Name: Subcutânea perfusão de angiotensina II usando osmótica Bombas Induz aneurismas da aorta em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprenda a induzir aneurismas aórticos em camundongos por meio de infusão subcutânea de angiotensina II utilizando bombas osmóticas. Este método permite estudar os mecanismos moleculares da dilatação aórtica.

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O trabalho de pesquisa apresentado neste manuscrito foi apoiado por uma bolsa (HL107319 para Alan Daugherty e HL107326 para Lisa A. Cassis) do National Institutes of Health dos Estados Unidos da América. O conteúdo deste manuscrito é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do National Institutes of Health. A publicação deste manuscrito foi patrocinada pela DURECT Corporation.

Declaração de Ética: estudos de mouse são realizadas com a aprovação da Universidade de Kentucky Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC número de protocolo: 2006-0009). Os ratos são sacrificados no término usando um cocktail de sobredosagem de cetamina (~ 210 mg / kg) e xilazina (~ 30 mg / kg). 1. Cálculo do Valor AngII NOTA: Este protocolo utiliza o exemplo de infusão de AngII (1,000 ng / kg / min) durante 4 semanas em 4 receptor de LDL macho - / - ratos alimentados com uma dieta rica em gordura saturada. <ol><li> Pesar estudar camundongos antes de calcular a quantidade de AngII necessário para perfusão. </li><li> Use o modelo (Tabela 1) para calcular a massa AngII necessário para a experiência. Use a &quot;média de bombeamento Rate&quot; indicado na instrução de bombas como a &quot;taxa de bombeamento&quot; no Passo 4 do modelo. No modelo, ficha Passos 1-5 manualmente, e Passos 6-10 são calculados automaticamente. <ol><li> No modelo, assumir queratinhos ganhará 1 g de peso corporal durante a infusão de AngII 1.000 ng / kg / min, durante 4 semanas. NOTA: Cada rato podem ter muito diferente ganho de peso corporal que vai depender de muitas variáveis, tais como a estirpe de ratinhos e dieta. Nós usam rotineiramente &quot;0&quot; ou &quot;1 g&quot; com base em nossa própria experiência de estudos anteriores. </li><li> Calcular um volume total de 300 ul de solução de AngII para cada rato uma vez que cada bomba exige cerca de 250 ul. </li></ol></li></ol> 2. A dissolução de AngII <ol><li> Loja frascos liofilizados AngII a -20 ° C. Equilibrar frascos angii a RT antes da abertura. </li><li> Pesa-se a massa calculada AngII (7,3 mg como mostrados na Tabela 1) para um tubo de plástico estéril. NOTA: Por Merck Index, não usar tubos de vidro para a dissolução uma vez que uma solução aquosa de AngII tem uma forte afinidade para a ligação de vidro. </li><li> Adicionar o volume calculado de solução salina estéril (1,200 μl) no tubo de plástico contendo o liofilizado AngII, boné, e misture bem por inversão até que a solução é clara. </li><li> Números da etiqueta do rato # 1, # 2, # 3 e # 4 em tubos de plástico estéreis individuais com tampas (0,5 - 1,5 ml). Preparar a solução de AngII sob um capuz laminar para cada ratinho com base no peso corporal como calculado no passo 1.2 e Tabela 1. <ol><li> Por exemplo, pipeta 3,6 salina estéril ul no tubo # 1, em seguida, solução AngII 296,4 ul, e misture bem por pipetagem cima e para baixo com cuidado. </li></ol></li><li> Números da etiqueta do rato nos tubos de plástico com tampas (4 ml; estéreis). Estas serão usadas para incubar bombas como descrito no Passo 3,13. </li></ol> 3. Preenchimento osmótica bomba <ol><li> Obter bombas em duas partes distintas: o corpo principal da bomba e o regulador de fluxo (Figura 1). Cada caixa tem 10 corpos de bombas e reguladores de fluxo que são embalados individualmente. Anote o número do lote. NOTA: Use sempreluvas porque os óleos transferidos de mãos para o invólucro exterior de bombas vai afetar adversamente a função de bombeamento. Use luvas estéreis, tubos, gaze, agulha de enchimento, e pesar barcos para preparar as bombas, para evitar o risco de infecção a partir do implante. </li><li> Abra apenas o número de corpos de bomba e moderadores de fluxo necessários para o estudo, uma vez que estes não podem ser armazenados depois de aberto. Se forem necessários mais de 10 bombas, assegurar que os números de lote de as bombas são as mesmas para um estudo, desde bombas de diferentes números de lote diferente tem volume médio de preenchimento e Bomba Rate. </li><li> Pesar cada bomba (incluindo o corpo principal e fluxo moderador), e anotar o peso para 4 casas decimais (por exemplo, 1,1443 g de rato # 1). Este peso, denominado &quot;Peso da bomba vazio&quot; no modelo (Tabela 1), será utilizada para calcular o rácio preenchido. </li><li> Coloque a agulha de enchimento bomba a um 1 cc seringa estéril e cuidadosamente encher a seringa com a solução de AngII do adequadamentenumerados tubo de plástico. É importante evitar a aspiração de ar para dentro da seringa. </li><li> Retirar as bolhas de ar cuidadosamente a partir da seringa, enquanto a agulha está posicionado para baixo. Manter a agulha / seringa nessa posição para evitar a introdução de bolhas no interior da bomba. </li><li> Insira cuidadosamente a agulha de enchimento no corpo da bomba. Avançar a ponta da agulha para dentro da bomba. Não descansar a ponta da agulha firmemente na parte inferior da bomba. </li><li> Empurre o êmbolo da seringa lentamente a encher a bomba com solução AngII. Uma sombra escura no interior da bomba indica o nível de enchimento. O volume de enchimento é de aproximadamente 246 ul, por instruções. </li><li> Pare de encher a bomba e retire cuidadosamente a agulha assim que uma gota de fluido sobe para fora da bomba. </li><li> Insira regulador de fluxo para a bomba através do orifício na parte superior do corpo da bomba até que não haja lacuna é visto entre a cabeça do regulador de fluxo e parte superior do corpo da bomba (Figura 1). </li><li> Inserção de moderatou no corpo da bomba leva a alguma perda de líquido a partir da abertura do regulador de fluxo. Borre com cuidado todo o fluido extra que pode ter vazado durante a colocação de moderadores. </li><li> Pesar bomba cheia. Grave o peso sob &quot;Bomba Peso Cheio&quot; no modelo. </li><li> Calcular taxa de enchimento (%) = (Peso Bomba &quot;cheio&quot; - &quot;vazio&quot;) x 1000 / significam volume de enchimento x 100. <ol><li> Calcular Rácio de enchimento, tal como indicado na Tabela 1. Idealmente, enchendo proporção deve ser igual ou maior do que 100%. Bomba de reabastecimento se a taxa de enchimento é &lt;95% (implicando que as bolhas de ar podem estar presentes na bomba). </li></ol></li><li> Coloque bomba para encher o tubo rotulado ml 4 (Passo 2.5) com a cabeça voltada para cima moderador. Adicionar um volume suficiente de soro fisiológico estéril para cobrir a bomba. Mantenha bomba no tubo de soro fisiológico até a implantação. </li><li> Colocar os tubos em uma incubadora de 37 ºC. Bombas Incubar S / N (pelo menos 12 horas) para permitir a iniciação parcial, e então implantar em ratinhos. Bombaing de AngII começa cerca de 24 horas após o implante, o que permite que os ratos se recuperar de cirurgia antes de qualquer estresse potencial decorrente durante a infusão de AngII. </li></ol> 4. Preparação para a implantação da bomba <ol><li> Autoclave (modo de gravidade, ciclo de seca, 15 min) gaze, compressas de algodão e instrumentos cirúrgicos, incluindo tesouras, pinça hemostática, fórceps, grampos, grampeador e, pelo menos, um dia antes da cirurgia. </li><li> Em uma sala de procedimento, prepare vaporizador de anestesia usando isoflurano. Abra cortinas estéreis em uma câmara de fluxo laminar, e colocar o nariz cone para anestesia isoflurano. Coloque betadine, etanol 70%, água estéril, talão esterilizador, handrub anti-séptico, compressas, gazes, e bombas cheias em uma capa laminar. </li><li> Don uma máscara e vestido, em seguida, abrir uma cortina exterior em uma capa laminar com as mãos limpas. Calçar luvas estéreis e abrir o pacote dentro estéril. </li></ol> 5. Procedimento cirúrgico da Implantação da bomba <ol><li> Colocar o mouse em uma cham induçãober com influxo de isoflurano a uma taxa de fluxo de 1,5 - 2%. Monitorar o mouse para um adicional de 2 - 3 min depois de decúbito. Raspar uma área do tamanho de um quarto, sobre o ombro esquerdo ou direito. </li><li> Coloque o mouse em uma capa laminar, com seu nariz nivelada com um cone conectado à saída de isoflurano (Figura 2A). Coloque a cabeça do rato em direção a mão dominante do cirurgião. Use veterinário pomada nos olhos de ratos para prevenir o ressecamento enquanto sob anestesia. Certifique-se de que o mouse não tem nenhuma resposta a estímulos de dor antes da cirurgia. Por exemplo, a resposta do pedal é um bom indicador para a dor. </li><li> Cotonete e limpe a área raspada com betadine seguido por três toalhetes com álcool 70%. Don ou alterar luvas estéreis. </li><li> Use um bisturi cirúrgico para fazer uma ~ 1 centímetro incisão atrás da orelha sobre o ombro da perna da frente. Esta incisão deve ser perpendicular à cauda. Tenha cuidado para cortar tecidos somente a pele, e não subjacente. </li><li> Segure forceps em uma mão para abrir incisão, e use a outra mão para fazer um túnel subcutâneo sob a pele usando uma pinça hemostática (Figura 2B). </li><li> Avançar ponta hemostat em direção à cauda, ​​e criar um bolso para bomba. Isto é conseguido através da abertura cuidadosamente as maxilas da pinça hemostática sob a pele a abrir-se uma bolsa. Retirar a pinça hemostática de incisão. </li><li> Inserir bomba dentro da incisão com o moderador cabeça posicionada na parte traseira do rato (Figura 2C). Empurre a bomba completamente no bolso. Deve haver espaço livre suficiente para fechar a ferida sem tensão ou estiramento da pele. </li><li> Uma vez que uma bomba foi inserido, firmemente apertar ambos os lados da incisão, ajeitando para que as bordas se encontram, e colocar 1 ou 2 grampos de sutura para fechar (Figura 2D). Inspeccionar o local de incisão para assegurar que não há fecho completo da ferida, e que a bomba não está a pressionar directamente no local. </li><li> Aplique o creme de lidocaína tópica(4% p / p) com um rato swab.Remove algodão limpo a partir do cone do nariz, e coloque-o sobre uma almofada de aquecimento até que ele recupere a consciência. Após a recuperação, o rato é devolvido à sua gaiola. </li><li> Coloque instrumentos cirúrgicos em um esterilizador talão para 10 segundos entre camundongos. Permitir instrumentos para esfriar antes de usar. Luvas limpas com anti-séptico handrub entre ratos. Monitorar todos os ratos até que a recuperação esteja completa. </li><li> Monitorar ratos de perto após a cirurgia. Injetar um bolus de solução salina estéril (0,2 - 0,3 ml) por via subcutânea, se um rato mostra sinais de sofrimento, desidratação ou perda de peso aparente. Observar ratinhos, pelo menos, duas vezes por dia durante os primeiros 10 dias, e, pelo menos, uma vez todos os dias posteriormente. Executar uma necropsia imediatamente se algum ratos morrerem durante a infusão de AngII. Remover clips ferida entre 7 - 14 dias após a cirurgia. </li></ol> 6. colheita, Reparação, Limpeza, e imagem das aortas <ol><li> Cortar abrir o tórax do mouse e cavidades abdominal ventral, corte opeN átrio direito, perfundir com soro fisiológico através do ventrículo esquerdo do coração para remover o sangue na aorta, e em seguida a colheita da aorta 27. </li><li> Coloque aortas colhidas em tubos de plástico contendo pelo menos 3 ml de paraformaldeído a 4% ou 10% de formol neutro tamponado para 24-48 horas 27. </li><li> Remova cuidadosamente tecidos adventícios. Aorta Pin em cera preta com alfinetes. Adquirir imagens da aorta com a mesma ampliação. Incluir uma régua em cada imagem para calibração, conforme mostrado na Figura 3. </li></ol> 7. En rosto por imagem das aortas <ol><li> Corte aorta aberta longitudinalmente através da curvatura externa e interna do arco aórtico, e cortar ramos principais abertos, incluindo inominada, artéria carótida esquerda e artéria subclávia esquerda. Pin aorta plano com adventícia exterior, que ao lado da cera negra. </li><li> Adquirir en retrato face da superfície da íntima da aorta com a mesma ampliação. Incluir uma régua em cada imagem para calibração, como a mostraN na Figura 4. </li></ol>

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<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+receptor-associated+protein+attenuates+angiotensin+II-induced+atherosclerosis+in+hypercholesterolemic+mice+without+influencing+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Deficiency of receptor-associated protein attenuates angiotensin II-induced atherosclerosis in hypercholesterolemic mice without influencing abdominal aortic aneurysms.</a> Atherosclerosis. 220 (2), 375-380 (2011).</li>
<li>Daugherty, A., Rateri, D., Lu, H., Balakrishnan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+blood+pressure+in+mice+using+volume+pressure+recording%2C+a+tail-cuff+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method.</a> J Vis Exp. (27), e1291(2009).</li>
</ol>

A publicação deste artigo é patrocinado pela Alzet.

Bombas osmóticas entrega AngII por via subcutânea é uma abordagem de rotina para indução de aneurismas da aorta em ratos. Com base em dados a partir de vários laboratórios, foram descobertas consistentes que este é um método de confiança e reprodutível para estudar tanto AAA TAA 3,4 e 22-26 em ratos. Portanto, este modelo do rato é considerado um modelo que recapitula vários recursos de aneurismas da aorta humanos e fornece insights mecanicistas para essas doenças devastadoras. Embora o envelhecimento é um fator de risco para AAAs em seres humanos, não foi estudado sistematicamente para AAAs induzidas por AngII em camundongos. No entanto, verifica-se a incidência e gravidade dos AAA induzidas por AngII são semelhantes em ratos com a idade de 8 - 48 semanas 4,5,7. Atualmente, existem apenas alguns estudos que relatam TAAs induzidas por AngII em camundongos com a idade de 8 - 24 semanas 22-26, que não apresentaram diferenças relacionadas com a idade ao nível de formação TAA. Camundongos fêmeas têm uma incidência muito menor de AAAs do que camundongos machos infundidos com AngII 4,28. Também é importante notar que a incidência de induzida por AngII AAAs é muito maior em hiper do que os ratos normo-cholesterolemic, o que é mais do que 50% versus menos de 30%, respectivamente. Além disso, ruptura da aorta é freqüente (aproximadamente 10-30%) em ambos os ratos normo e hipercolesterolêmicos durante a infusão de AngII. A infusão de AngII a uma taxa de 1.000 ng / kg / min em ratos com hipercolesterolemia, tais como o receptor de LDL - / - ratos alimentados com uma dieta ocidental ou apolipoproteína (apoE) - / - ratos alimentados com uma dieta normal ou Western, tem efeitos máximos sobre AAA desenvolvimento 3,4,29. Esta taxa de infusão é óptimo para um estudo no qual a manipulação de um gene de interesse em ratinhos hipercolesterolémicos é esperado para reduzir AAA. Se uma manipulação em ratinhos hipercolesterolémicos é esperado para aumentar AAA, recomenda-se a infundir AngII a uma taxa de 500 ng / kg / min ou inferior 30. Em contraste com AAA, não há demonstraçãonstrated associação entre o sexo masculino ou hipercolesterolemia e induzida por AngII TAAs 25. No entanto, de forma semelhante ao AAA, se a manipulação de um gene de interesse é esperado para aumentar TAAs, recomenda-se uma taxa de infusão menor do que 1000 ng / kg / min durante a infusão AngII. Também é importante saber que a incidência e gravidade dos aneurismas da aorta induzida por Ang II variam entre ratinhos individuais e entre estudos. Se os ratos não desenvolvem aneurismas da aorta, uma possibilidade potencial é que AngII pode não ter sido entregue com sucesso em camundongos. Para a validação de uma elevada taxa de infusão de AngII, tal como 1,000 ng / kg / min, medição da pressão arterial é recomendada antes de, e durante, a infusão de AngII usando um método de cauda-manguito não-invasivo 31. AngII infusão a uma taxa de 1.000 ng / kg / min aumenta a pressão arterial sistólica nos ratos. Além disso, as concentrações plasmáticas de renina pode ser medida durante a infusão de AngII ou no término desde AngII tem um feedback negativo sobre rsecreção enin. Portanto, a infusão de AngII leva a reduções nas concentrações de renina plasma. Se um rato infundido com AngII não tem patologias aparentes aórtica, sem aumento da pressão arterial, e sem diminuição da concentração plasmática da renina, isso indicaria que AngII não foi entregue de forma eficiente através da mini-bomba osmótica implantado. Nós recomendamos de remover este rato do estudo. Também é importante notar que alguns ratos não desenvolvem aneurismas da aorta, apesar de aumento das pressões arterial sistólica e diminuição das concentrações plasmáticas de renina. Estes ratinhos devem permanecer no estudo. Em resumo, a infusão de AngII é conseguido por implantação subcutânea utilizando bombas osmóticas para induzir aneurismas da aorta em ratos. Este método proporciona a AngII constantemente a uma taxa definida para durações designados que são usados ​​para estudar ambos AAA e TAA.

Aneurismas da aorta apresentam expansão luminal permanente da aorta que prenuncia ruptura e normalmente leva à morte. Esta doença ocorre em ambas as regiões da aorta abdominal e torácica, que são denominados como aneurismas da aorta abdominal (AAA) e aneurismas da aorta torácica (AAT), respectivamente. Devido a uma compreensão incompleta dos mecanismos moleculares e processos patofisiológicos, não existe uma terapia médica comprovada que pode evitar expansão ou ruptura de qualquer um dos tipos de aneurismas aórticos. Uma vez que é difícil de adquirir amostras de pacientes e realizar experiências em seres humanos directamente, concentrando-se em pesquisas que define mecanismos dos AAA tem sido frequentemente extrapoladas a partir de modelos animais. Um modelo animal frequentemente utilizado consiste infusão subcutânea de angiotensina II (AngII) em ratinhos. Em comparação com outras abordagens cirúrgicas para induzir AAAs em ratinhos, tais como elastase perfusão intra-aórtico ou aplicação peri-aórtico de cloreto de cálcio que requerem laparotomia 1,2, este metod não requerem a entrada na cavidade do corpo e requer perícia cirúrgica mínimo 3,4. Infusão subcutânea de AngII através de bombas osmóticos para induzir AAAs foi inicialmente relatada em baixa densidade lipoproteína receptor (LDL) - / - ratos alimentados com uma dieta rica em gordura saturada 3, e, posteriormente, em apoE - / - ratos alimentados com uma dieta normal de laboratório 4. Muitos estudos recentes também demonstraram que AngII induz AAAs em ratos normolipidêmicos 5-7. A abordagem de infusão de AngII foi aplicado para induzir AAA e explorar os mecanismos moleculares, bem como o desenvolvimento de estratégias terapêuticas potenciais (por exemplo, 5-15) uma vez que este modelo recapitula muitas características observadas em AAA humanos. Por exemplo, fatores de risco de AAAs humanos, como o tabagismo, o envelhecimento e gênero masculino também aumentar AAAs induzidas por AngII em ratos 16,17. A associação de hipercolesterolemia com AAAs em seres humanos requer esclarecimentos. No entanto, tem seren consistente que a hipercolesterolemia aumenta AngII-induzida em camundongos AAAs 18. Patologias de AAAs induzidas por AngII em camundongos são muito heterogénea e são caracterizados por uma profunda infiltração de macrófagos, a degradação do colágeno, formação trombótica e resolução, e neovascularização 19-21. Em contraste com a localização da aorta infra-renal mais comum dos AAA em seres humanos, AngII-AAA induzida em ratinhos ocorrer na região supra-renal da aorta. Outra característica onipresente de induzida por AngII AAAs é a ruptura medial transmural, levando a trombose transmural. Não está claro se a ruptura transmural elastina ocorre em seres humanos desde o desenvolvimento patológico de AAAs em humanos não foi estudado exclusivamente devido à falta de tecidos aneurismáticas de fases anteriores. Infusão AngII em ratinhos conduz também a uma profunda expansão da região torácica da aorta, que é predominantemente restrita à aorta ascendente, que é a região mais comum nos seres humanos para TAAs <sup&gt; 19,22-26. Semelhante a AAAs induzidas por AngII, TAAs induzida durante a infusão de AngII também recapitular muitas características de TAAs humano 25. No entanto, em contraste com AAA induzidas por AngII, TAAs induzidas por AngII não estão associadas com hipercolesterolemia e não têm diferenças de género. O objectivo global da infusão subcutânea em ratos AngII é estudar características patológicas e mecanismos moleculares de AAAs e TAAs.

<table><tbody><tr><td>Angiotensina II</td><td>Bachem</td><td>H-1705</td><td>composto usado para induzir aneurismas da aorta</td></tr><tr><td>Alzet Bombas Osmóticas</td><td>DURECT Corporation</td><td>Alzet Modelo 2004</td><td>viável para infusão de 28 dias em camundongos com peso > 20 g</td></tr><tr><td>Dieta enriquecida com gordura saturada</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td>42% calorias/calorias para estimular a hipercolesterolemia em camundongos receptores de LDL -/-</td></tr></tbody></table>

subcutânea perfusão de angiotensina ii usando osmótica bombas induz aneurismas da aorta em ratos

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

As bombas osmóticas fornecem compostos continuamente a uma taxa constante em pequenos animais. Este artigo apresenta um protocolo padrão usado para induzir aneurismas da aorta por infusão subcutânea de angiotensina II (AngII) a partir de bombas osmóticas implantadas. Este protocolo inclui cálculo da quantidade e dissolução de AngII, enchimento da bomba osmótica, implante de bombas osmóticas por via subcutânea, observação após o implante da bomba e coleta de aortas para visualizar aneurismas da aorta em camundongos. A infusão subcutânea de AngII através de bombas osmóticas seguindo este protocolo é uma técnica confiável e reprodutível para induzir aneurismas da aorta abdominal e torácica em camundongos. A duração da infusão varia de alguns dias a vários meses com base no objetivo do estudo. AngII 1.000 ng/kg/min é suficiente para fornecer efeitos máximos na formação de aneurisma da aorta abdominal em modelos de camundongos hipercolesterolêmicos machos, como camundongos deficientes em apolipoproteína E ou deficientes em receptores de lipoproteína de baixa densidade. A incidência de aneurismas da aorta abdominal induzidos por infusão de AngII via bombas osmóticas é 5 a 10 vezes menor em camundongos hipercolesterolêmicos fêmeas e também menor em ambos os sexos de camundongos normocolesterolêmicos. Em contraste, os aneurismas da aorta torácica induzidos por AngII em camundongos não são hipercolesterolêmicos ou dependentes do sexo. É importante ressaltar que várias características desse modelo de camundongo recapitulam as dos aneurismas da aorta humana.

Os 4 receptor de LDL macho - / - ratos descritos na secção protocolo foram sacrificados após 4 semanas de infusão AngII. Aortas foram recolhidas, limpas, e fotografada para visualizar dilatações da aorta. Como mostrado na Figura 3, as aortas têm várias características diferentes, incluindo a expansão da região supra-renal (AAAS; Figura 3A), a expansão da região ascendente (TAAs; Figura 3B), ou a expansão de ambas as regiões (presença de ambos AAA e TAA; Figura 3C), enquanto que a morfologia de um rato foi grosseiramente normal (Figura 3D). A dilatação da aorta abdominal é quantificada através da medição da largura máxima ex vivo da região supra-renal, como ilustrado pela linha a vermelho na Figura 3A. Para medir a dilatação da aorta ascendente, as aortas foram cortadas aberta e fixada, conforme mostrado na Figura 4. A área de superfície da intima foi medido na região da aorta ascendente (área rodeada por The as linhas vermelhas na Figura 4A) para quantificar TAAs. Uma régua foi incluído em cada imagem para normalizar as medições, como mostrado em ambas as Figuras 3 e 4. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig1.jpg" /> . Figura 1. Imagem representativa de bomba osmótica cheia Cada bomba contém duas partes: um corpo principal e um regulador de fluxo. Depois de encher o corpo de bomba com AngII, o regulador de fluxo é inserido para vedar a bomba. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig2.jpg" /> Figura 2. Processo de cirurgia de implantação da bomba (A) do rato é colocado numa campânula laminar com um cone de nariz que é continuamente libertar isoflurano e oxigénio.; (B) uma pinça hemostática linear é inserido na incisão na pele para formar um túnel subcutâneo; (C) da bomba é inserido através da<html> incisão na pele suavemente; (D) A incisão na pele é grampeado após a inserção da bomba. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig3.jpg" /> Figura 3. imagens aórtica (ex vivo) a partir de murganhos sujeitos a infusão com AngII AngII 1.000 ng / kg / min foi infundido em receptor de LDL macho -. / - Ratos, durante 28 dias. (A) AAA acompanhada por trombose; A linha a vermelho (2,05 mm) mostra a medição da largura máxima da aorta na região supra-renal. (B) dilatação da aorta ascendente (TAA) com aorta abdominal grosseiramente normal; (C) dilatações profundas, tanto na aorta ascendente e regiões supra-renais (TAAs e AAAS); (D) aorta grosseiramente normal, sem dilatação aparente de ascendente ou região da aorta supra-renal. 4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. En imagens de face de regiões da aorta torácica de ratos infundidos com AngII angii 1.000 ng / kg / min foi infundida no receptor LDL masculino -. / - Ratos por 28 dias. Superfície contornado por uma linha vermelha representa a região da aorta ascendente, incluindo parte do arco aórtico. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="2"> Dose requerida </td><td></td><td> 1000 </td><td colspan="2"> ng / kg / min </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> Comece o peso corporal (o maior mouse) </td><td> 24,8 </td><td> g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> Ganho de peso corporal total estimado </td><td> 1 </td><td> g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> Taxa de bombeamento </td><td></td><td></td><td> 0,25 </td><td> uL / hr </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Number de murganhos </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="2"> Dose por hora para animais </td><td></td><td> 1518 </td><td> ng </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> Conc necessário </td><td></td><td></td><td> 6072 </td><td> ng / ul </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="2"> Para 300 solução ul </td><td></td><td> 1.82 </td><td colspan="2"> mg / 300 ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> Solução necessária </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td colspan="2"> Total de AngII (mg) </td><td></td><td> 7.3 </td><td> mg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 </td><td colspan="2"> Dissolvido em solução salina &amp;# 160; </td><td></td><td> 1200 </td><td> ul </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rato </td><td> Peso corporal </td><td> Factor de diluição </td><td colspan="2"> Volume (uL) </td><td colspan="2"> Bomba Peso (g) </td><td> Rácio preenchido </td></tr><tr><td> # </td><td> (g) </td><td></td><td> AngII </td><td> Salina </td><td> Vazio </td><td> Preenchidas </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24,5 </td><td> 1.0 </td><td> 296,4 </td><td> 3.6 </td><td> 1,1443 </td><td> 1,3877 </td><td> 99 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 23,0 </td><td> 0,9 </td><td> 278.2 </td><td> 21,8 </td><td> 1,1677 </td><td> 1,4145 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24,8 </td><td> 1.0 </td><td> 300,0 </td><td> 0.0 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21,8 </td><td> 0,9 </td><td> 263,7 </td><td> 36,3 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="7"> Factor de diluição = peso do corpo do rato peso / corpo do rato maior </td><td></td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Rato </td><td> Peso corporal </td><td> Factor de diluição </td><td colspan="2"> Volume (uL) </td><td colspan="2"> Bomba Peso (g) </td><td> Rácio preenchido </td></tr><tr><td> # </td><td> (g) </td><td></td><td> AngII </td><td> Salina </td><td> Vazio </td><td> Preenchidas </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24,5 </td><td> 1.0 </td><td> 296,4 </td><td> 3.6 </td><td> 1,1443 </td><td> 1,3877 </td><td> 99 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 23,0 </td><td> 0,9 </td><td> 278.2 </td><td> 21,8 </td><td> 1,1677 </td><td> 1,4145 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24,8 </td><td> 1.0 </td><td> 300,0 </td><td> 0.0 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21,8 </td><td> 0,9 </td><td> 263,7 </td><td> 36,3 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Cálculo para a infusão de 28 dias por meio de bombas osmóticas.

A implantação subcutânea de bombas osmóticas fornece uma abordagem conveniente para administração prolongada e constante de compostos. Esta abordagem tem sido amplamente utilizado para estudar ambos os aneurismas aórticos torácicos e abdominais em ratos.

Subcutânea perfusão de angiotensina II usando osmótica Bombas Induz aneurismas da aorta em ratos

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar as características patológicas e os mecanismos moleculares de aneurismas aórticos em camundongos. Isso é realizado primeiramente preparando uma bomba osmótica com solução de angiotensina dois. Em seguida, é feita uma bolsa na pele das costas do animal, na qual a bomba é inserida.Por fim, a dilatação da aorta nas regiões torácica e abdominal pode ser avaliada por imagem ex vivo. Assim, implementamos primeiramente esta técnica porque desejávamos definir o papel da pressão sanguínea ao infundirmos angiotensina para promover o desenvolvimento da aterosclerose. Demonstrarão o procedimento Deborah Hart e Angio banan, ambos membros do Centro de Pesquisa Cardiovascular Soha para preencher as bombas osmóticas.Inicie registrando o número do lote das bombas e dos moderadores de fluxo incluídos com o corpo principal da bomba e do fluxo. Use luvas para evitar transferir óleo das mãos para a carcaça externa da bomba. Em seguida, abra somente o número de bombas e moderadores de fluxo necessários para o estudo.Em seguida, pese cada bomba, incluindo tanto o corpo principal quanto o moderador de fluxo, anotando o peso com quatro casas decimais. Esse peso, denominado peso da bomba vazia no modelo, será utilizado para calcular a proporção preenchida quando todas as bombas tiverem sido pesadas. Afixe a agulha de preenchimento da bomba a uma seringa estéril de um cc e encha cuidadosamente a seringa com solução recém-preparada de angiotensina dois proveniente do tubo plástico numerado corretamente.Remova cuidadosamente todas as bolhas de ar da seringa com a agulha voltada para baixo. Em seguida, mantenha a seringa nessa posição para evitar a introdução de bolhas na bomba. Insira suavemente a agulha de enchimento no corpo da bomba.Quando a agulha estiver no lugar, avance a ponta para dentro da bomba até que toque levemente o fundo da bomba. Em seguida, pressione lentamente o êmbolo para dispensar aproximadamente 246 microlitros da solução. A sombra escura no interior da bomba pode ser usada para monitorar o nível de preenchimento.A bomba está cheia. Quando uma gota de fluido emergir da bomba, remova cuidadosamente a agulha e insira o moderador de fluxo na bomba através do orifício na parte superior do corpo da bomba até que não haja mais nenhuma folga entre a cabeça do moderador de fluxo e o topo do corpo da bomba. Remova cuidadosamente qualquer vazamento adicional de fluido resultante da inserção.Em seguida, pese a bomba cheia e registre o peso na célula correspondente da bomba e do peso cheio no modelo. A razão de preenchimento pode então ser calculada usando a fórmula, e esses dados podem ser inseridos na célula de razão de preenchimento do modelo. Idealmente, a razão de preenchimento deve ser igual ou maior que 95%. Quando a bomba estiver cheia, coloque-a em um tubo plástico estéril apropriado de quatro mililitros, com a cabeça do moderador voltada para cima, e adicione um volume suficiente de solução salina estéril para cobrir a bomba.Em seguida, quando todas as bombas tiverem sido armazenadas, coloque os tubos em uma incubadora a 37 graus Celsius por pelo menos 12 horas para permitir o pré-enchimento parcial das bombas no dia da implantação. Usando jaleco, máscara e luvas, raspe uma área do tamanho de um quarto sobre o ombro de um camundongo anestesiado e transfira o animal para uma cabine de fluxo laminar. Após aplicar pomada nos olhos do animal e confirmar a ausência de resposta ao pincé no dedo do pé, limpe e passe com Betadine a área raspada, seguido por três passagens com etanol a 70%.Em seguida, utilize um escalpelo cirúrgico esterilizado em autoclave para fazer uma incisão de um centímetro na pele perpendicular à cauda e atrás da orelha, acima da escápula da pata dianteira. Depois, com uma pinça em uma das mãos, abra a incisão utilizando um hemostato. Com a outra mão, faça um túnel subcutâneo sob a pele, avançando a ponta do hemostato em direção à cauda.Abra cuidadosamente as hastes do hemostato para abrir uma bolsa para a bomba. Em seguida, substitua o hemostato pela bomba correspondente apropriada, com a cabeça moderadora posicionada na parte traseira do camundongo, e empurre suavemente a bomba completamente para dentro do bolso. Deve haver espaço livre suficiente para fechar a ferida sem tensão ou distensão da pele.Uma vez que a bomba esteja posicionada, pinçe firmemente e alinhe ambos os lados da incisão para que as bordas se encontrem e fechem a pele com um ou dois clipes cirúrgicos. Examine o local da incisão para garantir o fechamento completo do ferimento e para verificar se a bomba não está pressionando diretamente sobre a incisão. Em seguida, use um cotonete limpo para aplicar creme tópico de lidocaína na região.Por fim, transfira o camundongo para uma placa aquecida até que recupere a consciência e, em seguida, devolva o animal à sua gaiola. Neste experimento, após quatro semanas de infusão de angiotensina por meio de bombas implantadas conforme demonstrado, essas aortas foram coletadas de camundongos knockout para o receptor de lipoproteína de baixa densidade para visualização das dilatações aórticas. Como observado nas imagens, as aortas exibiram diversas características diferentes, incluindo a expansão da região suprarrenal, a expansão da região ascendente ou a expansão de ambas as regiões, com um camundongo apresentando morfologia grosseiramente normal.A dilatação da aorta abdominal foi então quantificada medindo-se a largura máxima ex vivo da região senal, conforme ilustrado pela linha vermelha para medir a dilatação da aorta ascendente. A aorta foi então aberta e fixada como mostrado. A área de superfície intimal foi medida na região da aorta ascendente com as réguas em cada uma dessas imagens e nas subsequentes, incluídas para garantir a padronização das medições, uma vez dominado o procedimento.Este procedimento não deve levar mais de cinco minutos para ser concluído por massa.

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Research

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Medicine

Medicina

Ultra-sonografia tornou-se uma modalidade comum para determinar as dimensões luminal dos aneurismas da aorta torácicas e abdominais em ratos. Este protocolo descreve o procedimento para adquirir imagens de ultrassom bidimensional confiável e reprodutível da aorta ascendente e abdominal em ratos.

Ecografia da Aorta torácica e Abdominal em ratos para determinar as dimensões de aneurisma

Nós descrevemos um protocolo cirúrgico para induzir consistentemente aneurismas aórticos torácicos de descida robustos nos ratos. O procedimento envolve a toracotomia esquerda, a exposição da aorta torácica e a colocação de uma esponja embebida em elastase pancreática suína na parede aórtica.

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Este modelo novo cria aneurismas abdominais infra-renais robustos no suíno usando uma combinação de angioplastia do balão, perfusão elastase/collagenase, aplicação tópica da elastase, e administração do composto oral β-aminopropionitrile, que interfere com a cruz-ligação do colágeno.

Modelo suíno de aneurisma aórtica abdominal infra-renal

O presente protocolo descreve um método cirúrgico padronizado para o modelo AAA induzido por elastase através da aplicação direta de elastase à adventitia da aorta abdominal infrarenal em camundongos.

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Este protocolo descreve a implantação consecutiva de uma bomba osmótica para induzir aneurisma aórtico abdominal por angiotensina II liberação em camundongos deficientes apolipoprotein E (ApoE) e de uma porta de acesso vascular com cateter venoso jugular para tratamento medicamentoso repetido. O monitoramento do desenvolvimento de aneurisma por ultrassom 3D é efetivamente realizado apesar dos implantes dorsais.

Tratamento medicamentoso por Cateter Venoso Central em um Modelo de Camundongo de Angiotensin II Aneurisma Abdominal Induzido anótico e monitoramento por ultrassom 3D

Este protocolo descreve um modelo de rato com aneurisma da aorta abdominal induzido por fosfato de cálcio (AAA) para estudar as características patológicas e os mecanismos moleculares dos AAAs.

Um Modelo de Aneurisma da Aorta Abdominal de Camundongo Induzido por Fosfato de Cálcio

Este manuscrito apresenta um protocolo para estabelecer um modelo de aneurisma de aorta abdominal de camundongo usando cloreto de cálcio e elastase, combinando as vantagens dos métodos de modelagem anteriores. Este modelo pode ser utilizado para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes aos aneurismas da aorta abdominal.

Um modelo de aneurisma de aorta abdominal de camundongo por infiltração periadventícia de cloreto de cálcio e elastase

Este protocolo descreve uma abordagem cirúrgica metódica para modelar aneurismas avançados da aorta abdominal em camundongos por uma combinação de aplicação direta de elastase na aorta infrarrenal e administração de ß-aminopropionitrila através da água potável.

Modelagem Avançada de Aneurisma da Aorta Abdominal em Camundongos por Combinação de Elastase Tópica e ß-aminopropionitrila Oral

Este protocolo fornece um procedimento detalhado e passo a passo para a indução de dissecção da aorta torácica em camundongos. Especificamente, inclui o cálculo preciso das doses necessárias de β-aminopropionitrila e angiotensina II, o procedimento para enchimento da bomba osmótica e a técnica de implantação da bomba osmótica.

Modelo murino de dissecção da aorta torácica induzida por infusão oral de β-aminopropionitrila e angiotensina II subcutânea

Esse protocolo oferece um método repetível e confiável para induzir aneurismas da aorta abdominal (AAA) em camundongos C57BL/6, utilizando sensibilização com elastina e aplicação de elastase perivascular, como um modelo AAA que incorpora um componente de sensibilização imunológica.

Criação confiável de um modelo de aneurisma aórtico abdominal murino usando sensibilização com elastina e elastase perivascular

Aprenda a induzir aneurismas aórticos em camundongos por meio de infusão subcutânea de angiotensina II utilizando bombas osmóticas. Este método permite estudar os mecanismos moleculares da dilatação aórtica.

Subcutânea perfusão de angiotensina II usando osmótica Bombas Induz aneurismas da aorta em ratos

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