In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método eficiente para gerar células dendríticas plasmocitoides ou PDCs para o estudo de seu desenvolvimento. Este método pode auxiliar em questões fundamentais na área de imunologia, como por exemplo: Como é regulado o desenvolvimento das PDCs? A principal vantagem desta técnica é que permite o uso de um pequeno número de células progenitoras para gerar eficientemente grandes quantidades de PDCs.

As implicações dessa técnica apontam para o tratamento de doenças autoimunes associadas ao PDC, como lúpus sistêmico, atetose e psoríase. Demonstrando o procedimento hoje estará Xang, um excelente aluno do laboratório. No dia anterior à coleta das células da medula óssea, semeie células da linhagem celular estromal AC6 na concentração de 5,9 vezes 10 à quarta células por poço em poços individuais de placas de 12 poços e incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. Na manhã seguinte, irradie as células AC6 com raios gama a 3000 rad e substitua o meio de cultura por um mililitro de meio completo.

Em seguida, coloque o número apropriado de camundongos adultos selvagens do tipo C57 black six em uma bandeja de dissecação e esterilize os animais com etanol 70%. Em seguida, transfira a bandeja para uma capa semiestéril e faça incisões na região mediana do abdômen de cada animal, removendo a pele das partes distais, incluindo as extremidades inferiores, para expor os fêmures e tíbias, seccionando o fêmur acima e as tíbias abaixo das articulações do joelho, e use uma tesoura para remover os músculos dos ossos à medida que são coletados. Coloque os ossos em uma placa de Petri de seis centímetros contendo cinco mililitros de RPMI completo e transfira a placa de Petri para uma capa de cultura estéril.

Agora, preencha uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de 27 gauge com RPMI completo e use uma tesoura para cortar ambas as extremidades de cada osso. Insira a agulha em cada osso e lave a medula com uma injeção suave de RPMI completo uma vez por cada extremidade. Em seguida, sem a agulha, aspire e dispense suavemente as células de três a cinco vezes na placa de cultura para obter uma suspensão de células simples.

Após centrifugar as células, lise os glóbulos vermelhos com um mililitro de tampão CK, interrompendo a reação com 10 volumes de RPMI completo. Após um minuto, deixe os agregados de células mortas e detritos sedimentarem por cinco minutos e, em seguida, decante cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo. Em seguida, após centrifugar as células novamente, suspendemos as células totais da medula óssea em 100 microlitros de tampão fax para analisar os precursores linfoides comuns ou CLPs por citometria de fluxo.

A seguir, bloquee as células com anti-CD16/32 por um a dois minutos, seguido pelo marcamento simultâneo das células com o coquetel de anticorpos apropriado. Após 15 minutos no gelo, lave as células em três mililitros de tampão fax e re-suspenda o pellet em 300 microlitros de tampão fax fresco. Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de 40 micrômetros e imediatamente purifique as células em um citômetro de fluxo utilizando os filtros e tensões apropriados.

Coletar as células de interesse em um tubo de 15 mililitros, contendo oito mililitros de RPMI completo. Para gerar uma população altamente enriquecida de PDCM, é fundamental separar a população correta de CLPs das células da medula óssea colhidas para seu cultivo in vitro com um sistema de alimentação Z seis. Ao final da separação, centrifugar as células e ressuspender o pellet de células CLP com volume suficiente de RPMI completo para obter uma densidade celular de cerca de cinco vezes 10 à quarta células por mililitro.

Em seguida, semeie 500 células por poço em uma placa de 12 poços contendo as células alimentadoras AC seis e suplemente as culturas co com 100 nanogramas por mililitro do ligante FL três; então, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, com monitoramento visual periódico do desenvolvimento das células dendríticas ou CD em microscópio. No dia 12, recolha as células no sobrenadante da co-cultura e lave cada poço uma vez com meio meio mililitro de meio RPMI completo, reunindo o sobrenadante resultante e as lavagens. Em seguida, adicione meio meio mililitro de meio fresco a cada poço e utilize um raspador celular para destacar as células aderentes.

Combine as células destacadas com as células em suspensão e centrifugue a suspensão celular resultante. Reconstitua o pellet em 50 microlitros de buffer fax. Em seguida, conte as células e as marque para expressão de CD11c, CD11b e B220 após bloqueio FC.

Como acabou de ser demonstrado, as células em co-cultura podem então ser analisadas quanto à presença de CD11c convencional positivo, CD11b positivo, B220 negativo e plasmacitoide CD11c positivo, CD11b negativo, B220 positivo. As populações de DC totalizam de quatro a seis vezes 10⁷. Células da medula óssea são normalmente isoladas dos fêmures e tíbias de um camundo C57BL/6 selvagem com seis a oito semanas de idade, obtendo-se comumente cinco vezes 10⁴ CLPs de um único camundo C57BL/6. Após classificação por citometria de fluxo, conforme acabou de ser demonstrado, entre os dias três e quatro de co-cultura com células alimentadoras AC6, começam a surgir células formadoras de áreas em calçamento, com células dendríticas plasmacitoides com formato arredondado aparecendo em suspensão sobre as células formadoras de áreas em calçamento.

No oitavo dia, o número de DC plasmocitoides atinge um pico por volta dos dias 12 a 14, momento em que as células começam a sofrer apoptose após seu completo desenvolvimento, e seus números começam a diminuir gradualmente. As colônias de DC convencionais aparecem mais tarde, entre o sexto e oitavo dia, e são aderentes, com morfologia alongada semelhante a um fuso. A análise por citometria de fluxo demonstra que as culturas co são 91% CD11c positivas, CD11b negativas, B220 positivas (DC plasmocitoides) e 6% CD11c positivas, CD11b positivas, B220 negativas (DC convencionais), revelando uma expansão de 100 vezes no número de DC plasmocitoides a partir da população original de CLP por este método.

Ao realizar este procedimento, é importante certificar-se de que a célula a c seis esteja em boas condições e de que a densidade de C esteja correta antes de adicionar o clp após um desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de biologia de DC superassem a limitação do uso de um pequeno número de projeções para estudar o desenvolvimento de DC a partir de diferentes projeções. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar PCs in vitro a partir de CLP utilizando um sistema C seis BEAT.