Quantificação de mutações de células-tronco do cólon

O objetivo geral deste procedimento é quantificar mutações somáticas fenotípicas no gene glicose seis fosfato desidrogenase ou G seis PD em células-tronco colônicas. Após o tratamento de animais com agentes genotóxicos putativos, isso é feito primeiro tratando os animais com o agente esperando um período de tempo apropriado para permitir que a progênie de uma célula-tronco portadora de uma mutação G seis PD preencha totalmente uma cripta, sacrificando o animal, removendo o cólon e formando-o em um rolo suíço e congelando o tecido em nitrogênio líquido. O segundo passo é preparar seções congeladas de sete mícrons de espessura em lâminas do cólon usando um criostato.

O tecido é aquecido a 37 graus Celsius e, em seguida, poços por coloração de tecido são construídos ao redor das seções de tecido. A etapa final é incubar as seções de tecido com a mistura de coloração G seis PD e, em seguida, analisar as seções sob um microscópio de luz células com G seis PD atividade corar azul, enquanto aquelas com mutações fenotípicas parecem esbranquiçadas. Em última análise, a quantificação de crips mutantes é usada para determinar a frequência de mutação.

Esta técnica mede as mutações somáticas da glicose e seis fosfato desidrogenase em células-tronco, e esta é a população de células críticas na carcinogênese do cólon. Ao identificar mutações em células-tronco somáticas, é possível correlacionar a frequência de mutação com incidentes de câncer de cólon em animais tratados. Embora esse método possa fornecer informações sobre mutações de células-tronco no cólon, ele também pode ser aplicado a outros organismos modelo ou sistemas de órgãos.

Se um nicho de células-tronco puder ser identificado, geralmente os indivíduos novos neste método terão dificuldades com a preparação da solução MBT. Solubilizando. A solução MBT requer atenção cuidadosa às instruções detalhadas. Começar a preparar a solução de coloração histológica a dois mililitros de tampão fosfato pH 7,4 a 35 mililitros de temperatura ideal de corte, ou meio OCT em um tubo de 50 mililitros e agitar vigorosamente para combinar usando papel de pH.

Confirmado que a solução tem aproximadamente pH 7,4. Em seguida, em glicose seis fosfato e uma solução de DP e cloreto de magnésio dissolvidos em tampão fosfato, conforme indicado no protocolo de texto e, novamente, confirmou que o pH da solução permanece em aproximadamente 7,4. ADICIONAR A SOLUÇÃO M-M-P-M-S e homogeneizar.

Isso deve resultar em um homogeneizado vermelho escuro claro que envolve a solução em papel alumínio para minimizar a exposição à luz. Se a solução ficar turva, ela deve ser descartada durante o aquecimento de um banho de óleo. Separadamente, prepare uma solução de cinco milimolares nitro azul para teraz oleum ou MBT misturando 0,4 mililitros de dimetilformamida, 0,4 mililitros de etanol anidro e MBT em um tubo de dois mililitros com uma tampa de O-ring, feche frouxamente o tubo e leve-o a uma fervura vigorosa no banho de óleo até que o MBT seja dissolvido.

Em seguida, deixe a solução MBT esfriar até a temperatura ambiente e, em seguida, adicione-a à mistura de reação OCT. A solução pode mudar de cor do vermelho laranja inicial para um vermelho escuro ou roxo com o tempo. Depois de tratar os animais e preparar os cortes congelados conforme indicado no protocolo de texto, construir poços para coloração de tecido usando duas arruelas de aço coladas com graxa de silicone encaixar parfum na base da arruela e cortar o centro onde a solução será colocada substituída.

Antes da guerra, o tecido congelado desliza em uma sala úmida de 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, coloque os poços na lâmina para envolver as seções de tecido em aproximadamente meio mililitro da mistura de coloração G seis PD previamente preparada para cada poço de seção de tecido e incube por 45 a 50 minutos. Remova as lâminas da sala quente e remova cuidadosamente os poços de aço inoxidável das lâminas.

Coloque as lâminas na borda longa e escorra a mistura de mistura de reação, seguida de uma lavagem de 30 a 60 minutos e tampão fosfato 100 milimolar. Para remover os traços finais da solução de coloração G six PD, enxágue as lâminas e a água deionizada por cinco a 10 minutos para remover o tampão fosfato residual. Por fim, sele o tecido adicionando gel de flúor gota a gota à lâmina e seque por 30 minutos para adquirir imagens para análise posterior.

Coloque a lâmina em um microscópio óptico e ajuste para quatro ampliações DX. Em seguida, tire fotos da seção de tecido manchado com uma câmera de 5,0 megapixels para estimar o número total de criptas examinadas. Para cada mouse, selecione uma seção do nível com a menor área de superfície e visualize-a com ampliação de 10x.

Conte o número de crips mutantes. De acordo com os seguintes critérios, toda a cripta é desprovida de cor azul. A estrutura externa da cripta está intacta.

O mutante é observado em seções adjacentes de sete mícrons e dois observadores identificam a mesma cripta como mutante. Conte visualmente o número de criptas nesta seção e multiplique pelo número de níveis selecionados para cada dois pontos. Exemplos de Crips mutantes observados em camundongos tratados com o agente prejudicial ao DNA, azoximetano, podem ser vistos aqui à esquerda, você vê uma visão vertical ou de cima para baixo de uma cripta mutante.

Enquanto à direita está uma vista horizontal ou lateral, para que uma cripta seja declarada mutante, todas as células dentro da cripta devem permanecer. Criptas brancas com uma pequena quantidade de branco são devidas à produção de muco das células caliciformes. A frequência de mutação é calculada como o número de mutantes observados dividido pelo número total de criptas rastreadas sem mutante.

Crips foram observados em cólons de camundongos de controle representando uma frequência de mutação inferior a um vezes 10 elevado a menos quinto, enquanto camundongos tratados com azoximetano mostraram uma frequência de mutação de células-tronco de 4,44 vezes 10 elevado a menos quatro Após este procedimento. Outros métodos, como a análise genética do tipo de mutações glicose x fosfato desidrogenase, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a forma como o agente químico codifica erroneamente uma mutação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir mutações de células-tronco somáticas em camundongos tratados com potenciais compostos mutagênicos e cancerígenos.