In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método eficiente para gerar células dendríticas plasmáticas ou PDCs para o estudo de seu desenvolvimento. Este método pode ajudar questões-chave no campo da gordura imunológica, como Como o desenvolvimento do PDC é regulado? A principal vantagem desta técnica é que permite o uso de um pequeno número de células progenitoras para gerar eficientemente grandes quantidades de PDCs.

As implicações desta técnica são para a terapia de doenças autoimunes associadas à PDC, como lúpus sistêmico, atetose e psoríase. Demonstrando o procedimento hoje será xang um grande estudante de laboratório No dia anterior à colheita de células da medula óssea semente AC seis células de linha de células estromais em 5,9 vezes 10 para as células quarto por poço em poços individuais de 12 placas de poços e incubar as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. Na manhã seguinte, irradie as seis células AC a 3000 rad e substitua o meio de cultura por um mililitro de meio completo.

Em seguida, coloque o número apropriado de camundongos selvagens adultos tipo C 57 pretos em uma bandeja de dissecação e esterilize os animais com etanol a 70%. Em seguida, mova a bandeja para um capuz semi-estéril e faça incisões no meio do abdômen de cada animal, removendo a pele das partes distais, incluindo as extremidades inferiores para liberar os fêmures e tíbias, corte o fêmur acima e as tíbias abaixo das articulações do joelho e use uma tesoura para separar os músculos dos ossos à medida que são coletados. Coloque os ossos em uma placa de Petri de seis centímetros contendo cinco mililitros de RPMI completo e transfira a placa de Petri para uma capela de cultura estéril.

Agora encha uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de calibre 27 com RPMI completo e use uma tesoura para cortar as duas extremidades de cada osso. Insira a agulha em cada osso e lave a medula com uma injeção suave de RPMI completo uma vez em cada extremidade. Em seguida, sem a agulha, aspire e dispense suavemente as células três a cinco vezes na placa de cultura para gerar uma única suspensão celular.

Depois de girar as células, ligue os glóbulos vermelhos com um mililitro de tampão CK, interrompendo a reação com 10 volumes de RPMI completo. Após um minuto, deixe os aglomerados de células mortas e detritos sedimentarem por cinco minutos e, em seguida, decanta cuidadosamente o sobrenadante em um novo tubo. Então, depois de girar as células novamente, suspendemos o total de células da medula óssea em 100 microlitros de tampão fax para analisar os progenitores linfóides comuns ou CLPs por citometria de fluxo.

Em seguida, o FC bloqueia as células com anti CD 16 a 32 por um a dois minutos, seguido de coloração simultânea das células com o coquetel de anticorpos apropriado. Após 15 minutos no gelo, lave as células em três mililitros de tampão de fax e ressuspenda o pellet em 300 microlitros de tampão de fax fresco. Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de 40 micrômetros e classifique imediatamente as células em um citômetro de fluxo usando os filtros e tensões apropriados.

Coletando as células de interesse em um tubo de 15 mililitros, contendo oito mililitros de RPMI completo. Para gerar uma população de PDCM altamente enriquecida, é crucial separar a população certa de CLPs de células de medula óssea colhidas para sua cultura in vitro com um sistema de alimentação Z six. No final da classificação, gire as células e ressuspenda o pellet de células CLP com RPMI completo suficiente para obter uma densidade celular de cerca de cinco vezes 10 das quartas células por mililitro.

Em seguida, semeie 500 células por poço na placa de 12 poços contendo as células alimentadoras AC seis e complemente as coculturas com 100 nanogramas por mililitro FL três ligante, depois incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com monitoramento visual periódico da célula dendrítica ou desenvolvimento DC sob um microscópio. No dia 12, colha as células no sobrenadante de co-cultura e lave cada poço uma vez com meio mililitro de meio RPMI completo, agrupando o snat e as lavagens resultantes. Em seguida, adicione meio mililitro de meio fresco a cada poço e use um raspador de células para separar as células aderentes.

Combine as células separadas com as células flutuantes e centrifugue a suspensão celular resultante. Resus suspendendo o pellet em 50 microlitros de buffer de fax. Em seguida, conte as células e cove-as para CD 11 C, CD 11 b e B duas expressões 20 após o bloqueio de FC.

Como acabamos de demonstrar, as células de co-cultura podem então ser analisadas quanto à presença de CD 11 C convencional, CD 11 B positivo, B positivo dois 20 negativos e CD plasmocitóide 11 C CD positivo 11 B. B negativo duas populações DC 20 positivas um total de quatro a seis vezes 10 elevado ao sétimo. As células da medula óssea são tipicamente isoladas dos fêmures e da tíbia de um camundongo selvagem tipo C 57 preto de seis a oito semanas de idade, com cinco vezes 10 elevado ao quarto CLPs comumente obtidos de um camundongo C 57 preto de seis. Após a classificação por citometria de fluxo, conforme demonstrado pelos dias três a quatro de co-cultura com AC seis células alimentadoras, as células formadoras de área de paralelepípedos começam a aparecer com DC plasmocitóide de formato redondo aparecendo suspensas no topo da área de paralelepípedos formando células.

No oitavo dia, o número de cito DC plasmáticas atinge o pico por volta dos dias 12 a 14, momento em que as células começam a sofrer apoptose após seu desenvolvimento completo e seus números começam a diminuir gradualmente. As colônias DC convencionais aparecem mais tarde, no sexto ao oitavo dia, e são aderentes a uma morfologia fusiforme maior. A análise por citometria de fluxo demonstra que as coculturas são 91% CD 11 C, CD positivo 11 B, negativo B dois 20 plasmocitóides positivos dc e 6% CD 11 C, CD positivo 11 B, positivo B dois 20 DC convencional negativo, revelando uma expansão de 100 vezes dos números de DC plasmocitóides da população CLP original por este método.

Ao tentar este procedimento, é importante certificar-se de que a célula ac six está em boas condições e a densidade C está correta antes de adicionar o clp após um desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores em biologia DC superarem a limitação de usar um pequeno número de projetores para estudar o desenvolvimento DC de diferentes projetores. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar PCs in vitro a partir do CLP usando um sistema C six BEAT.