Name: Quantificação de mutações de células-tronco do cólon (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda a quantificar mutações somáticas no gene G6PD em células-tronco do cólon de camundongos após exposição a agentes genotóxicos. Este método permite medir a frequência de mutações e avaliar efeitos carcinogênicos.

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Os autores não têm confirmações.

Os procedimentos experimentais e tratamento ético dos animais foi aprovado pela Universidade de Pittsburgh IACUC (protocolo nº 1104674). 1. Preparação de G6PD Coloração Mistura NOTA: Certifique-se de que a concentração final de cada um dos reagentes é a seguinte; 5 mM de glicose-6-fosfato (G6P); NADP 2 mM, 5 mM de MgCl2, 0,35 mM de 1-metoxi-5-methylphenazinium sulfato de metilo (MMPMS) e 0,8 mM de NBT 1,8,9 Para cada reagente a concentração inicial foi derivado para um volume final de 40 ml.. As soluções foram preparados e utilizados a cada dia. <ol><li> Adicionar 2 ml de mM pH 7,4 tampão de fosfato 200 (PB) para 35 ml de meio de outubro em um tubo de 50 mL e agitar vigorosamente. Confirmar com papel de pH que a solução é ~ pH 7,4. Se não descartar a solução. </li><li> Adicionar 61 mg G6P dissolvido em 0,94 ml de PB 200 mM, 61 mg de NADP dissolvido em 0,94 ml de PB 200 mM, e 41 mg de MgCl2 dissolvido em 0,96 ml de 100 mM PB. Reconfirmar que o pH é de ~ 7,4 sagacidadeh papel de pH. Se não ~ 7.4, rejeitar a solução. </li><li> Adicionam-se 5 mg de MMPMS dissolvidos em 0,25 ml de OP 200 mM (pH 7,4). Agitar vigorosamente a mistura de reacção resultante para gerar um homogeneizado claro vermelho escuro. Se a solução é turva, a mistura deve ser descartado. O tubo contendo a mistura reaccional é envolvido em folha para minimizar a exposição à luz. Armazenar a mistura de reacção à temperatura ambiente, enquanto o componente final, o NBT, é preparado. </li><li> Preparar separadamente uma solução de NBT 5 mM pela adição de 0,4 ml de dimetilformamida anidra (DMF) e 0,4 ml de etanol anidro a 164 mg de NBT em um tubo de 2 ml com uma tampa de O-ring. Fechar a tampa solta (não hermeticamente fechado) e levar a solução a ebulição vigorosa num banho de óleo até o NBT é em solução. 8 </li><li> Permitir que o NBT solubilizado a arrefecer até à temperatura ambiente e, em seguida, adicionar toda a solução à mistura reaccional PTU e agitar vigorosamente para se obter uma solução clara. Observar a mudança de cor da solução de vermelho-alaranjado inicial a um vermelho-escuro ou purple cor ao longo do tempo. Isto é normal. </li><li> Coloque a mistura final coloração de G6PD num banho a 37 ° C sala quente durante 1 h antes da utilização. </li></ol> 2. Tratamento Animal e Recolha de Tecidos <ol><li> Tratar de 6 semanas de idade C57BL / 6, machos, com agente de danificação do ADN, por exemplo, 10 mg / kg de azoximetano (AOM), num volume de 200 ul de PBS por injecção ip. Tratar ratinhos de controlo com 200 mL de PBS por injecção ip. </li><li> Aos 90 dias, eutanásia ratos por asfixia com CO2 seguido por deslocamento cervical aprovado pelo protocolo IACUC. </li><li> Cirurgicamente abrir a cavidade abdominal, desde um pouco acima do ânus para a base do esterno. Mover o intestino delgado para fora da cavidade do corpo, mas que não excisar. Extirpar o intestino grosso, logo abaixo do ceco ao reto. 10 </li><li> Slice cuidadosamente ao longo de um lado do cólon usando uma tesoura de micro-dissecção e remover as fezes do cólon aberto limpo por lavagem com PBS estéril. Rocambole a impostos especiais de consumod colon com o lado luminal voltado para fora, e coloque em um molde de tecido 10. </li><li> Mergulhe completamente o cólon em outubro médio e lugar molde em uma Dewar contendo líquido N2. Segurar o molde de modo que a base de plástico é apenas em contacto com o líquido de N2 até a forma OCT é congelado. </li><li> Armazenar o bloco de tecido congelado a -80 até o corte cortes congelados. Não utilizar qualquer fixador, o que iria resultar na inactivação da enzima G6PD. </li></ol> 3. Preparação de secções congeladas <ol><li> Os cortes de tecido congelado com uma espessura de 7 uM utilizando um criostato a -25 ° C. Corte 4 consecutivos 7 mm seções e colocar dois deles na mesma lâmina (Figura 1). Preparar 2 corrediças, ou quatro secções consecutivas 7 uM para representar um nível do cólon (Figura 1). </li><li> Repita o procedimento para o próximo nível com uma distância mínima de&gt; 50 mm a partir da última seção do prnível evious. Esta distância assegurado que as criptas avaliada para cada nível não duplicar um ao outro. </li><li> Frequentemente limpar a lâmina de criostato com etanol a 100% para remover o resíduo OCT que se acumula durante o corte. Antes de seccionamento seja retomada, a lâmina seca é limpa com uma folha de secador antiestática para dissipar a carga estática acumulada. Loja slides com as secções congeladas a -80 o C. </li></ol> 4. Coloração de congelação do tecido <ol><li> Realizar a reação histoquímica da enzima em um 37 ° C sala quente com humidade elevada. NOTA: A tentativa da reação enzimática em um forno de incubação ou sobre um aquecedor de slides levou a coloração G6PD pobre e inconsistente. </li><li> Construção de poços para a coloração de tecidos usando dois 1,5 cm x 0,15 cm anilhas de aço (diâmetro interior x altura) que estão ligadas em conjunto com massa de silicone (Figura 1). Cortar o parafilme para encaixar a base do poço com o centro cortado e o bem lugard através da secção de tecido no slide. NOTA: O parafilme na parte inferior da máquina de lavar cria uma vedação entre a corrediça e a anilha que mantém a mistura de coloração de G6PD viscoso sobre a secção de tecido. Esta construção proporciona um poço com um 0,4 - 0,5 ml de volume de modo a que cada secção de tecido no estudo recebem o mesmo volume da mistura de reacção de coloração de G6PD. </li><li> Incubar as lâminas de tecido congelado a 37 o C em uma sala quente por 10 min. A 37 ° C, adiciona-se a mistura reaccional de coloração de G6PD a cada poço secção de tecido (2 secções por diapositivo) para 45-50 min. Remover as lâminas da sala quente, e retire cuidadosamente os poços de aço inoxidável fora dos slides. </li><li> Definir slides em sua borda longa para permitir que o meio de reação para drenar. Colocar as lâminas em PB 100 mM (pH 7,4) durante 30-60 minutos para remover a mistura de reacção de G6PD coloração do tecido, sem perturbar a coloração de tecidos. Mergulhe as lâminas em água destilada por 5-10 min para remover os sais PB </li><li> Selar o tecido por adding fluoro-gel a partir de um conta-gotas sobre o tecido e espera ~ 30 minutos para secar. Evitar bolhas que podem confundir a identificação de criptas mutados. NOTA: Se se formem bolhas, o procedimento pode ser repetido depois da remoção da f luoro-gel por imersão em água destilada. Não use lamelas como eles tendem a bolhas de ar armadilha. </li></ol> 5. Determinação da G6PD Mutant criptas e Mutação Freqüência <ol><li> Analisar escorregas para G6PD criptas mutantes sob um microscópio de luz. NOTA: Os critérios utilizados para identificar uma cripta totalmente mutante foram: (i) toda a cripta era desprovido de cor azul; (ii) a estrutura externa da cripta estava intacto, (iii) o mutante cripta foi observada em secções adjacentes 7 uM e, (iv) tinha dois observadores para identificar o mesmo cripta como um mutante. Mutantes observadas em adjacentes 7 mm seções são contados como um mutante. </li><li> Imagem cada cripta mutante G6PD em 40x e catalogar as imagens usando uma câmera de 5.0 megapixel comsoftware de imagem. </li><li> Quantificar o número total de criptas examinados num murganho, seleccionando uma secção representativa para cada rato a partir do nível com a área de superfície menor que a imagem e ampliação de 10x (Figura 1C). NOTA: A nível representa quatro consecutivos 7 mm seções (Figura 1D), que devido à sua proximidade muitas vezes mostram criptas mutantes em mais de uma seção. Os níveis são separados por&gt; 50 fim de visualizar a partir de diferentes áreas de criptas do cólon. </li><li> Abrir cada ficheiro de imagem visual e contagem do número de criptas em um nível através da análise dos arquivos (mostrados como caixas na Figura 1C). Arquivos de imagens irão variar no número de criptas observados a partir de tão baixo quanto 20 a&gt; 300 criptas em um arquivo. </li><li> Multiplicar o número total de criptas do nível seleccionado (Figura 1C) para cada rato ao número de níveis rastreados para criptas G6PD mutantes para cada um dos dois pontos. Por exemplo, uma contagem total de1.250 criptas por nível selecionado, multiplicado por 8 níveis selecionados para criptas mutantes é igual a uma contagem total de 10.000 criptas. Avaliar um mínimo de 10.000 criptas para cada cólon para análise estatística. </li><li> Combinar o número de mutantes observadas em todos os animais pelo número total de criptas rastreados para calcular o MF para cada tratamento. O nível MF células-tronco em ratos não tratados fundo é &lt;0.1x10 -4 (Tabela 1), que é próximo ao relatado anteriormente em camundongos C57BL / 6. 11 </li></ol>

<ol><li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li>
<li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li>
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<li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li>
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<li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li>
<li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon%3A+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Muitas vezes a efeitos genotóxicos de um composto é determinada pela sua capacidade de modificar o ADN. Isso normalmente é feito pelo isolamento do tecido e medindo o nível global do adutos de DNA. Para AOM, isso envolveria quantificar O 6 -metilguanina adutos no cólon. Usando esta abordagem informações sobre os danos dentro tipos celulares específicos, tais como no nicho de células estaminais, é perdido. Além disso, um produto de adição de ADN não é o mesmo que uma mutação uma vez que apenas um pequeno subco...

O cancro do cólon é pensado para envolver exposição a agentes ambientais e componentes da dieta que podem danificar DNA e produzir mutações ativadoras somáticas em oncogenes (por exemplo, ß-catenina) ou inativação de mutações em genes supressores de tumores (por exemplo, a APC). Supõe-se que estas mutações ocorrem em críticos células estaminais do cólon. Devido à arquitectura única cripta do epitélio do cólon, é possível medir as mutações de células estaminais no cólon após a exposição dos animais a produtos químicos associados com a carcinogénese do cólon. Várias enzimas ligadas ao cromossoma X pode servir como indicadores de mutações que ocorrem em células estaminais, como as mutações vão estar presentes em todas as células dentro de um cripta. Anteriormente, foi publicado um procedimento demonstrando que os produtos químicos que induzem tumores do cólon em ratos também gerado mutações somáticas de células estaminais no cólon através de análise de mutações em glicose-6-fosfato desidrogenase ligada ao cromossoma X do gene (G6PD) 1-3.O método quantifica a incidência de mutações somáticas aleatórios em células estaminais do cólon sem qualquer pressão selectiva. O procedimento envolve a produção de secções de cólon congelados não corrigidos de camundongos tratados e de controlo ea identificação das criptas desprovidas de células que produzem atividade G6PD funcional. Estes criptas mutadas, que aparecem branco, indicam que a mutação ocorreu em uma célula estaminal que deu origem a progénie também albergar um gene G6PD mutado. No ensaio enzimático, G6PD criptas mutante deficiente não pode oxidar a glicose-6-fosfato, o qual é necessário para a redução de nitro azul de tetrazólio (NBT). Quando a enzima é funcional em G6PD, o NBT na mistura corante é reduzida a formazano insolúvel e precipitados, acumulando no local da enzima e células &quot;azuis&quot; de coloração. As células que são mutantes G6PD permanecem esbranquiçada em contraste com corados com Azul criptas do tipo selvagem. Este método mede a mutações que têm um fenótipo &quot;nulo&quot;. Porque enZymes, tais como G6PD, pode difundir para fora das células sobre uma secção de tecido não fixado se as secções são colocadas numa solução aquosa, que é necessário para estabilizar a enzima nas secções de tecido a serem analisadas. 4 A estabilização da enzima na tecido não deve interferir com a difusão de moléculas pequenas de reagentes necessários para a reacção enzimática de G6PD. Fizemos uma série de mudanças significativas para o processo inicial. O meio para a coloração enzimática crítico foi alterado de álcool polivinílico óptima para o Composto Temperatura de corte (OCT), o que facilita o controlo do pH e a solubilização dos componentes utilizados no ensaio. A coloração é realizada usando 0,4 - 0,5 ml poços feitas de anilhas de aço de modo a que cada secção de tecido recebeu o mesmo volume da mistura de reacção de G6PD. Um procedimento foi desenvolvido para estimar o número de criptas em uma secção trabalhada que fornece uma grande amostragem de tecido do cólon sem terpara contar manualmente&gt; 10 5 para cada criptas do cólon. A análise de 7 uM secções de tecido adjacentes proporciona a visualização de uma cripta mutante em mais de uma corrediça, o que reduz os potenciais artefactos de coloração. Estas alterações tornam o procedimento mais eficiente e reprodutível. Usando este protocolo revisto, temos quantificada a frequência de mutação em células estaminais do cólon após a exposição de ratinhos C57BL / 6 para azoximetano, um carcinogéneo cólon bem conhecido em roedores. 5-7

<table><tbody><tr><td>reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nitroazul tetrazólio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NADP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glicose-6-fosfato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-metoxi-5-metilfenazinium metil sulfato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dimetil formamida</td> tampão fosfato (<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Composto de Temperatura de Corte Ótima (OCT)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio de luz equipado com câmera</td><td></td><td></td><td></td>de 5 megapixels</tr><tr><td>criostato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sala quente&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de mutações de células-tronco do cólon

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

A capacidade de medir mutações de células-tronco é uma ferramenta poderosa para quantificar em uma população de células crítico se, e em que medida, um produto químico pode induzir mutações que potencialmente levam ao câncer. O uso de um ensaio enzimático para a determinação de mutações de células estaminais no gene da desidrogenase de glicose-6-fosfato ligado ao X foi previamente relatada. 1 Este método requer a preparação de secções congeladas e incubação do tecido seccionado com uma mistura de reacção que produz um cor azul, se as células de produzir uma enzima funcional da desidrogenase glicose-6-fosfato (G6PD). Se não, as células parecem esbranquiçado. Modificou-se a mistura de reacção óptima utilizando o Composto Temperatura de corte (OCT) forma em lugar de álcool de polivinilo. Isto facilita a medição de pH, aumenta a solubilização dos componentes de coloração G6PD e restringe a difusão da enzima G6PD. Para demonstrar que a mutação ocorreu em uma célula estaminal, toda a cripta tem falta de G6PD enzimáticaactividade. Somente se uma célula-tronco abriga uma mutação G6PD fenotípica serão todos da descendência na cripta falta atividade enzimática da G6PD. Para identificar criptas com uma mutação de células-tronco, quatro cortes congelados adjacentes consecutivos (um nível) foram cortados em 7 mm espessura. Esta abordagem de fazer cortes adjacentes conformação que proporciona uma cripta foi completamente mutado desde o mesmo cripta mutado será observado nas secções adjacentes. As lâminas com amostras de tecido que eram mais do que 50 mm de intervalo, foram preparados para avaliar um total de&gt; 10 4 criptas por rato. A frequência de mutação é o número de mutantes (branco) criptas ÷ observados pelo número de tipo selvagem (azul) criptas em um grupo de tratamento.

A capacidade de medir mutações de células-tronco de cólon em animais oferece uma maneira única de correlacionar mutações para indução de cancro. Normalmente, presume-se que o passo crítico na carcinogénese envolve a activação de mutações em oncogenes e / ou inactivação de mutações em genes supressores de tumores. Nós injectados ratinhos C57BL / 6 com 200 ul de PBS ou 10 mg / kg OMA em 200 ul de PBS. OMA é uma substância cancerígena conhecida cólon. 5-7 Aos 90 dias os dois pontos foram analisados ​​para mutaçõ...

Relatamos melhorias significativas para a medição reprodutível de mutações somáticas de células-tronco colônicas após a exposição de camundongos a potenciais agentes prejudiciais ao DNA.

Quantificação de mutações de células-tronco do cólon

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar mutações somáticas fenotípicas no gene da glicose seis fosfato desidrogenase ou G6PD em células-tronco do cólon. Após o tratamento dos animais com agentes genotóxicos putativos, isso é realizado primeiramente tratando os animais com o agente e aguardando um tempo apropriado para permitir que a progênie de uma célula-tronco portadora de uma mutação na G6PD preencha completamente uma cripta, sacrificando então o animal, removendo o cólon e moldando-o em formato de rocambole, seguido pelo congelamento do tecido em nitrogênio líquido. O segundo passo consiste em preparar cortes congelados com sete mícrons de espessura sobre lâminas a partir do cólon, utilizando um criostato.O tecido é aquecido a 37 graus Celsius e, em seguida, são delimitados poços por coloração tecidual ao redor das secções teciduais. O passo final consiste em incubarem-se as secções teciduais com a mistura de coloração de G six PD e, depois, analisar as secções ao microscópio óptico: células com atividade de G six PD coram-se de azul, enquanto aquelas com mutações fenotípicas apresentam-se esbranquiçadas. Por fim, a quantificação de crips mutadas é utilizada para determinar a frequência de mutação.Esta técnica mede mutações somáticas na glicose seis fosfato desidrogenase em células-tronco, que são a população celular crítica na carcinogênese do cólon. Ao identificar mutações em células-tronco somáticas, é possível correlacionar a frequência de mutações com a incidência de câncer de cólon em animais tratados. Embora este método possa fornecer informações sobre mutações em células-tronco no cólon, ele também pode ser aplicado a outros organismos modelo ou sistemas orgânicos.Se um nicho de células-tronco puder ser identificado, geralmente os indivíduos novos neste método terão dificuldades com o preparo da solução de MBT. Solubilização. A solução de MBT exige atenção cuidadosa às instruções detalhadas. Para começar a preparar a solução de coloração histológica, adicione dois mililitros de tampão fosfato com pH 7,4 a 35 mililitros de meio de temperatura de corte ideal, ou meio OCT, em um tubo de 50 mililitros e agite vigorosamente para misturar, utilizando papel de pH.Confirmou-se que a solução possui pH aproximadamente 7,4. Em seguida, adicionou-se a solução de glicose seis fosfato e ADP e cloreto de magnésio dissolvida em tampão fosfato conforme indicado no protocolo do texto e, novamente, confirmou-se que o pH da solução permanece aproximadamente 7,4. ADICIONE a solução M-M-P-M-S e misture vigorosamente.Isso deve resultar em um homogeneizado vermelho-escuro e claro; envolva a solução com papel alumínio para minimizar a exposição à luz. Se a solução ficar turva, ela deve ser descartada enquanto o banho de óleo está aquecendo. Separadamente, prepare uma solução de nitro azul tetrazólio ou MBT cinco milimolar misturando 0,4 mililitros de dimetilformamida, 0,4 mililitros de etanol anidro e MBT em um tubo de dois mililitros com tampa de anel vedante; feche o tubo parcialmente e aqueça-o até fervura vigorosa no banho de óleo até que o MBT esteja completamente dissolvido.Em seguida, deixe a solução de MBT esfriar até a temperatura ambiente e então adicione-a à mistura de reação OCT. A solução pode mudar de cor, passando do vermelho alaranjado inicial para um vermelho escuro ou roxo ao longo do tempo. Após tratar os animais e preparar cortes congelados conforme indicado no protocolo descrito no texto, construa poços para coloração do tecido utilizando duas arruelas de aço unidas entre si com graxa de silicone ajustada perfeitamente à base da arruela e remova o centro, onde a solução será colocada.Pré-aqueça os cortes de tecido congelados em uma câmara úmida a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, coloque os poços sobre a lâmina para envolver as seções de tecido, adicionando aproximadamente meio mililitro da mistura de coloração de G6PD previamente preparada em cada poço contendo uma seção de tecido, e incube por 45 a 50 minutos. Remova as lâminas da câmara aquecida e retire cuidadosamente os poços de aço inoxidável das lâminas.Coloque as lâminas na borda longa e drene a mistura da reação, seguido por uma lavagem de 30 a 60 minutos com tampão fosfato 100 milimolar. Para remover os últimos vestígios da solução de coloração de G seis PD, enxágue as lâminas com água desionizada por cinco a 10 minutos para remover o tampão fosfato residual. Por fim, selar o tecido adicionando fluoro gel gota a gota sobre a lâmina e seque por 30 minutos para adquirir imagens para análise posterior.Coloque a lâmina em um microscópio óptico e ajuste para ampliação de quatro vezes. Em seguida, tire fotos da seção tecidual corada com uma câmera de 5,0 megapixels para estimar o número total de criptas examinadas. Para cada camundongo, selecione uma seção do nível com a menor área superficial e registre-a com ampliação de 10 vezes.Conte o número de criptas mutantes. De acordo com os seguintes critérios, toda a cripta está isenta de cor azul. A estrutura externa da cripta está intacta.O mutante é observado em cortes adjacentes de sete mícrons, e dois observadores identificam o mesmo cripto como mutante. Conte visualmente o número de criptos nesta seção e multiplique pelo número de níveis analisados para cada cólon. Exemplos de criptos mutantes observados em camundongos tratados com o agente danificador do DNA, azoximetano, podem ser vistos aqui: à esquerda, você vê uma vista vertical ou de cima para baixo de um cripto mutante.Enquanto à direita está uma vista horizontal ou lateral, para que um cripto seja declarado mutante, todas as células dentro do cripto devem permanecer. Criptos brancos com uma pequena quantidade de branco são devidos à produção de muco pelas células caliciformes. A frequência de mutação é calculada como o número de mutantes observados dividido pelo número total de criptos analisados sem mutante.Foram observadas criptas em cólons de camundongos controle, representando uma frequência de mutação inferior a uma vez 10 elevado a menos cinco, enquanto camundongos tratados com azoximetano apresentaram uma frequência de mutação em células-tronco de 4,44 vezes 10 elevado a menos quatro após este procedimento. Outros métodos, como a análise genética do tipo de mutações da glicose-6-fosfato desidrogenase, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma pela qual o agente químico induz erros na codificação de uma mutação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir mutações em células-tronco somáticas em camundongos tratados com compostos potencialmente mutagênicos e carcinogênicos.

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Expressão reduzida / ausente de PMS2 e / ou ERCC1 em criptas inteiro é um evento freqüente dentro de 10 centímetros em cada lado do adenocarcinomas do cólon, provavelmente a base de um defeito de campo com alta mutabilidade ea progressão para o câncer. Deficiência em Ku86 ou CCOI é muito menos freqüente nesses defeitos de campo.

PMS2 deficiente, ERCC1, Ku86, CCOI Defeitos em campo durante a progressão para cancro do cólon

Nós descrevemos um procedimento para a desagregação de câncer colorretal (CRC) para produzir células viáveis ​​única, que são, então, capturado em microarrays de anticorpos personalizado reconhecer antígenos de superfície (CRC DotScan microarray). Sub-populações de células vinculada ao microarray pode ser perfilado por multiplexação de fluorescência usando anticorpos monoclonais marcados com corantes fluorescentes.

Câncer Colorretal Profiling proteína de superfície celular Usando um Microarray de anticorpos e Multiplexação de fluorescência

Descrevemos aqui um ensaio in vivo de mutagénese para pequenos números de células hematopoiéticas purificados utilizando o modelo de ratinho transgénico Lacl. O gene LacI pode ser isolado para determinar a frequência, a localização eo tipo de mutantes de DNA espontaneamente surgido ou após a exposição ao genotoxinas.

A identificação de DNA Mutações em Purificada-Tronco Hematopoéticas / células progenitoras

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de uma instalação experimental para uma análise da avaliação da integridade do DNA em células antes do transplante de células-tronco.

Avaliar a integridade do DNA de células-tronco para terapia celular cardíaca

O kit de DNA de DIAGNÓSTICO apresentado é um método de economia de tempo e fácil de usar para determinar a probabilidade confiável da presença de lesões de câncer colorretal.

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

Este artigo descreve um método para identificar alterações clonais e subclonais entre diferentes espécimes de um determinado paciente. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem em um tipo específico de tumor, a abordagem é amplamente aplicável a outros tumores sólidos.

Análise comparativa de lesões por meio de uma abordagem de sequenciamento direcionada

Apresentado aqui é um protocolo para descobrir os genes condutores superexpressos mantendo as células-tronco de câncer estabelecidas derivadas de células HT29 colorretais. RNAseq com bioinformática disponível foi realizado para investigar e tela redes de expressão genética para elucidar um mecanismo potencial envolvido na sobrevivência de células tumorais direcionadas.

Descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de HT29 derivados do câncer colorretal

Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.

Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon

Este protocolo descreve um método simples e econômico para investigar e quantificar a morte celular em organoides colônicos humanos em resposta a perturbações citotóxicas, como citocinas. A abordagem emprega um corante de morte celular fluorescente (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), microscopia de fluorescência ao vivo e software de análise de imagem de código aberto para quantificar as respostas de um único organoide a estímulos citotóxicos.

Quantificação da morte celular induzida por citocinas em organoides colônicos humanos usando microscopia de fluorescência ao vivo

Aprenda a quantificar mutações somáticas no gene G6PD em células-tronco do cólon de camundongos após exposição a agentes genotóxicos. Este método permite medir a frequência de mutações e avaliar efeitos carcinogênicos.

Quantificação de mutações de células-tronco do cólon

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