Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS
11 de julho de 2016
A espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) e as técnicas moleculares (sequenciamento do gene 16S rRNA) permitem a identificação de patógenos bacterianos raros em diagnósticos de rotina. O objetivo deste protocolo reside na combinação de ambas as técnicas, o que leva a dados mais precisos e confiáveis.
O objetivo geral deste protocolo de espectrometria de massa MALDI-TOF é melhorar a tipagem de patógenos raros por meio de um procedimento rápido e econômico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia diagnóstica, pois permite a rápida edificação de patógenos bacterianos raros. Hoje, queremos falar sobre odoratimimus e bactérias do gênero Myroides.
Demonstrar o método e falar sobre a interpretação dos resultados. Geralmente, indivíduos novos neste método podem achar difícil, pois a transferência de bactérias, a sobreposição com métricas e a interpretação dos resultados exigem habilidades técnicas e conhecimentos microbiológicos. Tivemos a ideia de usar o MALD-TOF MS para rastrear bactérias raras quando tivemos um paciente em nosso hospital sofrendo de uma infecção alimentar diabética causada por myroides odoratimus.
Comece este protocolo com a extração de DNA bacteriano, PCR de DNA ribossômico 16S e sequenciamento de Sanger, conforme descrito no protocolo de texto. Use um palito de madeira para transferir uma única colônia bacteriana para um poço de um alvo de aço de 96 poços. Coloque um microlitro de ácido fórmico a 70% no topo do organismo seco ao ar no alvo de aço e deixe secar por aproximadamente dois a três minutos.
Cubra o local com um microlitro de solução de matriz contendo 50 mg / ml de CHCA em um solvente orgânico composto de 50% de acetonitrila, 2,5 de ácido trifluoroacético e 47,5% de água. Deixe o esfregaço e a matriz sobreposta secarem ao ar por cerca de cinco minutos em um capuz. Para introduzir as amostras, areje a porta de carregamento de amostras do espectrômetro de massa pressionando o botão de entrada/saída do instrumento.
Abra a porta de carregamento e insira a placa alvo MALDI-TOF MS com a matriz de esfregaço bacteriano seco. Feche a porta e evacue novamente. Observe o vácuo e quando atingir 4,5 milhões de milibares inicie a medição.
Abra o software de análise MMIS e clique no menu de arquivo. Selecione Nova classificação"e uma nova janela chamada MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard"deve abrir. Digite o nome do projeto no campo Nome do projeto"e clique Novo, na nova caixa de diálogo chamada Novo Projeto, verifique o nome do projeto e prossiga clicando no botão OK"botão.
No Assistente de classificação em tempo real do MALDI Biotyper, observe a janela de posicionamento do analito. Selecione as posições de destino, clique com o botão direito do mouse em qualquer posição selecionada e selecione Adicionar amostras. Na exibição de tabela aberta automaticamente, digite o nome da amostra, a ID da amostra e, opcionalmente, um comentário.
Clique no botão Avançar"para prosseguir. Em seguida, observe a janela de seleção de métodos MALDI Biotyper. Selecione Bruker Taxonomy"nos MSPs de Taxonomy Trees e clique em Next"para continuar.
Em seguida, observe a janela de resumo do projeto. Verifique as entradas inseridas fornecidas acima para o projeto de classificação real. Inicie a classificação clicando no botão Concluir.
As medições começam automaticamente quando o vácuo apropriado é atingido. Siga a execução da classificação até que a medição seja concluída com êxito. Assim que a medição estiver concluída, abra o menu Visualizar"e clique em Resultados"para visualizar a tabela de resultados no Projeto Um de Classificação em Tempo Real do MALDI Biotyper.
Visualize os resultados da classificação Bruker-Daltonik MALDI Biotyper como um arquivo html no navegador da web padrão. Imprima e salve os resultados. Aqui são mostrados espectros obtidos por MALDI-TOF MS que são medidos e classificados em tempo real.
Aos espectros é atribuído um nome de espécie e um valor de pontuação que reflete a qualidade da medição. Pontuações acima de 2.300 representam uma identificação de espécie altamente provável. Uma pontuação entre 2.000 e 2.300 indica uma identificação segura da espécie.
Uma pontuação abaixo de 1.700 e 2.000 designa uma provável identificação da espécie. E uma pontuação abaixo de 1.700 não é confiável. A identificação de patógenos bacterianos cultivados em uma cultura pura em meio sólido leva de dois a três minutos.
É importante lembrar que patógenos de bactérias raras só podem ser encontrados com MALDI-TOF MS quando os instrumentos contêm de forma confiável os espectros apropriados. Caso contrário, ele deve ser eliminado integrando espectros MaSDA de cepas tipadas de seus isolados caracterizados. No caso em que os resultados da pontuação não levam a uma identificação inequívoca da cepa, outros métodos, como perfil bioquímico ou sequenciamento de rDNA 16S, podem ser aplicados.
Embora esse método possa fornecer informações sobre a detecção bacteriana, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos, como fungos ou anaeróbios. Além disso, a resistência às bactérias pode ser medida. Não se esqueça de trabalhar com uma matriz que é uma substância perigosa, use luvas, óculos de proteção e trabalhe sob um capuz.
Além disso, é absolutamente necessário secar a matriz e esfregar completamente para evitar respingos na câmara de análise.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o uso da espectrometria de massas MALDI-TOF para aprimorar a identificação de patógenos bacterianos raros. Ao integrar este método com técnicas moleculares, os pesquisadores podem obter diagnósticos mais precisos em microbiologia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Técnicas Diagnósticas
- Identificação de Patógenos
Contexto
- A MS de MALDI-TOF é uma ferramenta poderosa para tipagem de patógenos.
- Patógenos bacterianos raros representam desafios nos diagnósticos de rotina.
- Compreender as limitações dos métodos tradicionais é essencial.
- Habilidades técnicas são necessárias para implementação eficaz.
Objetivo do Estudo
- Para melhorar a tipagem de patógenos raros.
- Para fornecer um procedimento diagnóstico rápido e com custo efetivo.
- Para demonstrar o método utilizando exemplos bacterianos específicos.
Métodos Utilizados
- Espectrometria de massas MALDI-TOF para triagem de patógenos.
- Sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S para identificação molecular.
- Procedimentos técnicos para transferência e sobreposição bacteriana.
- Interpretação dos resultados de espectrometria de massas.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de Myroides odoratimimus.
- Diagnóstico rápido demonstrado para patógenos raros.
- Destacou a importância da expertise técnica.
- Forneceram insights sobre a aplicabilidade do método em ambientes clínicos.
Conclusões
- A MS de MALDI-TOF combinada com técnicas moleculares aprimora os diagnósticos.
- A capacitação é essencial para o uso eficaz do método.
- Aplicações futuras podem ampliar o escopo da identificação de patógenos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação precisa de patógenos bacterianos raros é fundamental para a microbiologia diagnóstica em pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico, especialmente para populações de pacientes imunocomprometidos. A integração da espectrometria de massas MALDI-TOF com o sequenciamento do RNA ribossomal 16S permite a identificação rápida e econômica ao nível de espécie, apoiando a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos antimicrobianos. Essa abordagem combinada melhora a confiança preditiva em modelos pré-clínicos, reduzindo resultados falso-negativos na detecção de patógenos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao confirmar a identidade de patógenos raros em modelos de infecção.
- Valor Operacional: Fornece identificação robusta de cepas compatível com a nomenclatura, essencial para a desmistificação reprodutível de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios por meio da caracterização precisa de patógenos em sistemas relevantes para doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantitativas de pontuação (por exemplo, >2.300 para identificação altamente provável) que permitem a confirmação padronizada de hits em telas antimicrobianas.
- Valor Operacional: Facilita a prontidão do ensaio por meio da identificação rápida (<3 min) de culturas puras, melhorando a produtividade e a escalabilidade do processo de triagem.
- Valor de Reprodutibilidade: Garante comparabilidade entre laboratórios por meio da correspondência padronizada de espectros e do uso de bases de dados validadas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica ao validar patógenos raros em modelos de infecção relevantes clinicamente.
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco quando limiares de pontuação (2.000–2.300) confirmam identificação segura da espécie.
- Continuidade Tradutiva: Apoia o alinhamento de biomarcadores quando a presença do patógeno se correlaciona com a resposta do hospedeiro em modelos imunocomprometidos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a avaliação pré-clínica, onde a identificação precisa do patógeno orienta estudos mecanicistas e a avaliação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao confirmar agentes bacterianos raros em modelos de infecção, reduzindo a ambiguidade mecanicista.
- Triagem: Fornece sistemas biológicos validados e prontos para ensaio com saídas quantitativas para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Oferece leituras baseadas em pontuação (por exemplo, classificação MALDI Biotyper) que permitem comparação objetiva de condições e validação de hits.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da validação de patógenos em sistemas relevantes para a doença, somente quando apoiado pelo material de origem.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade diagnóstica reutilizável em diversos projetos de patógenos raros, reduzindo esforços redundantes de validação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução de atribuições falsas de patógenos e desvio de riscos mecanicistas.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da identificação de patógenos entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de prosseguimento ou interrupção em programas antimicrobianos, eficiência de capital por meio de diagnósticos rápidos e redução do risco biológico em fases avançadas.
- Impacto no Portfólio: Priorização baseada em risco de candidatos antimicrobianos utilizando identidades confirmadas de patógenos em modelos pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige conhecimento microbiológico para transferência bacteriana, aplicação da matriz e interpretação dos resultados.
- Depende de instrumentação MALDI-TOF MS com bancos de dados taxonômicos atualizados (por exemplo, Bruker Taxonomy) para correspondência precisa dos espectros.
- Necessita de protocolos padronizados de preparação de amostras para garantir matriz seca e esfregaço, evitando contaminação do analisador.
- Exige alternativa para sequenciamento de rRNA 16S ou perfil bioquímico quando os escores MALDI-TOF forem inferiores a 1.700, indicando identificação não confiável.
- Envolve protocolos de segurança para manipulação de soluções de matriz perigosas (por exemplo, ácido fórmico, acetonitrila) em capela com EPI.
