Name: Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda a gerar células pluripotentes induzidas a partir de células T periféricas humanas usando vírus Sendai em condições livres de alimentador. Este método seguro reduz riscos de patogenicidade para aplicações em medicina regenerativa.

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Agradecemos Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, e Ohno Rei da Escola de Medicina da Universidade de Keio para assistência técnica. Este trabalho foi parcialmente financiado por um programa de apoio à I &amp; D Systems para acelerar a utilização prática dos resultados da pesquisa em saúde, e do Programa Estrada para a Realização de Medicina Regenerativa.

1. Prepare células T humanas activadas <ol><li> Colete 10 ml de sangue total heparinizado de um doador por punção venosa. <ol><li> Obter o consentimento informado dos doadores antes da punção venosa. Punção venosa deve ser feita por pessoal qualificado e treinado. </li><li> Lidar com amostras de sangue obtidas com equipamentos esterilizados e seguintes diretrizes de biossegurança adequadas. </li></ol></li><li> Dilui-se 10 ml de sangue total heparinizado com 10 ml de D-PBS (-). </li><li> Colocar 15 ml de Ficoll solução (prémio de Ficoll-Paque) para um novo tubo cónico de 50 ml. </li><li> Camada da solução de sangue de 20 ml, preparada na etapa 1.2 para a solução de Ficoll no passo 1.3. Usando uma pipeta elétrica, deixe a solução de sangue preparada no Passo 1.2 funcionar lentamente ao longo da parede interior do tubo. Tenha cuidado para não misturar a solução de sangue e solução de Ficoll. </li><li> Centrifuga-se a 400 x g durante 30 min à TA. Defina a velocidade de desaceleração centrífuga para &quot;lento&quot;. Nota: Após a centrifugação, uma fina brancocamada surge entre uma camada de plasma leitoso superior e uma camada inferior Ficoll clara. Esta fina camada branca contém células mononucleares. </li><li> Transferir a camada de células mononucleares para um novo tubo cónico de 50 ml com uma pipeta de 1 ml. Tenha cuidado para não incluir solução Ficoll. </li><li> Adicionar D-PBS (-) para as células mononucleares a um volume total de 10 ml, e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. </li><li> Desprezar o sobrenadante. Adicionar 10 ml de D-PBS (-) para as células mononucleares, e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. </li><li> Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 ml de meio KBM502 para as células mononucleares coletadas, e contar as células utilizando um hemocitómetro. Mais de 5 x 10 6 células mononucleares pode ser obtido a partir de 10 ml de sangue total heparinizado com separação apropriada usando Ficoll. </li><li> Prepara-se uma solução de anticorpo anti-CD3 humano a uma concentração de 10 ug / ml em D-PBS (-). Adicionar a solução de anticorpo anti-CD3 humano de uma placa de 6 poços, embeber a ressacaás de cada poço, e a incubação do prato a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 durante pelo menos 30 min. </li><li> Remover a solução de anticorpo CD3 anti-humano a partir de cada cavidade e lavar uma vez com D-PBS (-) imediatamente antes de semear as células. </li><li> Células mononucleares de semente que foram preparados no passo 1.9, a uma densidade de 2,5 x 10 5 células / cm2 sobre o anti-CD3 humana revestidas com anticorpo placas de 6 poços em meio de KBM502. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante 3-7 dias, sem mudança de meio, as células T até a confluência. As células T neste período são as duas células em suspensão e aderentes. </li></ol> 2. As células T humanas Infect com SEV Vetores <ol><li> Depois de 3-7 dias de cultura, recolher as células T ativadas com meio existente por pipetagem. Transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco KBM502. Contar as células e placa 1.5 x 10 6 células (em 2 ml de meio fresco KBM502) em cada poço de um anti-CD3 anticorpo revestidos por placa de 6 poços. </li><li> Descongele as soluções de OCT3 SEV / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, e c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF no gelo. </li><li> Adicionar as soluções contendo OCT3 Sev / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, e c-Myc (LCF) -SeV / TS15ΔF individualmente para os poços, cada um com uma multiplicidade de infecção (MOI) 10. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante mais 24 horas. </li></ol> 3. Retire Vetores SEV de células T humanas <ol><li> 24 h após a infecção, as células infectadas recolha com uma pipeta. Se houver células aderentes, eles podem facilmente ser destacado pipetando-los várias vezes para cima e para baixo. Transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. </li><li> Remover o sobrenadante contendo os vetores SEV, e adicionar 2 ml de meio KBM502 fresco. Células replate em each dos poços. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante mais 24 horas adicionais. </li></ol> 4. RESEED células em uma camada Matrigel <ol><li> Preparar a solução matriz da membrana basal por gel matriz descongelação (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) a 4 ° C e dissolvendo 0,2 ml em 10 ml de meio DMEM / F12. Nota: gel Matrix (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) precisa descongelar O / N a 4 ° C para ser totalmente descongelado. Mantenha-o em gelo até imediatamente antes da utilização. </li><li> Placa 5 ml de solução de matriz da membrana basal por placa em placas de 100 mm e deixar à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min antes da sementeira de células. Pelo menos duas placas de 100 mm são necessários para um experimento. </li><li> Recolhe células SEV-infectados por pipetagem, transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco KBM502. Contar o número de cells usando um hemocitômetro, remova a solução de matriz da membrana basal de pratos de 100 mm preparado no passo 4.2 e placa 1 × 10 5 e 1 × 10 6 células (em 10 ml de meio mTeSR fresco) em uma de 100 mm membrana basal matriz revestido pratos. Finalmente, use a placa em que as colônias são facilmente colhidas. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora S / N. </li><li> Mude a médio e 10 ml carne médio mTeSR a cada dois dias. Nota: Aproximadamente 20-30 dias após a infecção, colônias que se assemelham células-tronco embrionárias (CES) aparecerá. </li></ol> 5. Expanda T iPSCs derivadas de células <ol><li> Preparar a solução matriz da membrana basal por gel matriz descongelação (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) a 4 ° C e dissolvendo 0,2 ml em 10 ml de meio DMEM / F12. </li><li> Placa 1 ml da solução de matriz da membrana basal por poço numa placa de 6 poços e deixar à temperatura ambiente durante amenos 30 minutos antes de escolher colônias. </li><li> Encha uma placa de 96 poços com 20 ul de meio por poço mTeSR. </li><li> Selecione colônias que se assemelham a CES sob o microscópio estereoscópico com uma pipeta de 20 mL. Nota: As colônias do CES e iPSCs são redondos e lisos como mostrado na Figura 1B. </li><li> Transferência de colónias seleccionadas para a placa de 96 poços preenchidos com meio mTeSR no passo 5.3. </li><li> Adicionar 200 ul de meio mTeSR a cada poço e cuidadosamente pipetar para cima e para baixo para quebrar a colónia em pequenos torrões, ao microscópio estereoscópico, utilizando uma pipeta de 200 uL. Remover a solução de matriz de membrana basal preparado a partir do poço de 5,2 e colocar cada colónia para um poço da membrana basal revestida de matriz de 6 poços da placa com 2 ml de meio por poço mTeSR. </li><li> Mude a médio e 2 ml carne médio mTeSR a cada dois dias. </li></ol> 6. Manter T iPSCs derivadas de células Os iPSCs derivadas de células T pode ser mantidae armazenadas usando as mesmas técnicas que para iPSCs humanos e CES humanos. Uma vez colónias IPSC crescer, expandir-los em pratos maiores, repetindo o mesmo procedimento. <ol><li> Mudar o meio mTeSR a cada 1-2 dias. </li><li> Quando as colónias tornam-se confluentes a cada 5-7 dias, a passagem das células, utilizando uma solução de dissociação para iPSCs humanos e CES humanos de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol>

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Os autores não têm nenhum concorrente ou interesses conflitantes para divulgar.

Descrevemos um protocolo para gerar iPSCs a partir de células T periféricas humanas em condições livres de soro e alimentador usando uma combinação de vetores matrigel, meio mTeSR e SeV. Para aplicações clínicas de iPSCs, é importante ter um protocolo para gerar iPSCs de forma estável e um método menos invasivo para amostragem celular. Embora a geração de iPSCs com a combinação de matrigel e meio mTeSR tenha apresentado menor eficiência de reprogramação do que com meio de reposição de soro knockout (KSR) e células-alimentadoras, essa combinação atinge uma geração estável de iPSCs a partir de doadores16. A geração estável de iPSC e a amostragem de células menos invasivas têm a vantagem de poder aumentar o número de doadores para a geração de iPSC. 
Os vetores SeV, um vírus de RNA de fita negativa, não estão integrados ao genoma do hospedeiro. Portanto, os riscos de tumorigênese podem ser evitados na etapa de indução do fator de reprogramação20-24. Além disso, as condições livres de alimentador, que usam uma combinação de meio de cultura definido e matrigel em vez de uma camada de alimentador, tornam possível minimizar os riscos potenciais de exposição a fatores exógenos desconhecidos. A fusão dessas técnicas fornece uma tecnologia iPSC menos invasiva e segura para a medicina regenerativa16.
Etapas importantes neste protocolo são a etapa de ativação de células T humanas (Etapa 1) e infectá-las com vetores SeV (Etapa 2). Quando nenhuma colônia do tipo ESC é obtida na placa de cultura em um momento ideal após a infecção por SeV, o seguinte deve ser considerado. Primeiro, a confluência das células mononucleares antes da ativação das células T pode não ser apropriada porque a ativação ideal das células T é crítica para a infecção por SeV25,26. Uma densidade muito alta de células mononucleares leva à morte celular, interferindo na ativação adequada das células T. Uma densidade muito baixa de células mononucleares também perturba a ativação e proliferação adequadas de células T. Portanto, a confluência de células mononucleares deve ser verificada e ajustada de acordo. Em segundo lugar, a dosagem dos vetores SeV pode não ser suficiente. A eficiência de indução das colônias de iPSC depende da dosagem do vírus6. Se nenhuma colônia semelhante a ESC for observada após a infecção por SeV, a opção de aumentar a dose do vírus até um MOI de 15-20 deve ser considerada. Se forem observados sinais de diferenciação de colônias iPSC, a frequência com que o meio é alterado pode ser aumentada até dias alternados ou para todos os dias em que as colônias são maiores. 
A limitação neste protocolo consiste em este método não estar livre de vírus. Embora o SeV para reprogramação celular esteja disponível comercialmente com facilidade, os usuários precisam preparar o equipamento de acordo com o nível de biossegurança apropriado. Como outro método para gerar iPSCs livres de integração, vetores epissómicos têm sido usados até o momento27-29. Embora os vetores epissómicos possam ser usados com equipamentos com menor nível de biossegurança, os vetores epissómicos podem inserir-se no genoma do hospedeiro a taxas extremamente baixas. Portanto, verificações adicionais são necessárias para confirmar o desaparecimento de transgenes, como no uso de SeV.
Há outra limitação em que esta técnica não é absolutamente isenta de produtos derivados de animais. Alguns substratos, como matrigel, mAb anti-CD3, solução de dissociação e solução de SeV são derivados de produtos de origem animal e, portanto, estão associados a um risco de transferência de patógenos xenogênicos. No entanto, a redução de substratos derivados de animais no sistema de cultura é significativa para a aplicação clínica da tecnologia iPSC devido ao menor risco.

iPSCs atraíram considerável atenção como uma fonte inovadora de células para a medicina regenerativa 1-3. Até à data, diversos métodos para gerar iPSCs foram relatados 4,5. Entre estes, iPSCs gerado a partir de células T humanas têm sido de particular interesse devido ao método menos invasivo da célula de amostragem 6-8. Além disso, iPSCs derivadas de células T contêm rearranjos do gene receptor de células T (TCR) e são, portanto, uma fonte de células T específicas de antigénio 9,10. Portanto, a geração de células T derivados iPSCs é seguramente útil para avançar a medicina regenerativa. Este método baseia-se no conceito de reduzir o risco de patogenicidade imprevisível. Para aplicação clínica segura de iPSCs é importante para reduzir o risco de exposição a agentes patogénicos 11. Anteriormente em diversos sistemas de cultura de células estaminais pluripotentes, células de soro bovino fetal e de alimentação têm sido utilizados como reagente essencialS 12. No entanto, a remoção de ambos os reagentes a partir do sistema de cultura para a geração é preferível iPSC para reduzir o risco de patogenicidade imprevisível. Além disso, este método tem a vantagem de evitar amostragem invasiva de células de pacientes e laboriosa preparação de células alimentadoras. Como células T derivadas iPSCs já têm sido utilizados com sucesso na pesquisa de doenças 13,14, este método também é aplicável e útil para gerar iPSCs de doenças específicas de pacientes. Entre os métodos de reprogramação das células T, utilizando o vector de vírus Sendai (SeV) como um veículo de genes é um método que pode gerar iPSCs com alta eficiência 7,16. Além disso, porque é um SeV single-stranded RNA vírus e não necessita de uma fase para a replicação de ADN, a sua utilização na produção de iPSC evita quebrar o genoma do hospedeiro 17-19. Portanto, nós estabelecemos protocolos para gerar iPSCs de células T periférico humano no soro-free e condições de livre-de alimentação, utilizando uma combinação de matrigel, médio mTeSR, e SEV vetores.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo purificado NA/LE anti-humano CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>555336</td><td></td></tr><tr><td>Solução de albumina bovina fração V</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 kit médio</td><td>STEM CELL</td><td>5850</td><td>Aqueça à temperatura ambiente antes de usar</td></tr><tr><td>Solução de dissociação</td><td>ReproCELL</td><td>RCHETP002</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (&ndash;)</td><td>Wako</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0</td><td>DNAVEC</td><td>DV-0303c</td><td>Descongele no gelo antes</td></tr><tr><td>de usar Placa de cultura de tecidos de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 96 poços</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>15&#160; ml Tubo de Centrífuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50&#160; ml Tubo de centrífuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano t células usando sendai virus em condições livres de alimentador

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recentemente, iPSCs têm atraído a atenção como uma nova fonte de células para terapias regenerativas. Embora o método para a geração inicial iPSCs invocado fibroblastos dérmicos obtidos por biópsia invasiva e inserção genómico retroviral de transgenes, tem havido muitos esforços no sentido de evitar estas desvantagens. As células T periférico humano são uma fonte de célula exclusivo para gerar iPSCs. iPSCs derivadas de células T contêm rearranjos do receptor de células T (TCR) e os genes são uma fonte de células T específicas de antigénio. Além disso, o rearranjo receptor de células T no genoma tem o potencial para identificar linhas de células individuais e distinguir entre células transplantadas e doadores. Para aplicação clínica segura de iPSCs, é importante minimizar o risco de expor iPSCs recém-gerados a agentes nocivos. Embora as células de soro bovino fetal e de alimentação têm sido essenciais para a cultura de células estaminais pluripotentes, é preferível removê-los a partir do sistema de cultura para reduzir o riscode patogenicidade imprevisível. Para resolver isso, nós estabelecemos um protocolo para gerar iPSCs de células T periférico humano usando vírus Sendai para reduzir o risco de exposição a patógenos iPSCs indefinidos. Embora a manipulação do vírus Sendai requer equipamento com o nível de segurança biológica apropriada, Sendai vírus infecta células T activadas sem inserção do genoma, mas com elevada eficiência. Neste protocolo, demonstramos a geração de iPSCs de células T periférico humano em condições de livre-de alimentação, utilizando uma combinação de cultura de células T ativadas e vírus Sendai.

<html> Usando este protocolo, os usuários são capazes de gerar iPSCs de células T periférico humano estavelmente. geração iPSC a partir de células T com SeV e Matrigel mostrou aproximadamente 0,002% -. 0.005% de eficiência de reprogramação celular entre vários casos doadores e SeV não foram detectados após várias passagens 16 A Figura 1A mostra um esquema do protocolo para a geração de células T derivadas de iPSCs em condições de livre-feeder usando matrigel e médio mTeSR. Cerca de 20-30 dias após a infecção com SeV, colónias IPSC são reconhecidos por sua colônia ESC-como a morfologia (Figura 1B). Imunofluorescência revelou a expressão de marcadores típicos de células pluripotentes (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) em T-iPSCs derivadas de células gerada sob condições isentas de alimentação (Figura 1C). &quot;Width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 1. (A): Um esquema do protocolo de reprogramação das células T sob condições isentas de alimentação nesse estudo. (B): A ESC-como colônia típica iPSC no dia 27 após a coleta de sangue em condições de livre-de alimentação. (C): coloração ALP e imunofluorescência para marcadores de pluripotência e de superfície (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) em T-iPSCs derivadas de células geradas sob condições isentas de alimentação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53225/53225fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve como gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas em condições livres de alimentador usando uma combinação de vetores de vírus matrigel e Sendai contendo fatores de reprogramação.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco pluripotentes induzidas ou CTPis a partir de linfócitos T periféricos humanos em condições livres de camada de sustentação. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da medicina regenerativa, incluindo como as células CTPi podem ser aplicadas no uso clínico. A principal vantagem desta técnica é que as células CTPi podem ser obtidas sem a inclusão de fatores de reprogramação potencialmente prejudiciais, o que reduz o risco de patogenicidade.A implicação desta técnica se estende mundialmente a terapias clínicas baseadas em células IPS de relevância clínica, devido a essa coleta de células invasiva combinada à redução do risco de exposição das células IPS em desenvolvimento a patógenos indefinidos. Assim, este método pode fornecer subsídios para a terapia clínica com células IPS. Também pode ser aplicado a outras áreas, como modelagem de condições de doenças.Inicie o preparo de linfócitos T humanos ativados diluindo 10 mililitros de sangue total heparinizado com 10 mililitros de DPBS pipetado. Adicione 15 mililitros de solução fol em um tubo cônico de 50 mililitros. Pipete lentamente o sangue diluído ao longo da parede interna do tubo para formar uma camada sobre a solução.Tenha cuidado para não perturbar a interface. Centrifugue o tubo a 400 vezes G durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, observe três camadas, incluindo uma camada inferior clara, uma camada branca fina contendo células mononucleares e uma camada superior de plasma esbranquiçada.Transfira a camada de células mononucleares para um novo tubo cônico de 50 mililitros sem transferir nenhuma solução do filtro. Em seguida, adicione DPBS para completar o volume total a 10 mililitros. Centrifugue o tubo a 200 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente.Descarte o sobrenadante, lave as células com 10 mililitros de DPBS, centrifugue o tubo a 200 × g durante cinco minutos e remova o sobrenadante. Em seguida, adicione um mililitro de meio KBM 5 0 2 às células e realize a contagem utilizando um hemocitômetro para preparar a placa de cultura celular. Revesta os poços de uma placa de seis poços com uma solução de anticorpo anti-CD3 humano a 10 microgramas por mililitro em PBS. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 30 minutos.Após a incubação, remova a solução de anticorpo da placa oito e lave uma vez com PBS. Semee as células mononucleares numa densidade de 2,5 vezes 10 à quinta células por centímetro quadrado, num volume total de dois mililitros de meio KBM 5 0 2, em placas de seis poços revestidas. Incube as células por três a sete dias sem trocar o meio, momento em que os linfócitos T devem atingir confluência. Após os três a sete dias, transfira os linfócitos T ativados com o meio para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 200 vezes G durante cinco minutos. Remova o SNAT e adicione um mililitro de meio KBM 5 0 2 fresco.Conte as células e plaque 1,5 vezes 10 elevado a seis células em dois mililitros de meio KBM 5 0 2 em cada poço de uma placa de seis poços revestida com anticorpo anti-CD3. Em seguida, descongele as soluções do vírus Sendai engenheirado OC3-SOX2, KLF4 e C-MYC-H, e adicione cada vírus individualmente a cada poço numa multiplicidade de infecção de 10. Incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Em seguida, colete as células infectadas com uma pipeta e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugue as células a 200 vezes G durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e adicione dois mililitros de meio KBM 5 0 2 fresco. Transfira as células para os poços de uma placa de seis poços e incube por 24 horas em uma incubadora de cultura celular.Para recobrir as células, primeiro descongele a solução de matriz da membrana basal a quatro graus Celsius durante a noite, dissolva 0,2 mililitros da solução descongelada em 10 mililitros de meio DMEM F-12 e plaque cinco mililitros da solução de matriz da membrana basal em placas de 100 milímetros. Deixe as placas em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos para permitir que a matriz recubra a placa antes de semear as células. Enquanto isso, colete os linfócitos T infectados com o vírus SAI em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 200 × g por cinco minutos.Em seguida, ressuspenda o palato em um mililitro de meio KBM 5 0 2 fresco e conte as células utilizando um hemocitômetro após o período de incubação de 30 minutos. Remova a solução de matriz da membrana basal das duas placas, então ressuspenda uma vez 10 à quinta células e separadamente uma vez 10 à sexta células em 10 mililitros de meio M-T-E-S-R fresco, um meio de cultura livre de células alimentadoras para ipsc. Pipete cada suspensão celular em uma placa separada de 100 milímetros.Incube a placa em uma incubadora de cultura celular. Troque o meio a cada dois dias após 20 a 30 dias. Devem aparecer colônias que se assemelham a colônias de células-tronco embrionárias.Prepare seis placas com poços para expansão de IPSCs, incubando um mililitro de solução de matriz da membrana basal em cada poço durante 30 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, examine as placas de cultura contendo colônias de IPSCs sob um microscópio estereoscópico e isole colônias individuais raspando-as com uma pipeta de 20 microlitros. Transfira cada colônia para um poço de uma placa de 96 poços contendo 20 microlitros de meio M-T-E-S-R.Após transferir as colônias, adicione 200 microlitros de meio M-T-E-S-R a cada poço e pipete para cima e para baixo para desagregar a colônia. Após remover a solução de matriz da membrana basal das placas de seis poços, transfira células de uma colônia individual para cada poço, adicione dois mililitros de meio M-T-E-S-R, incube as células em um incubador de cultura celular e troque o meio a cada dois dias utilizando cultura livre de camada de sustentação e meios livres de soro. As células-tronco pluripotentes induzidas foram geradas a partir de linfócitos T periféricos humanos. A coloração por imunofluorescência revelou expressão de marcadores típicos de células pluripotentes, incluindo Nanog, T, Oct3/4, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81.Nessas linhagens derivadas de IPSE. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar todas as etapas, levando em consideração todas as considerações essenciais de assepsia e segurança biológica.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós demonstramos o protocolo para a geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células somáticas humanas usando lentivírus mediada entrega dos fatores humanos Oct4, Sox2, Nanog e Lin28. Pluripotência foi confirmado pela morfologia e pela presença de tronco embrionárias (ES) de células específicas marcadores.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

O objetivo deste protocolo é mostrar o protocolo de reprogramação de linfócitos infiltrantes de tumor de melanoma em células-tronco pluripotentes induzidas.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de melanoma humano linfócitos tumor infiltrantes

Propomos um protocolo para reprogramação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Ao plaquear as células sanguíneas transduzidas em placas revestidas com matriz com centrifugação, as iPSCs são induzidas com sucesso a partir de células flutuantes. Esta técnica sugere um protocolo de reprogramação simples e eficaz para células como PBMCs e CBMCs.

Induzida Geração Stem Cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus Sendai e centrifugação

Este protocolo descreve um método detalhado para a geração eficiente de iPSCs livres de integração a partir de células sanguíneas periféricas adultas humanas. Com o uso de quatro vetores epissómicos baseados em oriP/EBNA para expressar os fatores de reprogramação, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 e SOX2, milhares de colônias de iPSC podem ser obtidas a partir de 1 mL de sangue periférico.

Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando epissï¿½ica Vectors

Este artigo descreve um procedimento para produzir iTenócitos gerando células estromais mesenquimais derivadas de iPSC com superexpressão combinada de Scleraxis usando um vetor lentiviral e estiramento uniaxial através de um biorreator 2D.

Geração de itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos via superexpressão combinada de escleraxis e tensão uniaxial 2D

Aprenda a gerar células pluripotentes induzidas a partir de células T periféricas humanas usando vírus Sendai em condições livres de alimentador. Este método seguro reduz riscos de patogenicidade para aplicações em medicina regenerativa.

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Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

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