Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco pluripotentes induzidas ou IPCs a partir de células T periféricas humanas em condições livres de alimentador. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina regenerativa, incluindo como as células IPS podem ser aplicadas ao uso clínico. A principal vantagem dessa técnica é que as células IPS podem ser curadas sem a inclusão de possível refatoração de danos, o que reduz o risco de patogenicidade.

A implicação desta técnica estende as terapias baseadas em células IPS clinicamente relevantes em todo o mundo devido à amostragem de células invasivas combinada com a redução do risco de expor as células IPS em desenvolvimento a patógenos indefinidos. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre a terapia clínica do serviço IPS. Também pode ser aplicado a outras áreas, como condições de modelagem de doenças.

Comece a preparar células T humanas ativadas diluindo 10 mililitros de sangue total heparinizado com 10 mililitros de pipeta DPBS. 15 mililitros de solução de fol em um tubo cônico de 50 mililitros. Pipete lentamente o sangue diluído que corre ao longo da parede interna do tubo para colocar em cima da solução.

Tenha cuidado para não perturbar a interface. Centrifugue o tubo a 400 vezes G por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, observar três camadas, incluindo uma camada clara inferior, uma fina camada branca contendo células mononucleares e uma camada superior de plasma leitoso.

Transferir a camada de células mononucleares para um novo tubo cónico de 50 mililitros sem transferir qualquer solução de orifício de encaixe. Em seguida, adicione DPBS para trazer o volume total para 10 mililitros. Centrifugar o tubo a 200 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Rejeitar o sobrenadante, lavar as células com 10 mililitros de DPBS, centrifugar o tubo a 200 vezes G durante cinco minutos e retirar o sobrenadante. Em seguida, adicione um mililitro de meio KBM 5 0 2 às células e conte usando um hemocitômetro para preparar a placa de cultura de células revestir os poços de uma placa de seis poços com 10 microgramas por mililitro de solução de anticorpo anti-CD humano três em PBS. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 30 minutos.

Após a incubação, remova a solução de anticorpos da placa oito e lave uma vez com semente de PBS as células mononucleares a uma densidade de 2,5 vezes 10 elevado às quintas células por centímetro quadrado em um volume total de dois mililitros de meio KBM 5 0 2 nas placas de seis poços revestidas incubar as células por três a sete dias sem alterar o meio, ponto em que a célula T deve atingir a confluência após os três a sete dias. Transferir as células T activadas com um meio para um tubo cónico de 15 mililitros e centrifugar a 200 vezes G durante cinco minutos. Remova o SNAT e adicione um mililitro de KBM 5 0 2 médio fresco.

Conte as células e a placa 1,5 vezes 10 elevado às seis células em dois mililitros de meio KBM 5 0 2 em cada poço de uma placa de seis poços revestida com anti CD três em seguida, descongele as soluções de vírus OC três SOX dois, KLF quatro e C-M-Y-C-H e L sendi no gelo em cada vírus Sendai projetado individualmente para cada poço e uma multiplicidade de infecção de 10. Incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Em seguida, colete as células infectadas com uma pipeta e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros.

Centrifugar as células a 200 vezes G durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e adicione dois mililitros de meio KBM 5 0 2 fresco. Substitua as células nos poços de uma placa de seis poços e incube por 24 horas em uma incubadora de cultura de células.

Para recuar as células, primeiro descongele a solução da matriz da membrana basal a quatro graus Celsius durante a noite, dissolva 0,2 mililitros da solução pensada em 10 mililitros de DMM F 12, placa média, cinco mililitros da solução da matriz da membrana basal em pratos de 100 milímetros. Deixe as placas em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos para permitir que a matriz cubra a placa antes de semear as células. Enquanto isso, colete as células T infectadas pelo vírus SAI em um tubo cônico de 15 litros e centrifugue a 200 vezes G por cinco minutos.

Em seguida, ressuspenda o palato em um mililitro de meio KBM 5 0 2 fresco e conte as células usando um hemocitômetro após o período de incubação de 30 minutos. Remova a solução da matriz da membrana basal das duas placas, em seguida, ressuspenda uma vez 10 para as quintas células e separadamente uma vez 10 para as seis células em 10 mililitros de meio M-T-E-S-R fresco, um meio de cultura livre de células alimentadoras para ipsc. Pipetar cada suspensão celular para uma placa separada de 100 milímetros.

Incube a placa em uma incubadora de cultura de células. Mudando o meio a cada dois dias após 20 a 30 dias. Colônias que se assemelham a colônias de células-tronco embrionárias devem aparecer.

Prepare seis placas de parede para expansão IPSC incubando um mililitro de solução de matriz de membrana basal em cada poço por 30 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, visualize as placas de cultura contendo colônias de IPSC sob um microscópio estéreo e isole as colônias individuais raspando-as com uma pipeta de 20 microlitros. Transfira cada colônia para um poço e uma placa de parede 96 contendo 20 microlitros de meio M-T-E-S-R.

Depois de transferir as colônias, adicione 200 microlitros de meio M-T-E-S-R a cada poço e pipete para cima e para baixo para interromper a colônia. Depois de remover a solução de matriz de membrana basal das seis placas de poço, transfira as células de uma colônia individual para cada poço, adicione dois mililitros de meio MTESR, incube as células em uma incubadora de cultura de células e troque o meio a cada dois dias usando cultura livre de alimentador e meio livre de soro ipsc foram gerados a partir de células T periféricas humanas. A coloração imunofluorescente revelou a expressão de marcadores celulares pluripotentes típicos, incluindo nano T três quatro SSEA quatro, TRA um 60 e TRA 180 1.

Nessas linhas derivadas do IPSE. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar todas as etapas, levando em consideração todas as considerações importantes de esterilidade e biossegurança.