilizando os ensaios GO pod e XDH.

Por fim, a quantificação de glicose e xilose em alto rendimento é utilizada para determinar a liberação relativa de açúcares entre amostras com base em gramas de açúcar por grama de biomassa inicial. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos em escala laboratorial, como pré-tratamento e hidrólise enzimática em escala laboratorial, é que esta técnica pode ser realizada simultaneamente em centenas ou mesmo milhares de amostras. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de conversão de biomassa, como quais cultivares ou variantes são mais suscetíveis à conversão em açúcares e produtos subsequentes.

Assim, as implicações dessa técnica podem ser estendidas para a compreensão da estrutura e função da parede celular, pois as mutações que geramos na via biossintética da parede celular podem ser analisadas quanto a alterações químicas estruturais. Este método pode fornecer informações sobre os componentes recalcitrantes da parede celular vegetal. Também pode ser aplicado a outros componentes da conversão da biomassa, como estudos de atividade enzimática e sinergia.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois ele envolve grandes conjuntos de amostras de variantes de biomassa que devem ser manipulados de forma idêntica e simultânea na escala de miligrama. Assim, exige robótica e equipamentos especializados. Para iniciar o procedimento com aproximadamente 250 miligramas de biomassa previamente moída de um saco antiestático com código de barras para um saquinho numerado, enrole cuidadosamente o saquinho, certificando-se de dobrar as extremidades sobre a biomassa para evitar perda durante o desamidamento e extração. Em seguida, feche cada saquinho usando fio de cobre revestido com estanho e registre o número do saquinho para cada amostra com código de barras.

Adicione 500 mililitros de uma solução enzimática previamente preparada sem amido a um recipiente plástico. Em seguida, adicione 120 saquinhos de chá à solução enzimática tamponada para um protocolo de processamento em lotes. Após a incubação em agitador, enxágue e mergulhe a biomassa em vários litros de água desionizada por 30 minutos, após enxágue exaustivo da biomassa desamidada.

Para remover os sais do tampão, coloque os sachês em uma coluna de soquete lit para extração. Monte o refluxo com soquete lit usando etanol 95% e extraia as amostras por 24 horas. Após a conclusão da extração, desenrole os sachês e devolva a biomassa seca ao tubo original com código de barras.

Sacos antielectrostáticos Transfira pelo menos 50 miligramas da biomassa seca para um funil com código de barras. Escaneie os códigos de barras dos sacos antieletrostáticos e do funil receptor para garantir o rastreamento preciso das amostras. Após carregar os funis em um robô de pesagem sólida, pese roboticamente cinco miligramas das amostras secas em aço inoxidável resistente a ácidos.

Placas de 96 poços pesam três réplicas de cada amostra distribuídas ao redor da placa para minimizar variações localizadas. Em seguida, adicione 250 microlitros de água desionizada a cada poço e feche as placas com fita de politetrafluoroetileno ou PTFE com revestimento adesivo de silicone. Usando uma ponta de ferro de solda de um oitavo de polegada, perfure a fita de PTFE em cada orifício de vapor.

Para cada placa, prenda firmemente as placas com juntas de PTFE reforçado com vidro de 0,031 polegada de espessura entre as placas, utilizando placas vazias na parte superior e inferior da pilha. Pré-trate as amostras usando um reator a vapor ajustado a 180 graus Celsius por 17,5 minutos. Ao finalizar, resfrie as placas do reator até 50 graus Celsius inundando-as com água desionizada.

Quando as placas estiverem frias, centrifugue-as em um rotor de balde oscilante a 1700 ×g por 20 minutos. Em seguida, remova o filme superior.

Adicione 40 microlitros da solução estoque de enzima a 8% previamente preparada a cada poço após o refechamento com nova fita de PTFE. Coloque a placa selada em um grampo magnético para placa. Misture suavemente as amostras por inversão, pelo menos 15 vezes, e incube a 50 graus Celsius por 70 horas. Após a incubação, as placas reatoras são misturadas e centrifugadas.

Em seguida, o robô de manipulação líquida é utilizado para realizar a quantificação de glicose e xilose por meio de ensaios colorimétricos ligados a enzimas, desidrogenase de xilose, ou XDH para xilose, e glicose oxidase, peroxidase, ou GO-POD para glicose. A plataforma é montada com reservatórios dos reagentes GO-POD e XDH, bem como água para diluição e suportes de ponteiras de 200 microlitros com 96 canais para cada reagente. Essas ponteiras são reutilizadas em múltiplas placas de reator.

O deck também contém ponteiras descartáveis de 200 microlitros para remoção de água e adição do padrão de açúcar, bem como padrões de açúcar pré-prontos. Em frascos HPLC do carrossel de armazenamento, o robô traz três placas de microtitulação transparentes, uma para a realização da diluição da mistura de hidrólise e uma para cada ensaio XDH e GoPod. O manipulador move as quatro placas para posições no deck.

As ponteiras descartáveis de 96 canais e 100 microlitros são trazidas para o deck a partir do carrossel para uso na transferência do reator para a placa de diluição e da diluição para as placas XDH e go pod. Utilizando o pipetador de oito canais com amplitude variável, a água adicionada antes do pré-tratamento é removida das três poças em cada canto da placa de reator para evitar contaminação cruzada com a placa de diluição. Como essas 12 poças são usadas para os padrões de açúcar, utiliza-se a cabeça de pipetagem de 96 canais.

Com as três ponteiras em cada canto removidas, adiciona-se 180 microlitros de água aos poços da placa de diluição. Após trocar as ponteiras, os reagentes XD, H e go pod são transferidos de seus respectivos reservatórios para suas respectivas placas de ensaio, utilizando a cabeça de pipetagem de 96 canais.

Enquanto isso ocorre, os padrões de açúcar são adicionados às três cavidades de cada canto da placa de diluição. Usando a cabeça de pipetagem de oito canais, após trocar para as ponteiras menores, a cabeça de pipetagem de 96 canais é utilizada para transferir 20 microlitros do sobrenadante de hidrólise para a placa de diluição, e a placa é misturada por tri. A amostra deve ser aspirada próximo ao topo do líquido para limitar a contaminação das ponteiras por partículas de biomassa.

Após a mistura, 20 microlitros são transferidos sequencialmente. Utilizando a cabeça de pipetagem de 96 canais, transfere-se para as placas XDH e go pod. Após cada mistura por agitação, as ponteiras, o reator de amostras e as placas de diluição são devolvidos a uma grade de descarte no carrossel; as placas XDH e go pod são removidas para uma grade de carrossel separada e deixadas em repouso por uma hora antes da leitura no espectrofotômetro, utilizando um leitor de placas de 96 poços com ultravioleta visível.

Defina o comprimento de onda medido em 510 nanômetros e registre a absorbância em relação a um branco de reagente. Em seguida, ajuste o comprimento de onda medido no leitor de placas para 340 nanômetros e registre a absorbância utilizando uma espátula pequena. Dispense aproximadamente quatro miligramas da biomassa preparada em um copo de aço inoxidável de 80 microlitros projetado para o amostrador automático do espectrômetro de massas.

Usando um furador padrão, produza manualmente discos de filtro de vidro a partir de folhas de fibra de vidro do tipo ad e carregue as amostras nas grades do amostrador automático com pinça, carregando aleatoriamente as amostras nos copos para evitar viés devido à deriva do espectrômetro ao longo do tempo. Após realizar a calibração e inserir os parâmetros apropriados no espectrômetro de massas, inicie a aquisição de dados e aguarde pelo menos 60 segundos para obter dados suficientes para a coleta de espectros de fundo. Por fim, inicie o método do amostrador automático usando uma taxa de fluxo de gás carrier de hélio de 0,9 litro por minuto.

Um exemplo de tendências é um levantamento de recalcitrância de 755 variantes naturais de álamo coletadas no noroeste do Pacífico. Os resultados indicam que, à medida que a proporção entre siringil e guaiacil aumenta, a recalcitrância diminui até uma razão de aproximadamente dois, quando a melhoria da recalcitrância se estabiliza. Podem-se observar aqui pontos fora da curva onde o gene PT4CL1 foi subregulado.

No álamo, vários dos cem cultivares analisados apresentam claramente um aumento nos recalcitrantes, conforme evidenciado pela liberação reduzida de açúcares. Diferentes variedades de palha de trigo cultivadas em diversos locais e colhidas após variações nas condições de crescimento resultaram em 20 populações distintas com base nas combinações das variáveis acima. Esses conjuntos de amostras são facilmente diferenciados e indicam variáveis positivas e negativas.

Para a pirólise de materiais resistentes, a espectrometria de massas com feixe molecular pode ser usada para avaliar alterações na composição da parede celular. Fragmentos espectrais de massas são atribuídos a diferentes monômeros de lignina. Ao comparar uma amostra com alto teor de lignina versus alto teor de carboidrato, as diferenças nos dados espectrais são evidentes.

O uso de dados de espectrometria de massas, associado a uma análise de componentes principais, é ilustrado aqui. O gráfico de cargas dos componentes principais pode auxiliar na identificação das características químicas que estão sendo explicadas no gráfico de classificação de escores, bem como na elucidação das características que mudam entre os agrupamentos de amostras. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para analisar milhares de amostras por semana, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ser o mais consistente possível e comparar apenas amostras dentro de um conjunto relacionado.

Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que outros pesquisadores trabalhassem em métodos de triagem de alto rendimento e outras áreas relacionadas à recalcitrância da parede celular vegetal, utilizando substâncias como líquidos iônicos e pré-tratamento alcalino. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar, manipular e analisar adequadamente grandes conjuntos de amostras de biomassa em escala microscópica para identificar diferenças na recalcitrância, por meio da redução de tamanho e extração, pré-tratamento termoquímico e hidrólise enzimática. Lembre-se de que trabalhar com alta pressão, vapor e equipamentos automatizados é extremamente perigoso e que todas as precauções de segurança devem ser tomadas, como o uso de equipamentos de proteção individual, além de ter travas de segurança em todos os equipamentos durante a realização desses procedimentos.