Name: Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a medir a recalcitrância da biomassa lignocelulósica usando pré-tratamento termoquímico e hidrólise enzimática de alto rendimento. Este método identifica matérias-primas ideais para biocombustíveis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer à estagiária Evelyn Von Neida, que forneceu informações primordiais sobre a preparação de amostras de biomassa para ambos os dutos de alto rendimento discutidos neste manuscrito. O apoio para o desenvolvimento deste trabalho e manuscrito foi fornecido pelo Centro de Ciências da Bioenergia. O Centro de Ciências da Bioenergia é um Centro de Pesquisa em Bioenergia do Departamento de Energia dos EUA apoiado pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental do Escritório de Ciência do DOE. O Laboratório Nacional de Energia Renovável (NREL) é um laboratório nacional do Escritório de Eficiência Energética e Energia Renovável do DOE dos EUA, operado para o DOE pela Alliance for Sustainable Energy, LLC. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA sob o Contrato No. DE-AC36-08-GO28308 com o Laboratório Nacional de Energia Renovável.

1. alta taxa de transferência de Determinação de Glicose rendimentos e xilose Seguindo enzimática Sacarificação 9,29 <ol><li> Preparação de Amostras (Grinding, De-starching, extracção, pré-tratamento) <ol><li> Moer, pelo menos, 300 mg de cada amostra de biomassa usando um moinho de facas, de modo a que as partículas passam através de uma malha 20 (850 um) de tela. Transferir para sacos zip-top anti-estáticos (normalmente com código de barra) e informações de exemplo registro no banco de dados de código de barras. </li><li> Adicionar cerca de 250 mg ou mais da biomassa aérea do saco anti-estática para uma numerada (com lápis, não use tinta ou marcador) tea-bag, cuidadosamente arregaçar as saquinhos de chá, certificando-se de dobrar as extremidades através da biomassa para evitar perda durante de-starching e extração. </li><li> Enrole o saquinho fechado com fio de cobre revestido de estanho. Registe o número do saquinho de chá para cada amostra de código de barras. </li><li> Preparar a solução de enzima-starching de enzimas comerciais (tipicamente, 0,25% (v / v) de glucoamilase (~ 1.600 AGU / L) e1,5% (v / v) de alfa-amilase (~ 2.900 KNU-S / L) em acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0)). Preparar 16 ml por g de biomassa ou volume de 500 ml por 120 amostras do saquinho de chá. Nota: Cargas capazes de remover o amido a partir de biomassa no solo deve ser determinado empiricamente através de testes de amido após a digestão com uma gama de cargas de enzima e rácios. </li><li> Em um recipiente de plástico, adicionar 16 ml de solução de enzima-starching de por 1 g de biomassa chão grandes quantidades. Para um protocolo de-starching lote, adicionar 120 saquinhos para 500 ml da solução tampão de enzima. </li><li> Incubar em um agitador a 55 ° C durante 24 (± 4) horas, a 120 rpm para remover possível amido. </li><li> Após a incubação de-engomar, lavar e aproveitar a biomassa em vários litros de água deionizada por 30 min. Repetir este processo mais duas vezes para remover os sais do tampão que pode causar esbarrar (formação de bolhas de gás na solução que pode resultar em um aumento súbito e violento no nível da solução, fazendo com etanol quente para o líquido em cascatapara fora do vaso de reacção) durante a extracção. </li><li> Após a lavagem exaustiva da biomassa engomado-de, colocar os saquinhos para a coluna de extracção de Soxhlet para. Nenhuma dedal é necessário para este passo. </li><li> Configure o refluxo Soxhlet, utilizando 95% de etanol e extrair as amostras durante 24 horas. </li><li> Remover os saquinhos do reactor de Soxhlet e espalhado em uma única camada sobre um tabuleiro plano. </li><li> Permitir que as amostras para secar durante a noite à temperatura ambiente numa hotte. </li><li> Desenrole os saquinhos de chá e voltar a biomassa seca para originais sacos anti-estáticos com código de barras. Nota: Os sacos anti-estáticos são eficientes em reduzir a eletricidade estática na biomassa, melhorando as características de manipulação. Se forem utilizadas outras opções de armazenamento, a biomassa adicional pode ser necessário devido ao apego biomassa para o lado do recipiente de armazenamento. </li><li> Transferir, pelo menos, 50 mg de biomassa seca para um funil de código de barras (utilizando mais material é melhor para uma distribuição precisa). Spode barcodes de sacos anti-estáticos e da tremonha de recepção para garantir rastreamento amostra precisa. </li><li> Hoppers carga para pesagem sólidos robô, prestando muita atenção à ordem das amostras nos racks. Carregar placas reactor suficiente para conter todas as amostras e seleccionar o protocolo de distribuição com base no número de placas utilizadas. </li><li> Roboticamente pesar 5 mg das amostras secas (± 0,3 mg) em aço inoxidável de placas de 96 poços resistentes aos ácidos. Pesar 3 repetições de cada amostra distribuídos em torno da placa para minimizar quaisquer variações localizadas. </li><li> Incluir 8 amostras de biomassa controle de um material padrão de biomassa bem caracterizado, a fim de acompanhar o desempenho do ensaio. Para vários pratos, o uso de múltiplos funis de biomassa padrão irá minimizar o tamanho de partícula deriva causada por peneiração nos funis ao longo de ciclos repetidos de distribuição. Nota: Em cada placa, deve ser de 24 amostras com 3 repetições, 4 espaços em branco que consistem em água desionizada e a enzima, e 8 controLS, usando o padrão de biomassa previamente caracterizados. Os poços 3 canto de cada um dos 4 cantos da placa são reservados para os padrões de açúcar. </li><li> Cheque em branco e açúcar poços de padrão de partículas de biomassa errantes e remover se presente. </li><li> Adicionar 250 ul de água desionizada a cada cavidade, e selar as placas com politetrafluoroetileno adesivo de silicone de encosto (PTFE) de fita. </li><li> Usando um &quot;ponta do ferro de solda 08/01, perfurar a fita de PTFE em cada porto de vapor (117 total) para cada prato. Use um prato vazio empilhados na placa reactor selado como um guia e para restringir PTFE movimento filme. </li><li> Prenda as placas firmemente com 0,031 &quot;juntas de espessura reforçado com vidro de PTFE (pré-perfurados com orifícios para os portos de vapor) entre as placas e placas vazios na parte superior e inferior da pilha. Pretreat as amostras utilizando um reactor de vapor definido para 180 ° C durante 17,5 min, ou outras combinações de temperatura / tempo com base na severidade desejada. </li><li> Placas de reatores Arrefecer até 50 °; C por inundações com água deionizada. </li></ol></li><li> Enzimática Sacarificação <ol><li> Prepara-se uma solução de sacarificação enzimática consistindo em 8% (v / v) de solução de enzima em citrato de sódio 1,0 M, pH 5,0. Prepare 5 ml por placa reactor. Nota: A diluição necessária deve ser determinado com base na actividade e teor de proteínas da solução de estoque de enzima específica. </li><li> Quando as placas são legais, centrifugar-los em um rotor basculante em 1500 xg durante 20 min. Remover vedação filme. Nota: Estas placas são pesados ​​e as especificações de centrifugação deverão ser verificados para compatibilidade. </li><li> Adicionar 40 ul da solução de enzima de 8% a cada poço (70 mg de enzima por g de biomassa). </li><li> Selar novamente com nova fita PTFE. Coloque placa selada em placa de fixação magnética. </li><li> Misturar suavemente as amostras por inversão (pelo menos 15 vezes), e incuba-se a 50 ° C durante 70 h. </li><li> Quando a sacarificação concluiu, misturar por inversão e centrifugar as placas a 1.500 xg durante 20 min. </li></ol></li><li> Ensaio de Açúcar <ol><li> Preparar um conjunto de 6 de glucose e xilose combinado padrões de calibração em tampão de citrato 0,014 (pH 5,0) variando de 0 a 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65, e 0,75 mg / ml recomendado) e de 0 a 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45, e 0,6 mg / ml recomendado) para a glucose e xilose, respectivamente. </li><li> Preparar a glucose-oxidase / peroxidase (goPod) e xilose desidrogenase (XDH) reagentes de acordo com as instruções do kit. </li><li> Usando uma pipeta, 200 uL de remover líquido dos poços de canto 4 e poços de bordo adjacentes às cavidades de canto (12 cavidades no total) da placa reactor. </li><li> Usando uma pipeta, 180 uL dispensar água desionizada a cada poço de uma placa de diluição de fundo plano de 96 poços de poliestireno. Não adicionar água aos poços de canto padrão e 12 açúcar (remover essas dicas se estiver usando uma cabeça de 96 canais). </li><li> Usando uma pipeta, 180 uL de reagente dispensar goPod a cada poço do ensaio de glucose plcomeu. </li><li> Usando uma pipeta, dispensar reagente XDH 180 ul a cada poço da placa de ensaio de xilose. </li><li> Usando uma pipeta, transferir 20 ul de aliquotas a partir do hidrolisado do reactor placa de 96 cavidades para a placa de diluição. Pipetar a partir da parte superior dos poços para evitar sólidos de biomassa e o líquido residual em poços de canto. Misturar por trituração para pelo menos 10 ciclos. </li><li> Usando uma pipeta, transferir 110 ul de padrões de açúcar, em duplicado, às cavidades de canto da placa de diluição. </li><li> Usando uma pipeta, transferir 20 mL alíquotas a partir da placa de diluição às placas de ensaio de glicose e xilose. Misture por trituração. </li><li> Incubar as placas de ensaio de glicose e xilose à temperatura ambiente durante 30 min. Quebre cuidadosamente quaisquer bolhas de superfície antes de ler. Uma pistola de calor passou rapidamente sobre a superfície da placa funciona bem. </li><li> Usando um de 96 poços leitor de placas ultravioleta / visível, defina o comprimento de onda medido a 510 nm e registre a absorvância contra um branco de reagente.Esta medição monitoriza a formação de quinonimina, que é proporcional à concentração de glicose. A concentração de glicose é calculada a partir da curva de calibração com base em padrões de calibração preparadas no ponto 1.3.1. </li><li> Usando um de 96 poços leitor de placas ultravioleta / visível, defina o comprimento de onda medido a 340 nm e registre a absorção. Esta medição controla a redução do NAD + a NADH, que é proporcional à concentração de xilose. A concentração de xilose é calculada a partir da curva de calibração com base em padrões de calibração preparadas no ponto 1.3.1. </li></ol></li></ol> 2. alta taxa de transferência de Determinação de lignina total e lignina Monomérico Conteúdo Usando pyMBMS 28 <ol><li> Preparação de amostra <ol><li> Moer e extrai-se a biomassa utilizando os métodos descritos nos passos 1.1.1, e 1.1.6-1.1.8. Isso inclui moagem e extração de um conjunto de normas de usar controles como experimentais. Nota: O MEASUR pyMBMSements são não-dependente do tamanho da partícula, de modo que apenas utilizando o protocolo pyMBMS, a preparação de biomassa devem ser realizados para permitir que a amostra se encaixar no suporte da amostra, &lt;4 mm. </li><li> Utilizando uma pequena espátula de distribuição a cerca de 4 mg de (3 a 5 mg de preferência) da biomassa preparada num copo de aço inoxidável de 80 ul concebido para o amostrador automático. </li><li> Certifique-se de que pelo menos 10% das amostras sendo analisadas são normas de controlo, tais como os disponíveis do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (bagaço de cana-8491; choupo-8492; pinho-8493; ou palha de trigo-8494). O padrão pode também ser quaisquer espécies análogas para as amostras a serem analisadas, que já foram caracterizados utilizando métodos convencionais. </li><li> Aleatoriamente carregar as amostras para os copos auto-amostrador usando uma pinça para evitar viés devido a uma possível deriva espectrômetro ao longo do tempo. Nota: Uma aleatorização típica das amostras que incluem a medição de todas as amostras de uma vez, seguido por uma re-randomizaçãoda ordem das amostras para uma medição duplicado. Programas de randomização estão disponíveis online. </li><li> Usando um furador padrão, produzir manualmente discos de filtro de vidro a partir de folhas de fibra de vidro A / D tipo, sem aglutinante. Segure o filtro de fibra de vidro redondo com uma pinça, centralizá-lo sobre o copo de amostra, e empurrar para a amostra usando uma chave Allen de 3,5 milímetros para confinar o material em cada copo durante o experimento. </li></ol></li><li> Protocolo Instrumental <ol><li> Calibra-se o espectrómetro de massa usando um padrão conhecido que tem as intensidades dos picos mais de toda a gama de compostos que podem existir para as amostras experimentais. Para amostras de biomassa típicos, usar perfluorotributilamina (PFTBA). </li><li> Definir a taxa de fluxo de gás de transporte de hélio para 0,9 L / min, utilizando um medidor de fluxo de gás. </li><li> Definir o forno de auto-amostrador a uma temperatura de pirólise de 500 ° C e a temperatura de interface a 350 ° C, utilizando o software de auto-amostrador. Nota: A &quot;de aço inoxidável 1/8 aquecidaA linha de transferência de calor envolvido na fita que liga o amostrador automático para o espectrómetro de massa é controlada usando um controlador térmico a 250 ° C. </li><li> Comece a aquisição de dados sobre a espectrômetro de massa e aguarde pelo menos 60 segundos para obter dados suficientes para a recolha de espectros de fundo. </li><li> Comece o método de auto-amostrador automático com as especificações de 2.2.2. Nota: O amostrador automático gotas cada amostra individual para dentro do forno de auto-amostrador. O tempo total de aquisição de dados é de aproximadamente 1,5 min; No entanto, a pirólise de um típico 4 mg de amostra é completa após 30 seg. </li><li> Conteúdo recorde total de iões (TIC) de cada amostra utilizando software espectrômetro de massa em 0,5 seg velocidade de varredura. Intensidades recorde entre m / z 30-450. Nota: compostos de biomassa típicas utilizam ionização suave em 17 eV. O instrumento pode gravar intervalos maiores a partir de m / z de 1 a 1000; no entanto, a taxa de varredura será limitado pela potência da CPU do computador. </li><li> Remover fundo a partir dos espectros usando o manual aprimorar recurso do software. Nota: Uma porção de 60 varrimento de linha de base no início da recolha de dados é usada para calcular um valor médio de fundo. Este espectros média de fundo é removido a partir dos espectros da amostra experimental automaticamente no software espectrómetro de massa. </li><li> Importar o ficheiro de texto coluna único criado pelo software espectrómetro de massa que contém os dados espectrais para cada amostra, em um programa de base de dados e combinar todas as amostras numa base de dados. Adicionar quaisquer metadados aplicável à planilha. Importe os dados formatados (planilha de arquivos / CSV) em um pacote de software estatístico e significa normalizar o espectro para explicar a variação nas massas de amostra pyrolyzed. </li><li> Usar um pacote de software estatístico para realizar uma análise de componentes principais (PCA), usando os dados espectrais para analisar agrupamento das amostras padrão replicados utilizados nas medições, bem como para avaliar os picos que são integrais com a classificação de químicacompostos nas cargas plotar 28. Nota: grupos PCA as amostras com base na similaridade de seus espectros, e permite uma verificação das normas para medir erro experimental devido à deriva instrumento durante a corrida. </li><li> Para calcular a lenhina siringil (S) / guaiacilo (L) índice, soma das áreas dos picos S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, e 210) e dividir pela soma de G picos em 124, 137, 138, 150, 164, e 178. </li><li> Para calcular o teor de lignina total, soma dos picos de lignina com m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, e 210. </li><li> Calcular um fator de correção para escalar a medição pyMBMS com um método padrão para a estimativa total de lignina, como Klason lignina. Divida o valor lignina Klason da norma individual pelo teor de lignina total medido para essa amostra padrão usando pyMBMS. </li><li> Aplicar esse fator de correção para todos os-espécies, como no conjunto de dados. Repita o procedimento para cada tipo de biomassa analisada. Nota: O factor de correcção pode variar significativamente com base no S / L de biomassa analisados. </li></ol></li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22U.S.+Billion-Ton+Update%3A+Biomass+Supply+for+a+Bioenergy+and+Bioproducts+Industry%22">U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry</a>. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).</li>
<li>Henry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+5%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Resources+for+Food%2C+Fuel+and+Conservation%22%5BJournal%5D)">Ch. 5.</a> Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , Earthscan. 53-80 (2009).</li>
<li>Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+plant+biomass+resources+available+for+replacement+of+fossil+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil.</a> Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).</li>
<li>Furtado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+plants+for+biofuel+and+biomaterial+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Modifying plants for biofuel and biomaterial production.</a> Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).</li>
<li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).</li>
<li>Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Lignocellulosic+Biomass+Using+Analytical+Spectroscopy%3A+an+Evolution+to+High-Throughput+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenerg.+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques.</a> Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).</li>
<li>Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacidolysis+of+lignin%3A+comparison+with+acidolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Wood+Chem.+Technol%22%5BJournal%5D)">Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis.</a> J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).</li>
<li>DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+and+automatable+high-throughput+compositional+analysis+of+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).</li>
<li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+determination+of+glucan+and+xylan+fractions+in+lignocelluloses%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses.</a> Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).</li>
<li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignocellulose+recalcitrance+screening+by+integrated+high-throughput+hydrothermal+pretreatment+and+enzymatic+saccharification%5BTitle%5D)+AND+%22Ind.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification.</a> Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).</li>
<li>Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+high-throughput+screening+system+to+identify+cellulosic+biomass%2C+pretreatments%2C+and+enzyme+formulations+that+enhance+sugar+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).</li>
<li>Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+sugar+content+in+biomass+hydrolysates+using+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).</li>
<li>Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+corn+stover+composition+and+sources+of+variability+via+NIRS%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose+%28Dordrecht%2C+Netherlands%29%22%5BJournal%5D)">Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).</li>
<li>Tucker, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fourier+transform+infrared+quantification+of+sugars+in+pretreated+biomass+liquors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).</li>
<li>Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+multivariate+calibration+models+for+corn+stover+feedstock+and+dilute-acid+pretreated+corn+stover%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose+%28Dordrecht%2C+Netherlands%29%22%5BJournal%5D)">Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).</li>
<li>Ona, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-destructive+determination+of+wood+constituents+by+Fourier-transform+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Wood+Chem.+Technol%22%5BJournal%5D)">Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy.</a> J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).</li>
<li>Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+quantitative+method+to+assess+eucalyptus+wood+properties+for+kraft+pulp+production+by+FT-Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pulp+Pap.+Sci%22%5BJournal%5D)">A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy.</a> J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).</li>
<li>Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+biomass+analysis.+New+tools+for+compositional+analysis+of+corn+stover+feedstocks+and+process+intermediates+from+ethanol+production%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).</li>
<li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).</li>
<li>Chen, M., Zhao, J., Xia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+different+chemical+pretreatments+of+corn+stover+for+enhancing+enzymatic+digestibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Bioenergy%22%5BJournal%5D)">Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility.</a> Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).</li>
<li>Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+S%2FG+ratio+and+lignin+content+in+a+Populus.+family+influences+the+release+of+xylose+by+dilute+acid+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).</li>
<li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+prediction+of+eucalypt+lignin+syringyl%2Fguaiacyl+content+using+multivariate+analysis%3A+a+comparison+between+mid-infrared%2C+near-infrared%2C+and+Raman+spectroscopies+for+model+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 93(2014).</li>
<li>Lupoi, J. S., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+woody+and+herbaceous+biomasses+lignin+composition+with+1064+nm+dispersive+multichannel+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Spectro%22%5BJournal%5D)">Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy.</a> Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+syringyl%3Aguaiacyl+ratios+using+FT-Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).</li>
<li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+prediction+of+Acacia+and+eucalypt+lignin+syringyl%2Fguaiacyl+content+using+FT-Raman+spectroscopy+and+partial+least+squares+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenerg.+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling.</a> Bioenerg. Res. in press, (2015).</li>
<li>Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Within+tree+variability+of+lignin+composition+in+Populus%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Within tree variability of lignin composition in Populus.</a> Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).</li>
<li>Sykes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+12.+High-Throughput+Screening+of+Plant+Cell-Wall+Composition+Using+Pyrolysis+Molecular+Beam+Mass+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biofuels%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy.</a> Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).</li>
<li>Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDecker%2C+S+%22Biomass+Conversion%22">Biomass Conversion</a>. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).</li>
<li>Evans, R. J., Milne, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+pyrolysis+of+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Fuels%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the pyrolysis of biomass.</a> Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As principais etapas de preparação de amostras para a obtenção de dados precisos e reprodutíveis quando conduzindo experimentos de rastreio de alto rendimento são as seguintes: Ensaio de Libertação de açúcar: Em geral, as amostras são preparadas em lotes que vão desde algumas dezenas a milhares de cada vez. Cada passo importante é tipicamente levada a cabo em todas as amostras antes de se mudar para a frente, a fim de minimizar as variações na preparação entre am...

Como a oferta global de combustíveis não renováveis ​​e os seus associados produtos declínios, os cientistas foram desafiados a criar combustíveis e produtos químicos similares a partir de fontes de origem vegetal 1. Um aspecto importante deste trabalho é determinar que espécies de plantas podem ser adequados para a produção de biocombustíveis e biomateriais 2,3. Tipicamente, estas matérias-primas são avaliadas para a lenhina, celulose, hemicelulose e conteúdo; bem como a sua susceptibilidade à desconstrução (recalcitrante) através de pré-tratamento térmico, mecânico e / ou químico, com ou sem subsequente sacarificação enzimática. Análises mais detalhadas são utilizados para determinar a composição específica das fracções de lignina e hemicelulose, bem como actividades enzimáticas óptimas necessário. Modificações transgênicas de plantas que não intrinsecamente possuem características ideais para a conversão bioquímica ou termoquímica a commodities desejados forneceram os investigadores com uma fonte de grande expansão de maconhacial matérias-primas 4. Os métodos analíticos padrão para quantificar as características químicas de uma planta, ao mesmo tempo bastante útil para pequenos conjuntos de amostras, não são adequadas para a pesquisa rápida de centenas ou milhares de amostras 5-7. Os métodos aqui descritos HTP foram desenvolvidas para avaliar rapidamente e com eficiência um grande número de variantes de biomassa para alterações na parede celular recalcitrante à degradação termoquímico e / ou enzimático. É fundamental compreender que os testes de rastreio HTP aqui descritos não foram concebidos para maximizar a conversão ou o rendimento. O objetivo é determinar as diferenças relativas na recalcitrância intrínseca de amostras de biomassa. Como resultado, muitas das etapas de análise são diferentes dos &quot;típicos&quot; ensaios de conversão da biomassa, onde o objetivo é obter a taxa de conversão máxima ou extensão. Por exemplo, inferiores gravidades de pré-tratamento e tempos mais curtos de hidrólise enzimática são usadas para maximizar diferemcias entre as amostras. Na maioria dos casos, cargas relativamente elevadas de enzimas são usados ​​para reduzir as diferenças devidas à variação experimental da actividade da enzima, o que poderia distorcer os resultados significativamente. Técnicas rápidas para determinar a composição de plantas de células-paredes e os açúcares monoméricos libertado seguinte sacarificação enzimática incluem robótica, personalizado, placas de 96 poços termoquimicamente compatíveis, e modificações de métodos laboratoriais padrão 8-11 e protocolos instrumentais, como a espectroscopia vibracional (infravermelho (IV), no infravermelho próximo (NIR), ou de Raman) e de ressonância magnética nuclear (RMN) 12-17. Estas metodologias são a chave para o isolamento de matérias-primas com alta de celulose ou de baixo teor de lignina, ou aqueles esperado para produzir a mais elevada de glicose, xilose, etanol, etc. Estes métodos permitiram análises downscaled que empregam menores quantidades de biomassa e produtos de consumo, levando a reduções nos experimental custa 18 </sup&gt;. Outra característica desta abordagem metodológica é que várias condições experimentais pode ser rapidamente e, em alguns casos, ao mesmo tempo, avaliada. Por exemplo, uma variedade de diferentes estratégias de pré-tratamento ou cocktails enzima pode ser testado, permitindo que os parâmetros experimentais mais ideais para ser rapidamente identificados e empregues. Matérias-primas populares, como palha de milho 9, álamo 8,10, bagaço de cana 8, e switchgrass 8 foram avaliadas com sucesso usando esses métodos HTP. Lignina total e composição monomérica lignina também são comumente quantificada traços de biomassa. As reduções no teor de lenhina foram mostrados para aumentar a digestibilidade enzimática de polissacarídeos 19,20. O papel que a razão monomérica lignina (muitas vezes relatadas como siringil / guaiacil (S / G)) desempenha na desconstrução da parede celular da planta ainda está sob investigação. Alguns relatórios indicaram que as reduções no S / Grácio levou a rendimentos aumentados de glicose após hidrólise 21, enquanto outros estudos revelam a tendência oposta 19,22. Métodos de alto rendimento para avaliar a lignina e seus monômeros incluem espectroscopia vibracional (IR, NIR e Raman 23-26) juntamente com a análise multivariada, pirólise e espectrometria de massa de feixe molecular (pyMBMS) 27,28. Ao desenvolver métodos HTP para o rastreio de biomassa, várias considerações integrais precisam ser mantidos em mente. Um aspecto chave é a complexidade do método. Qual é o nível de habilidade necessária para a técnica? Análises quimiométricas, por exemplo, exigem habilidades específicas para a construção, avaliação e manutenção de modelos preditivos. Os métodos padrão de análise exibem passos preparatórios ou dados indesejáveis ​​ou empregar reagentes tóxicos. Desenvolvimento dos modelos é um processo contínuo em que os novos dados são incorporados no modelo ao longo do tempo para aumentar a robustez do modelo. Outra consideperação é a redução de custos e diminuição do tempo de análise dos métodos experimentais de alto rendimento propostas. Se o método é bastante rápida, mas muito dispendioso, não pode ser uma técnica viável para muitos laboratórios a adoptar. Os métodos ilustrados neste manuscrito são variantes técnicas padronizadas, modificados para amplificar as capacidades de rendimento. Estes protocolos medir quantitativamente os traços de biomassa de interesse sem que seja necessário o desenvolvimento de modelos preditivos. Este é um atributo-chave destas técnicas, uma vez que os métodos preditivos, enquanto exibem fortes correlações com o padrão análises utilizados para desenvolver os modelos, não são tão precisos como realmente medir a quantidade de interesse para as amostras. Considerando que os métodos utilizados são essencialmente reduzida versões de métodos analíticos em escala de bancada padrão, exatidão e precisão são negociadas para a velocidade e taxa de transferência. Na maior parte, este resultado é devido a erros maiores na pequena pipetagem volume e pesagem; bem como o aumento sampla heterogeneidade como tamanho da amostra é reduzida. Enquanto as grandes conjuntos de amostras podem ser rastreados e comparados, muito cuidado deve ser exercitado ao fazer comparações entre campanhas separadas e aos resultados em escala de bancada. Os passos mais demoradas envolvem a manipulação física da biomassa. Amostras de moagem pode levar vários minutos por amostra, incluindo a limpeza do moinho entre as amostras. Carregando manualmente, a descarga, e moegas de limpeza e enchimento e esvaziamento sacos de chá e sacos de amostras também é muito trabalhoso. Embora cada etapa pode demorar um minuto ou mais, fazendo milhares de amostras pode demorar várias horas ou mesmo dias. Os robots podem carregar um reactor típico placa com biomassa em cerca de 3 a 4 horas ou 6 a 8 placas dia -1 -1 robô. Esta situação depende dos parâmetros de precisão utilizados, bem como do tipo e quantidade de biomassa a ser testado. Placas de enchimento do reactor com água, ácido diluído, ou enzima é feito rapidamente, utilizando um manuseamento robô líquido. Pretratamento de uma pilha de placas (de 1 a 20 placas de reactores) leva entre 1 e 3 horas, quando a montagem, esfriar e desmontagem está incluído. Hidrólise enzima leva 3 dias e a análise de açúcar requer cerca de 1 hora de tempo de preparação, mais 10 min por placa reactor para completar o ensaio e ler os resultados. A programação semanal de Set de pré-tratamento e de análise dias acomoda um horário de trabalho razoável, minimizando estranho horas e fins de semana os esforços para o componente humano do ensaio e permite o processamento de ~ 800 a 1.000 amostras por semana em uma base contínua. A taxa de transferência máxima depende de vários fatores, principalmente quanto hardware (robôs, reatores placas, etc.) e quanto &quot;software&quot; (ou seja, recursos humanos) estão disponíveis para fazer o trabalho manual. O limite prático superior é 2.500 a 3.000 amostras / semana; no entanto, que a produção exige operação de sete dias por semana e vários estagiários e técnicos dos estudantes. Em comparação, 3.000 amostras por HPLC exigiria cerca de 125 dias de samanálise ple mais o trabalho adicional de pesagem manualmente amostras em reatores e amostras de filtragem antes da análise.

<table><tbody><tr><td>Estação de Trabalho Automatizada Biomek FX</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Manipulador Automatizado de Líquidos</td></tr><tr><td>Moinho Wiley</td><td>Thomas Scientific</td><td>3375E15 (Modelo 4) ou 3383L20 (Mini-moinho)</td><td></td></tr><tr><td>sacos antiestáticos</td><td>Minigrip*</td><td>MGST4P02503</td><td>2,5x3", vários fornecedores disponíveis</td></tr><tr><td>fio de cobre revestido de estanho</td><td>McMaster-Carr</td><td>8871K84</td><td>0,016" de diâmetro, saquinhos de chá de arame dobrado e elástico</td></tr><tr><td></td><td>Herbco</td><td>press n' brew saquinhos de chá</td><td>3,5x5 polegadas</td></tr><tr><td>gluco-amilase</td><td>Combustível Spirizyme da Novozymes</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>alfa-amilase</td><td>Novozymes</td><td>Liquozyme SC DS</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sódio trihidratado</td><td>qualquer fornecedor</td><td></td> químico <td>grau de reagente</td></tr><tr><td>ácido acético</td><td>qualquer fornecedor</td><td></td> de produtos químicos <td>grau de reagente</td></tr><tr><td>190 prova (95%) etanol</td><td>qualquer fornecedor</td><td></td> de produtos químicos funis <td>de grau de reagente</td></tr><tr><td></td><td>Freeslate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96- poço C-276 Hastelloy placas</td><td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td> <td>N / A (personalizado)</td><td></td></tr> <tr><td>Ponta de ferro de solda de 1/8 "</td><td>Fita</td> de Teflon com adesivo de silicone Sears <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>5180</td> Solução enzimática de <td>3" de largura (rolos de 36 jardas)</td></tr> <tr><td></td><td>Novozymes</td><td></td><td>Cellic CTec2</td></tr><tr><td>ácido cítrico monohidratado</td><td>qualquer fornecedor</td><td></td> químico<td></td></tr><tr><td>citrato trissódico di-hidratado</td><td>qualquer fornecedor</td><td></td><td></td>químico</tr><tr><td>descartável, placas de poliestireno de 96 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>ou equivalente; vários fornecedores disponíveis</td></tr><tr><td>glicose oxidase/peroxidase&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Megazyme D-kit de ensaio de glicose</td></tr><tr><td>xilose desidrogenase</td><td>Megazyme</td><td>K-xilose</td><td>Megazyme Kit de ensaio de D-xilose</td></tr><tr><td>solução padrão de glicose</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Megazyme Kit de ensaio de D-glicose</td></tr><tr><td>solução padrão de xilose</td><td>Megazyme</td><td>K-xilose</td><td>Megazyme Kit de ensaio de D-xilose</td></tr><tr><td>copos de amostra de aço inoxidável</td><td>Frontier Laboratories</td> Folhas de fibra de vidro <td>PY1-EC80F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pall</td><td>66227</td><td>folhas de 8x10 "; círculos perfurados com furador padrão</td></tr><tr><td>Matéria-prima de biomassa inteira de bagaço de cana-de-açúcar</td><td>NIST</td><td>8491</td><td></td></tr><tr><td>Eastern Cottonwood (choupo) Matéria-prima de biomassa inteira</td><td>NIST</td><td>8492</td><td></td></tr><tr><td>Matéria-prima de biomassa inteira de pinheiro Monterey</td><td>NIST</td><td>8493</td><td></td></tr><tr><td>Trigo Matéria-prima de biomassa inteira</td><td>de palha NIST</td><td>8494</td><td></td></tr></tbody></table>

rastreio de alto rendimento de variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: total lignina, a lignina monómeros, e enzimática sugar lançamento

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

A conversão de biomassa lignocelulósica em combustíveis, produtos químicos e outras commodities tem sido explorada como um caminho possível para reduções no uso de fontes de energia não renováveis. Para identificar quais plantas, de um pool diversificado, têm as características químicas desejadas para aplicações a jusante, atributos, como teor de celulose e lignina ou liberação de açúcar monomérico após uma sacarificação enzimática, devem ser comparados. Os protocolos experimentais e de análise de dados dos métodos padrão de análise podem ser demorados, limitando assim o número de amostras que podem ser medidas. Os métodos de alto rendimento (HTP) aliviam as deficiências dos métodos padrão e permitem a triagem rápida das amostras disponíveis para isolar aquelas que possuem as características desejadas. Este estudo ilustra a liberação de açúcar HTP e os pipelines de espectrometria de massa de feixe molecular de pirólise empregados no Laboratório Nacional de Energia Renovável. Esses dutos permitiram a avaliação eficiente de milhares de plantas, diminuindo o tempo e os custos experimentais por meio de reduções de mão de obra e consumíveis.

O efeito combinado do pré-tratamento termoquímico e subsequente sacarificação enzimática é medida como uma função da massa de glicose e xilose libertada no final do ensaio. Os resultados são relatados em termos de miligramas de glicose e xilose libertada por grama de biomassa. Isto está em contraste gritante com dados reportados a partir de ensaios em escala de bancada, que normalmente é avaliado como por cento de rendimento teórico com base em análise da composição do material de partida. Como ele ainda não é prático p...

A estrutura da parede celular vegetal e as características químicas são avaliadas para identificar matérias-primas ideais para biocombustíveis e biomateriais. Os métodos padrão têm limitações quando aplicados a grandes conjuntos de dados. Esses métodos de pré-tratamento de alto rendimento, sacarificação enzimática e espectrometria de massa de feixe molecular de pirólise comparam um grande número de amostras de biomassa com tempo e custo experimentais reduzidos.

Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

O objetivo geral deste procedimento é medir os recalcitrantes da pré-tratamento termoquímico e da hidrólise enzimática entre variantes relacionadas de biomassa. Isso é realizado primeiramente preparando as amostras de biomassa para teste quanto ao tamanho, redução e extração de amido e açúcares solúveis. O segundo passo é dispensar a biomassa com alta precisão em placas de reatores de alto rendimento compatíveis termoquimicamente.As amostras são pré-tratadas em um reator a vapor. Em seguida, as amostras são digeridas com uma celulase comercial padrão durante três dias para hidrolisar a celulose e a hemicelulose. O passo final é a determinação da glicose e da xilose liberadas durante a hidrólise enzimática utilizando os ensaios GO pod e XDH.Por fim, a quantificação de glicose e xilose em alto rendimento é utilizada para determinar a liberação relativa de açúcares entre amostras com base em gramas de açúcar por grama de biomassa inicial. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos em escala laboratorial, como pré-tratamento e hidrólise enzimática em escala laboratorial, é que esta técnica pode ser realizada simultaneamente em centenas ou mesmo milhares de amostras. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de conversão de biomassa, como quais cultivares ou variantes são mais suscetíveis à conversão em açúcares e produtos subsequentes.Assim, as implicações dessa técnica podem ser estendidas para a compreensão da estrutura e função da parede celular, pois as mutações que geramos na via biossintética da parede celular podem ser analisadas quanto a alterações químicas estruturais. Este método pode fornecer informações sobre os componentes recalcitrantes da parede celular vegetal. Também pode ser aplicado a outros componentes da conversão da biomassa, como estudos de atividade enzimática e sinergia.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois ele envolve grandes conjuntos de amostras de variantes de biomassa que devem ser manipulados de forma idêntica e simultânea na escala de miligrama. Assim, exige robótica e equipamentos especializados. Para iniciar o procedimento com aproximadamente 250 miligramas de biomassa previamente moída de um saco antiestático com código de barras para um saquinho numerado, enrole cuidadosamente o saquinho, certificando-se de dobrar as extremidades sobre a biomassa para evitar perda durante o desamidamento e extração. Em seguida, feche cada saquinho usando fio de cobre revestido com estanho e registre o número do saquinho para cada amostra com código de barras.Adicione 500 mililitros de uma solução enzimática previamente preparada sem amido a um recipiente plástico. Em seguida, adicione 120 saquinhos de chá à solução enzimática tamponada para um protocolo de processamento em lotes. Após a incubação em agitador, enxágue e mergulhe a biomassa em vários litros de água desionizada por 30 minutos, após enxágue exaustivo da biomassa desamidada.Para remover os sais do tampão, coloque os sachês em uma coluna de soquete lit para extração. Monte o refluxo com soquete lit usando etanol 95% e extraia as amostras por 24 horas. Após a conclusão da extração, desenrole os sachês e devolva a biomassa seca ao tubo original com código de barras.Sacos antielectrostáticos Transfira pelo menos 50 miligramas da biomassa seca para um funil com código de barras. Escaneie os códigos de barras dos sacos antieletrostáticos e do funil receptor para garantir o rastreamento preciso das amostras. Após carregar os funis em um robô de pesagem sólida, pese roboticamente cinco miligramas das amostras secas em aço inoxidável resistente a ácidos.Placas de 96 poços pesam três réplicas de cada amostra distribuídas ao redor da placa para minimizar variações localizadas. Em seguida, adicione 250 microlitros de água desionizada a cada poço e feche as placas com fita de politetrafluoroetileno ou PTFE com revestimento adesivo de silicone. Usando uma ponta de ferro de solda de um oitavo de polegada, perfure a fita de PTFE em cada orifício de vapor.Para cada placa, prenda firmemente as placas com juntas de PTFE reforçado com vidro de 0,031 polegada de espessura entre as placas, utilizando placas vazias na parte superior e inferior da pilha. Pré-trate as amostras usando um reator a vapor ajustado a 180 graus Celsius por 17,5 minutos. Ao finalizar, resfrie as placas do reator até 50 graus Celsius inundando-as com água desionizada.Quando as placas estiverem frias, centrifugue-as em um rotor de balde oscilante a 1700 ×g por 20 minutos. Em seguida, remova o filme superior.Adicione 40 microlitros da solução estoque de enzima a 8% previamente preparada a cada poço após o refechamento com nova fita de PTFE. Coloque a placa selada em um grampo magnético para placa. Misture suavemente as amostras por inversão, pelo menos 15 vezes, e incube a 50 graus Celsius por 70 horas. Após a incubação, as placas reatoras são misturadas e centrifugadas.Em seguida, o robô de manipulação líquida é utilizado para realizar a quantificação de glicose e xilose por meio de ensaios colorimétricos ligados a enzimas, desidrogenase de xilose, ou XDH para xilose, e glicose oxidase, peroxidase, ou GO-POD para glicose. A plataforma é montada com reservatórios dos reagentes GO-POD e XDH, bem como água para diluição e suportes de ponteiras de 200 microlitros com 96 canais para cada reagente. Essas ponteiras são reutilizadas em múltiplas placas de reator.O deck também contém ponteiras descartáveis de 200 microlitros para remoção de água e adição do padrão de açúcar, bem como padrões de açúcar pré-prontos. Em frascos HPLC do carrossel de armazenamento, o robô traz três placas de microtitulação transparentes, uma para a realização da diluição da mistura de hidrólise e uma para cada ensaio XDH e GoPod. O manipulador move as quatro placas para posições no deck.As ponteiras descartáveis de 96 canais e 100 microlitros são trazidas para o deck a partir do carrossel para uso na transferência do reator para a placa de diluição e da diluição para as placas XDH e go pod. Utilizando o pipetador de oito canais com amplitude variável, a água adicionada antes do pré-tratamento é removida das três poças em cada canto da placa de reator para evitar contaminação cruzada com a placa de diluição. Como essas 12 poças são usadas para os padrões de açúcar, utiliza-se a cabeça de pipetagem de 96 canais.Com as três ponteiras em cada canto removidas, adiciona-se 180 microlitros de água aos poços da placa de diluição. Após trocar as ponteiras, os reagentes XD, H e go pod são transferidos de seus respectivos reservatórios para suas respectivas placas de ensaio, utilizando a cabeça de pipetagem de 96 canais.Enquanto isso ocorre, os padrões de açúcar são adicionados às três cavidades de cada canto da placa de diluição. Usando a cabeça de pipetagem de oito canais, após trocar para as ponteiras menores, a cabeça de pipetagem de 96 canais é utilizada para transferir 20 microlitros do sobrenadante de hidrólise para a placa de diluição, e a placa é misturada por tri. A amostra deve ser aspirada próximo ao topo do líquido para limitar a contaminação das ponteiras por partículas de biomassa.Após a mistura, 20 microlitros são transferidos sequencialmente. Utilizando a cabeça de pipetagem de 96 canais, transfere-se para as placas XDH e go pod. Após cada mistura por agitação, as ponteiras, o reator de amostras e as placas de diluição são devolvidos a uma grade de descarte no carrossel; as placas XDH e go pod são removidas para uma grade de carrossel separada e deixadas em repouso por uma hora antes da leitura no espectrofotômetro, utilizando um leitor de placas de 96 poços com ultravioleta visível.Defina o comprimento de onda medido em 510 nanômetros e registre a absorbância em relação a um branco de reagente. Em seguida, ajuste o comprimento de onda medido no leitor de placas para 340 nanômetros e registre a absorbância utilizando uma espátula pequena. Dispense aproximadamente quatro miligramas da biomassa preparada em um copo de aço inoxidável de 80 microlitros projetado para o amostrador automático do espectrômetro de massas.Usando um furador padrão, produza manualmente discos de filtro de vidro a partir de folhas de fibra de vidro do tipo ad e carregue as amostras nas grades do amostrador automático com pinça, carregando aleatoriamente as amostras nos copos para evitar viés devido à deriva do espectrômetro ao longo do tempo. Após realizar a calibração e inserir os parâmetros apropriados no espectrômetro de massas, inicie a aquisição de dados e aguarde pelo menos 60 segundos para obter dados suficientes para a coleta de espectros de fundo. Por fim, inicie o método do amostrador automático usando uma taxa de fluxo de gás carrier de hélio de 0,9 litro por minuto.Um exemplo de tendências é um levantamento de recalcitrância de 755 variantes naturais de álamo coletadas no noroeste do Pacífico. Os resultados indicam que, à medida que a proporção entre siringil e guaiacil aumenta, a recalcitrância diminui até uma razão de aproximadamente dois, quando a melhoria da recalcitrância se estabiliza. Podem-se observar aqui pontos fora da curva onde o gene PT4CL1 foi subregulado.No álamo, vários dos cem cultivares analisados apresentam claramente um aumento nos recalcitrantes, conforme evidenciado pela liberação reduzida de açúcares. Diferentes variedades de palha de trigo cultivadas em diversos locais e colhidas após variações nas condições de crescimento resultaram em 20 populações distintas com base nas combinações das variáveis acima. Esses conjuntos de amostras são facilmente diferenciados e indicam variáveis positivas e negativas.Para a pirólise de materiais resistentes, a espectrometria de massas com feixe molecular pode ser usada para avaliar alterações na composição da parede celular. Fragmentos espectrais de massas são atribuídos a diferentes monômeros de lignina. Ao comparar uma amostra com alto teor de lignina versus alto teor de carboidrato, as diferenças nos dados espectrais são evidentes.O uso de dados de espectrometria de massas, associado a uma análise de componentes principais, é ilustrado aqui. O gráfico de cargas dos componentes principais pode auxiliar na identificação das características químicas que estão sendo explicadas no gráfico de classificação de escores, bem como na elucidação das características que mudam entre os agrupamentos de amostras. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para analisar milhares de amostras por semana, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ser o mais consistente possível e comparar apenas amostras dentro de um conjunto relacionado.Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que outros pesquisadores trabalhassem em métodos de triagem de alto rendimento e outras áreas relacionadas à recalcitrância da parede celular vegetal, utilizando substâncias como líquidos iônicos e pré-tratamento alcalino. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar, manipular e analisar adequadamente grandes conjuntos de amostras de biomassa em escala microscópica para identificar diferenças na recalcitrância, por meio da redução de tamanho e extração, pré-tratamento termoquímico e hidrólise enzimática. Lembre-se de que trabalhar com alta pressão, vapor e equipamentos automatizados é extremamente perigoso e que todas as precauções de segurança devem ser tomadas, como o uso de equipamentos de proteção individual, além de ter travas de segurança em todos os equipamentos durante a realização desses procedimentos.

high-throughput-screening-recalcitrance-variations-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição da lignina polifenólicos.

Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte I: A lignina

Um método baseado em microscopia confocal Raman é apresentado que proporciona rótulo sem visualização de lignina na parede celular das plantas e comparação de lignificação em diferentes tecidos, amostras ou espécies.

Label-free In situ Imaging de lignificação na parede celular das plantas

Este protocolo descreve um ecrã de alta taxa de transferência para a atividade celulolítica de uma biblioteca metagenomic expressa em Escherichia coli. A tela é solução baseada e altamente automatizado, e usa um pot-química em 384 microplacas bem com a leitura final como uma medida de absorbância.

A tela de elevada capacidade para Biomining Atividade da celulase de Bibliotecas metagenomic

Nós descrevemos um baixo custo, o método de alto rendimento para a tela para a atividade endoglucanase fúngicas...

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Um método simples e rápido para determinar o potencial de sacarificação de um grande número de amostras de biomassa vegetal é descrito. A plataforma automatizada para esta análise envolve a preparação da biomassa de plantas para análise em 96 placas bem e do desempenho posterior de hidrólise pré-tratamento e quantificação dos açúcares liberados.

Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

A interferência de RNA fita dupla (dsRNAi) técnica é empregada para baixo-regular a coenzima A redutase cinamoil milho gene (ZmCCR1) para diminuir o teor de lignina da planta. A lignina sub-regulação da parede da célula é visualizada por meio de análises microscópicas e quantificada pelo método de Klason. São analisadas as mudanças de composição em hemicelulose e celulose cristalina.

A lignina Down-regulação da<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi e Klason Análise lignina

Evolução e isolamento de técnicas adaptativas são descritos e demonstrados para se obter derivados de Scheffersomyces stipitis estirpe NRRL Y-7124 que é capaz de consumir rapidamente de hexoses e pentoses em açúcares mistos enzima sacarificado hidrolisados undetoxified e a acumular-se sobre 40 g / L de etanol.

Técnicas para a Evolução da levedura Pentose-fermentação robusta para bioconversão de transformação de lignocelulose em etanol

Um ensaio de alto rendimento para triagem enzimática é descrito. Este kit de ensaio multiplexado pronto para uso é composto por substratos Chromogênicos Polymer Hydrogel (CPH) pré-escolhidos e substratos complexos de Chromogênico B iomassa (ICB). As enzimas-alvo são endoenzimas e proteases degradadoras de polissacarídeos.

High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

OrganoCat é um método para o pré-tratamento e fracionamento da lignocelulose em condições leves em lignina, açúcares fermentáveis e polpa de celulose. Em um sistema de solvente biogênico e bifásico de água e 2-metiltetrahidrofuran com ácido 2,5-furancarboxílico como catalisador, os produtos OrganoCat são separados in situ para recuperação direta do produto.

Fracionamento da Biomassa Lignocelulósica utilizando o Processo OrganoCat

O pré-tratamento assistido por solventes eutéticos profundos é um processo verde, rápido e eficiente para fracionamento lignocelúsico e recuperação de lignina de alta pureza.

Extração de Lignina ultrarrápida de resíduos lignocelúsicos incomuns do Mediterrâneo

Esse protocolo apresenta um fluxo padrão de triagem de alta produtividade para microrganismos industriais. Envolve construir uma biblioteca mutante via mutagênese ARTP, realizar triagem positiva de gotículas com microfluídica automatizada e, posteriormente, verificar os resultados. A confiabilidade do fluxo de trabalho foi validada por meio de triagem de cepas de B. coagulans de alto rendimento.

Triagem de alto rendimento de mutantes Bacillus coagulans , hiperprodutora de ácido l-lático, utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas

Aprenda a medir a recalcitrância da biomassa lignocelulósica usando pré-tratamento termoquímico e hidrólise enzimática de alto rendimento. Este método identifica matérias-primas ideais para biocombustíveis.

Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento (Vídeo) | JoVE Journal

Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento

Explorar mais vídeos