Name: Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco neurais da zona subventricular de camundongos adultos usando FACS e imagem ao vivo com tecnologia FUCCI. Este método permite estudar a progressão do ciclo celular em neurogênese.

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Somos gratos a C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet e todos os funcionários de instalações para animais; a J e N Baijer Dechamps para separação de células; O. Etienne para a assistência técnica, e A. Gouret por sua assistência administrativa. Citometria de fluxo e separação de células foram realizadas no Citometria de Fluxo de recursos partilhada IRCM, criada por doações de equipamentos de DIM-Stem-Pôle, INSERM, Fondation ARC, e CEA. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Electricité de France (EDF). MD tem uma bolsa da La Ligue Contre le Câncer e LM da região Ile-de-France (DIM bioterapias). Marc-André Mouthon e François D. Boussin autoria partes co-sênior.

Este protocolo foi concebido em conformidade com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias do 24 de novembro de 1986 (86/609 / CEE) e foi aprovado pelo nosso bem-estar animal comitê institucional (CETEA-CEA DSV IDF). 1. Configuração básica Antes de Cultura e Videomicroscopia <ol><li> Utilizar placas de cultura de vidro de fundo ou u-Placas por microscopia confocal de vídeo. Para 1 - 5 x 10 3 células / poço, utilizar placas de 96 poços e as placas de 24 poços para mais do que 5 x 10 3 células / poço. </li><li> Pelo menos um dia antes de se iniciar o experimento, preparar estéril poli-D-lisina (PDL) placas revestidas para culturas em monocamada aderente. Adicionar suficiente PDL (10 ug / ml em dH2O) para revestir o fundo de cada poço e incubar O / N a 37 ° C. Remover a solução de PDL e lavar três vezes com dH2O antes de permitir que a placa secar ao capuz durante pelo menos 2 horas, sob um fluxo laminar. Se não for utilizado imediatamente, armazenar a placa revestida em-20 ° C. </li><li> Prepare meio de cultura por mistura NSC Meio Basal e NSC Proliferação suplemento a uma 9: 1 (ver tabela de materiais) juntamente com 2 ug / ml de heparina, 20 ng / fator ml humana purificada de crescimento epidérmico recombinante (EGF), e 10 ng / mL factor de crescimento de fibroblastos recombinante humano 2 (FGF-2). Aquecer o meio de cultura a 37 ° C num banho de água antes da utilização. </li><li> Para a dissociação SVZ, preparar a solução de papaína: 1 mg / mL de papaína (15 IU / ml) no equilíbrio de sal da solução de Earl (EBSS) contendo 0,2 mg / ml de L-cisteína, 0,2 mg / ml de EDTA e 0,01 mg / ml de DNase I em PBS. Esterilizar a solução por passagem através de um filtro de 0,2 um. Equilibrar a solução a 37 ° C antes da utilização. </li><li> Para parar a reacção enzimática, preparar uma solução de inibidor de protease (ovomucoide): F12 contendo 0,7 mg / ml de inibidor de tripsina de tipo II: DMEM. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 um. </li><li> Prepare PBS 0,6% solução de glicose para recolher os cérebros e PBS 0,15% BSA sOlution para as etapas de lavagem e para a coloração de anticorpos. </li><li> Preparar as ferramentas de dissecação: tesoura, dissecando e amarrando fórceps, bisturi. Mergulhe-os em etanol a 70%. </li></ol> 2. A colheita de rato adulto Brains e SVZ microdissecações <ol><li> Sacrifício adulto FUCCI ratos 23 (2 a 3 meses de idade e / ou 12 meses de idade, para o envelhecimento estudos) realizar um deslocamento cervical, de acordo com as diretrizes institucionais adequadas. </li><li> Pulverizar o mouse usando 70% de etanol e cortar a cabeça usando uma tesoura afiada. </li><li> Realizar uma incisão ao longo do couro cabeludo para revelar o crânio. </li><li> Realizar um corte longitudinal mediana começando na base do crânio para os bulbos olfatórios usando um pequeno par de tesouras. Certifique-se de não danificar o cérebro subjacente com as lâminas da tesoura. Remova a parte superior aberta do crânio com uma pinça curva para expor o cérebro. </li><li> Recolhe-se o cérebro em uma placa de Petri 15 mm contendo 0,6% de glucose em PBS. </li><li> Dissect afastado os bulbos olfatórios. Coloque o cérebro em sua superfície dorsal e fazer uma secção coronal através do quiasma utilizando um bisturi. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, posicione a parte rostral da seção do cérebro com a superfície coronal corte virado para cima em direção ao experimentador. </li><li> Para dissecar o SVZ, remover o septo com uma pinça fina curvas em seguida, insira uma ponta de uma pinça fina para o corpo estriado imediatamente adjacente ao ventrículo e retire o SVZ do tecido circundante. Para obter detalhes adicionais, consulte Azari et al. 24. Coloque a SVZ dissecado em uma placa de Petri contendo 1 ml de PBS-0,6% de glucose. </li></ol> 3. SVZ dissociação Tissue <ol><li> Picar o SVZ dissecado na placa de Petri até que não haja grandes pedaços permanecem. </li><li> Transferir o tecido moído, juntamente com a% de glucose PBS-0,6 a um tubo de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de papaína pré-aquecido (1mg / ml, preparado no passo 1.4) suplementado com 0,01 mg / ml de DNase I. incubar durante 10 min num banho de água a 37 ° C. Use 1 mL de papaína por mouse. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1 ml de pré-aquecido ovomucóide (0,7 mg / ml, preparado no passo 1.5) para parar a actividade de papaina. Mecanicamente dissociar o tecido picada ainda mais em uma suspensão de uma única célula cuidado pipetando para cima e para baixo 20 vezes por meio de uma ponta P1000 micropipeta. Evitar bolhas de ar. </li><li> Passar a suspensão de células através de um filtro estéril de 20 um de um novo tubo de 15 ml. Certifique-se de lavar o filtro de células com PBS 0,15% BSA para evitar a perda de células. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 10 min e desprezar o sobrenadante. Re-suspender as células em 100 ul de PBS contendo 0,15% de BSA. </li></ol> 4. coloração de imunofluorescência para classificação celular Para separação de células usando FUCCI-Red ratos (Figura 2A), use o seguinteanticorpos: CD24 ficoeritrina-cyanine7 conjugadas [PC7]; CD15 / LeX isotiocianato de fluoresceína [FITC] conjugado e conjugado de ligando de EGF Ax647. Nota: células LeX + EGFR + e células EGFR + não são abundantes na SVZ adulto: ≈ 600 e 1500 células / rato, respectivamente 9. Recomendamos pooling células SVZ de 2 a 3 ratos para ter material suficiente. Não trabalhe com mais de 12 ratos no mesmo dia, de modo que a duração de triagem de células não exceda 3 hr. Tenha em atenção que o trabalho com muitos ratos no mesmo dia conduzirá a um aumento da duração da separação de células, possivelmente, resultando num aumento da morte celular e / ou diferenciação celular. <ol><li> Realizar a coloração de FACS em 100 ul de PBS, 0,15% de BSA por ratinho (ou em 200 ul de um grupo de 2 a 3 ratos para coloração óptima). </li><li> Preparar os tubos de controlo. Utilize esferas de compensação para preparar tubos de controle de cores individuais de acordo com o fabricante9; s protocolo. Selecione uma fração de células (1/10 das células extraídas de um ratinho é suficiente) e separá-lo em 4 tubos para preparar um tubo de controle negativo (células não marcadas) e 3 fluorescência menos um (FMO) tubos de controlo. Ressuspender as células em 200 ul de PBS, 0,15% de BSA por tubo. Dica: Para o controle LeX-FITC FMO, rotular as células com CD24-PC7 (1:50) e Ax647 conjugado ligando EGF (1: 200); para o controle de CD24-PC7 FMO, rotular as células com CD15 / Lex-FITC (1:50) e Ax647 conjugado ligando EGF (1: 200) e para Ax647 conjugado de controle de FMO EGF ligando, rotular as células com CD15 / LeX- FITC (1:50) e CD24-PC7 (1:50). </li><li> Para os tubos utilizados para separação de células, use as seguintes anticorpos na diluição indicada em PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15 / Lex-FITC (1:50) e ligando EGF Ax647 conjugada (1: 200). </li><li> Incubar durante 20 min a 4 ° C no escuro. Lava-se com 1 ml de PBS 0,15% de BSA e centrifugar a 200 xg durante 10 min. Volte a suspender as células em 20081; l de PBS 0,15% de BSA por cérebro. Mantenha os tubos de separação de células em gelo e proceder de imediato à separação de células. </li><li> Se utilizando camundongos FUCCI-Verde, frações LeX-positivos e negativos LeX separados usando colunas de separação antes de separação de células como as ações de anticorpos LeX-FITC o mesmo comprimento de onda de emissão de fluorescência FUCCI-verde (Figura 3A, B). <ol><li> Em primeiro lugar, marcar as células com um anticorpo de ratinho anti-humano LEX-anticorpo (1:50) durante 15 minutos a 4 ° C no escuro em 100 ul de PBS, 0,15% de BSA. </li><li> Lavam-se as células com 1 ml de PBS 0,15% de BSA e centrifugar a 200 xg durante 10 min, em seguida, marcar as células com microesferas de IgM anti-ratinho (1:10) durante 15 minutos a 4 ° C no escuro. </li><li> Lavam-se as células com 1 ml de PBS 0,15% de BSA e centrifugar a 200 xg durante 10 min. Ressuspender as células em 500 ul de PBS 0,15% de BSA e despeje as células através de uma coluna de separação no campo magnético, como esquematizado na Figura 3 C. Lavou-se a coluna com 1 ml de PBS 0,15% de BSA para obter fração negativa LeX. </li><li> Para se obter a fracção LEX-positiva, remover a coluna de separação a partir do campo magnético e eluir as células com 2 ml de PBS 0,15% de BSA. </li><li> Avance para o CD24-PC7 e Ax647 conjugado coloração EGF ligante, tal como indicado no ponto 4.2. </li></ol> </li></ol> 5. celular Seleção Nota: As células foram classificadas em um classificador FACS a 40 psi com uma 86 mm noozle. Fluorescência foram obtidos utilizando o seguinte conjunto de filtros: 520 / 35nm (ITCF), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) e 740LP (PC7). A compensação é necessária para evitar sinais de falso-positivos como é encontrada uma sobreposição entre os espectros de emissão de fluorescência FUCCI-vermelho e do corante PC7. <ol><li> Imediatamente antes da separação de células, adicionar um corante vital para discriminar ao vivo a partir de células mortas. Usamos HO (ver tabela de materiais) na proporção de 2 ug / ml de concentração final. Execute o tubo de controle negativo (células não marcadas), através do classificador FACS e selecione thcélulas e usando dispersão para a frente (FSC) parâmetros (Figura 1A) dispersão lateral (SSC) e. NOTA: As células mortas foram excluídos por gating apenas a fracção HO-negativo (Figura 1A) e, em seguida, doublets foram excluídos selecionando a largura de pulso fração negativa (Figura 1A &#39;&#39;). </li><li> Execute os controles de cor individuais preparadas no passo 4.2 e ajustar o tubo fotomultiplicador (PMT) tensões (escala de células ou seja população negativa muito alta e / ou positivos off), se necessário. Execute a compensação de cor na janela de compensação do software. </li><li> Run FMO controla preparada no passo 4.2 (controle FMO LeX-FITC, CD24-PC7 controle FMO e Ax647 conjugado controle FMO EGF ligante) e desenhe os portões de classificação (Figura 1). Ordenar as células diretamente em 100 ul de meio de cultura em 1,5 ml microtubos. </li></ol> 6. Preparação das células para microscopia <ol><li> Placa da célula recém-classificadass a uma densidade de 1 - 3 x 10 3 células / poço de poli-D-lisina- revestido de 96 poços μ placa com 300 ul de meio de cultura. </li><li> Antes de microscopia de vídeo, incubar as placas de cultura a 37 ° C e 5% de CO2 pelo menos durante 1 hora para permitir a adesão celular. </li></ol> 7. Configuração do microscópio e Aquisição de Imagem <ol><li> Realizar imagem ao vivo utilizando uma objectiva de 20x Plano Apo VC DIC (NA: 0,75) num sistema de microscópio confocal de varrimento laser ligado a uma câmara invertida termostatizada a 37 ° C sob 5% de atmosfera de CO2. </li><li> Posicionar a 96 μ bem-placa no interior da câmara termostatizada pré-aquecido e equilibrou-se e substituir a tampa por uma cobertura termostatizada. </li><li> Abra o software NIS-Elements e clique na barra de menu em &quot;Adquirir / Aquisição controla / aquisição ND&quot; para selecionar as opções do time-lapse (comprimento, posições de palco, confocal z-seções, ...), &quot;Acquire / controles de Aquisição / Pad Ti221; para selecionar os objetivos e &quot;Acquire / controles Aquisições / A1plus Configurações&quot; para selecionar o nível de PMT para cada fluorescência na barra de menu. Selecione uma pasta para guardar os arquivos de dados. </li><li> Usando a janela de aquisição da ND, situado no centro de cada bem como uma posição de estágio e selecionar a opção de grande imagem para 7 x 7 mm². Isto vai criar uma imagem em mosaico em torno do centro de cada poço. Definir a sobreposição para a grande imagem de mosaico a 5%. Tirar fotos a cada 20 min durante 24 horas. Selecione o objectivo Plano de Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) na janela de Ti Pad. </li><li> Na janela de configurações A1plus, adquirir imagens de scanner de ressonância usando alta velocidade com um formato de 512 x 512 pixels com uma resolução de 1,26 mm / pixel. Use de campo claro de visualizar formas celulares. No caso de ratinhos FUCCI-vermelhos, excita a fluorescência vermelha em 561 nm e recolher utilizando um filtro 595/50 nm. No caso de ratinhos FUCCI-verde, excita a fluorescência verde a 488 nm e recolher utilizando um filtro 530/40 nm. Determinar a PM idealNível T, offset e potência do laser para cada comprimento de onda. NOTA: Recomendamos a utilização da função de focagem automática para o canal brightfield para permitir que o software para a focagem automática em cada posição de estágio antes de cada aquisição. Dica: Um objectivo Plano de Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) foi utilizado para a sua excelente resolução, sem a necessidade de petróleo. Outros objectivos podem ser usadas, dependendo da resolução óptica desejada. </li><li> Selecione a opção &quot;Executar agora&quot; botão na janela de aquisição do ND para começar a aquisição. Dica: Siga o trabalho do computador para um loop para ter certeza de que tudo no funcionando corretamente. </li></ol> 8. Processamento de Imagem e Análise <ol><li> Analisar os dados diretamente no software NIS-Elements, acompanhando as células individualmente. Dica: Para ganhar tempo, economizar cada posição em formato .avi usando o software NIS-Elements e analisar os filmes com ImageJ. </li><li> No software ImageJ, rastrear células individuais submetidos a, pelo menos, 2 divisões (isto é, uma célula parauma colónia de quatro células). Cortar uma pequena área ao redor da célula e selecione &quot;Imagem / Duplicate &#39;. </li><li> Selecione &#39;Imagem / Pilhas / Faça Montage&#39; na barra de menu para fazer uma montagem. Especifique os quadros a serem incluídos, o tamanho das imagens e salvar a montagem como um arquivo .tif para resolução ideal. </li><li> Para calcular a primeira SG 2 / M comprimento fase (Figura 2C, D), selecionar uma única célula fluorescente vermelha (em G 1) e, em seguida, definir t = 0 (fase S começará assim que o vermelho-fluorescência desliga). Contar o número de quadros até que a célula se divide para estimar o comprimento SG 2 / M. NOTA: O tempo calculado depende do intervalo de tempo entre cada quadro. </li><li> Para calcular a seguinte fase G1 (Figura 2C, D), continuar a acompanhar a célula que apenas dividido. Se a célula entra na fase G1 dividido, haverá uma acumulação de proteína fluorescente vermelha-CDT1. Calcule o número de quadros até vermelho-fluorescência desliga agapor cada célula. Sugestão: No início de 1 L a fluorescência vermelha pode ser tão fraco escolher o início da fase G1 na armação, onde a célula tem dividido para evitar aproximações. </li></ol>

<ol><li>Morshead, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).</li>
<li>Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+astrocytes+are+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain.</a> Cell. 97, 703-716 (1999).</li>
<li>Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+migration+of+neuronal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chain migration of neuronal precursors.</a> Science. 271, 978-981 (1996).</li>
<li>Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+bridge+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells bridge their niche.</a> Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).</li>
<li>Rietze, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+pluripotent+neural+stem+cell+from+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain.</a> Nature. 412, 736-739 (2001).</li>
<li>Fischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+adult+neural+stem+cells+from+the+mouse+subependymal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone.</a> Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).</li>
<li>Daynac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+neural+stem+cells+exit+dormancy+upon+alteration+of+GABAAR+signaling+following+radiation+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage.</a> Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).</li>
<li>Codega, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+and+purification+of+quiescent+adult+neural+stem+cells+from+their+in+vivo+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche.</a> Neuron. 82, 545-559 (2014).</li>
<li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+functionally+distinct+stem+cells+and+neurosphere-initiating+cells+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain.</a> Elife. 3, e02669(2014).</li>
<li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LeX+ssea+1+is+expressed+by+adult+mouse+CNS+stem+cells+identifying+them+as+nonependymal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal.</a> Neuron. 35, 865-875 (2002).</li>
<li>Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mCD24+expression+in+the+developing+mouse+brain+and+in+zones+of+secondary+neurogenesis+in+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult.</a> Neuroscience. 73, 581-594 (1996).</li>
<li>Pineda, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+derived+TGF-beta+increases+in+the+stem+cell+niche+and+perturbs+neurogenesis+during+aging+and+following+irradiation+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain.</a> EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).</li>
<li>Lugert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+and+active+hippocampal+neural+stem+cells+with+distinct+morphologies+respond+selectively+to+physiological+and+pathological+stimuli+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging.</a> Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).</li>
<li>Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+increases+neural+stem+cell+number+in+a+growth+hormone+dependent+manner++augmenting+the+regenerative+response+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice.</a> Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).</li>
<li>Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+the+subventricular+zone+neural+stem+cell+niche+evidence+for+quiescence+associated+changes+between+early+and+mid+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood.</a> Neuroscience. 173, 135-149 (2011).</li>
<li>Enwere, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+results+in+reduced+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+diminished+olfactory+neurogenesis+and+deficits+in+fine+olfactory+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).</li>
<li>Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+detection+characterization+and+age+related+changes+in+the+subventricular+zone+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).</li>
<li>Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+alpha+null+and+senescent+mice+show+decreased+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+forebrain+subependyma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).</li>
<li>Costa, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+division+and+lineage+progression+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro.</a> Development. 138, 1057-1068 (2011).</li>
<li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+and+lineage+progression+of+neural+progenitors+in+the+ventricular-subventricular+zones+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).</li>
<li>Sakaue Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).</li>
<li>Daynac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+lengthens+the+G1+phase+of+stem+cells+in+aged+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain.</a> Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).</li>
<li>Roccio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+stem+cell+fate+changes+by+differential+cell+cycle+progression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns.</a> Development. 140, 459-470 (2013).</li>
<li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mouse+two+cultures+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , e51225(2014).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres+re+evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open+a+critical+review+of+sphere+formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).</li>
<li>Spella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Licensing+regulators+Geminin+and+Cdt1+identify+progenitor+cells+of+the+mouse+CNS+in+a+specific+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle.</a> Neuroscience. 147, 373-387 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter conflito de interesses.

A técnica de separação de células aqui descrito permite a discriminação fiável entre NSCs quiescentes, NSCs ativados e os seus estudos de progênies permitindo às suas propriedades e dinâmicas no cérebro adulto 9. Juntamente com a tecnologia FUCCI que permite a visualização da progressão do ciclo celular em células vivas 23, foi desenvolvida uma técnica rápida e eficiente para seguir os L 1 e SG 2 / M fases do ciclo celular a partir de células jovens e adultos do cérebro do rato com idade. A técnica de separação de células utilizadas no presente protocolo foi o primeiro validado combinação de marcadores que permitem a purificação das cinco principais populações neurogénicos do SVZ 9. Foi também a primeira técnica validada permitindo a distinção de NSCs quiescentes e ativadas. É interessante notar que esta técnica não exige a utilização de ratinhos transgénicos, por si só, o que é necessário quando adaptada para modelos de ratinhos transgénicos such como FUCCI. Desde então, codega et al. 10 usaram uma combinação marcação tripla GFAP-GFP / CD133 / EGFR para distinguir as NSC quiescentes de sua contraparte activada, mas não podem ser adaptados para a tecnologia FUCCI uma vez que requer a utilização de ratinhos transgénicos GFAP-GFP. Mich et al. 11 desenvolveram um / EGFR CD24 estratégia de rotulagem Glast / triplo que compartilha resultados comuns com a técnica utilizada neste estudo 9. Na verdade, uma alta correlação entre Lex e marcadores Glast NSCs já foi observada em Daynac et al. 9 estudar. No entanto, o anticorpo utilizado Glast na técnica Mich et ai. É acoplado a ficoeritrina e, portanto, não pode ser adaptada com a utilização de ratos FUCCI-vermelhos. Há vários pontos técnicos importantes que requerem atenção antes de classificar células SVZ. Em primeiro lugar, o passo de dissociação é muito importante como o tecido cerebral tem de ser dissociado em células individuais, embora preservando a estrutura emTegrity das proteínas utilizados para a estratégia de marcação de anticorpos. 0,05% de tripsina-EDTA demonstrou ser muito eficaz na distinção entre tecido SVZ 27, mas o antigénio LeX foi encontrado para ser altamente sensíveis uma vez que quase todos LEX-FITC imunofluorescência foi perdido (dados não mostrados). Assim, papaína foi utilizado como foi mais eficiente e menos destrutiva do que outras proteases no tecido cerebral. Além disso, nem LeX nem EGFR nem CD24 foram afetados pelo tratamento papaína. Deve-se notar que a marcação com anticorpos foi alterada se o tratamento com papaína excedeu 15 min. Nós obtivemos ótimos resultados com um tratamento de papaína 10 min associada a uma dissociação mecânica (pipeta cima e para baixo 20 vezes). O revestimento com poli-D-lisina permite a cultura de células aderentes e a formação de colónias após vários dias em cultura. É agora amplamente aceito que em ensaios in vitro vem com suas limitações 28,29. Recomendamos que determinam apenas o primeiro ciclo celular paraas células submetidas a pelo menos uma subsequente divisão para permanecer tão próximo quanto possível para o fenótipo da célula in vivo. É importante mencionar que as proteínas geminin (fluorescência verde) e CDT1 (fluorescência vermelha) usado para projetar o sistema FUCCI 23 foram previamente mostrado para ser abundantemente expresso por progenitores neurais durante a neurogênese no início de ratos 30 e no cérebro adulto tecidos 9,25 . Embora o mKO2-hCdt1 (30/120) constructo foi usado, principalmente, no presente estudo a acompanhar a fase G1 com fluorescência vermelha, o uso de ambas as construções [mKO2-hCdt1 (30/120) e MAG-hGem (1/110) ] poderia ser prevista para permitir a visualização das fases principais do ciclo celular (L 1 e SG 2 / H), bem como a G 1 / S de transição 23. A principal desvantagem da imagem de dupla-cor é os conjuntos compatíveis limitadas de fluorescência que ainda podem ser utilizados para a rotulagem de células. Uma solução é a utilização de separatiem colunas. Por exemplo, temos esgotado com sucesso a fracção CD24-positivas a partir de células usando colunas de separação antes de separação de células e live-imagiologia como foi utilizado um anticorpo CD24-PE que compartilhavam o mesmo comprimento de onda de emissão de fluorescência FUCCI-Red 25. Poucos estudos têm investigado a duração do ciclo celular das populações rato SVZ adultos. O comprimento total do ciclo celular obtidas com a nossa técnica é próxima da estimativa in vitro por Costa et al. 21, mas não foi capaz, pela primeira vez para distinguir as diferentes fases do ciclo celular. Num estudo in vivo, Ponti et al. 22 usado a incorporação de análogos da timidina para determinar a dinâmica de proliferação das diferentes populações de células de SVZ. No entanto, não podiam realizar uma monitorização contínua do ciclo celular nem rastrear as células ao nível de uma única célula. Este poderia ser um problema, uma vez que foi demonstrado que uma forte heterogeneidade existe sagacidadehin uma determinada população de células SVZ 22,25. Nós descrevemos aqui uma alternativa técnica in vitro, fácil de configurar, que permite a imagens ao vivo das fases do ciclo celular de diferentes populações adultas neurogênicas em um nível de uma única célula. Entendendo a regulação do ciclo celular de células-tronco neurais e progenitores continua sendo um desafio para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas no contexto do envelhecimento do cérebro ou patologias. Nosso protocolo pode, assim, ter uma ampla gama de aplicações. No contexto do envelhecimento, essa técnica também poderia ser útil para compreender os efeitos do envelhecimento sobre a diferenciação NSC. De fato, é possível identificar células-tronco / progenitoras neurais que entram diferenciação como a sua intensidade de fluorescência vermelha é distintamente mais elevada 26. Finalmente, pode também ser de interesse para explorar a imagem ao vivo contínuo a um nível de uma única célula para estudar processos celulares a intrínsecos e extrínsecos responsáveis ​​pela linhagem próprogressão de NSCs adultas.

Células-tronco neurais quiescentes (NCCC) são a fonte para a neurogênese adulta 1 e pode converter em seu proliferativa &quot;ativado&quot; formulário expressando EGFR (aNSCs) 2. Uma vez ativado, eles dão origem a células de trânsito amplificando (TAC) 3 e, em seguida neuroblastos que migram para os bulbos olfatórios (OB) através de um tubo de astrócitos e, finalmente, diferenciam em neurônios 4,5. NSC e sua progênie são organizados em &quot;nichos&quot; especializados arquiteturas ao longo dos ventrículos laterais, implicando uma miríade de fatores que controlam a sua proliferação 6. O isolamento e purificação de células neurogénicos SVZ é necessário iluminar a regulação molecular do complexo a sua proliferação, mas mantiveram-se um desafio por um longo período de tempo, devido à ausência de marcadores específicos e técnicas adequadas. Novas abordagens utilizando citometria de fluxo tornaram possível o isolamento de NSCs e their progênie do adulto SVZ 2,7-11. Usando o marcador de células estaminais LeX 12 juntamente com neuroblastos marcador CD24 13 e um FEG fluorescência para rotular o EGFR em células em proliferação 2, que recentemente desenvolveu uma estratégia de FACS permitindo a purificação de cinco dos principais SVZ populações neurogénicos: quiescentes e activados NSC, TAC, imaturos, bem como migrando neuroblasts 9. Aqui, descrevemos em detalhes esta célula triagem técnica e como uma lex / EGFR / CD24 coloração tripla permitido pela primeira vez o isolamento de ambos os NSCs quiescentes e ativadas. Embora a neurogênese persistir durante a idade adulta, a produção de novos neurônios diminui drasticamente no envelhecimento cerebral 14. A maioria dos estudos concordam com uma redução progressiva do número de proliferação de células progenitoras no SGZ e SVZ 15-20. As conseqüências não são inócuos como o declínio relativo à idade na neurogênese no SVZ provoca uma diminuição de nneurônios ewborn nos bulbos olfatórios do cérebro envelhecido, levando a prejuízo na discriminação olfativa em camundongos com idade entre 18. Elucidar cinética do ciclo celular de células progenitoras neurais é um passo fundamental para compreender os mecanismos subjacentes à evolução da neurogênese adulta durante o envelhecimento. Estudos recentes investigaram a do ciclo celular e na progressão linhagem de células estaminais neuronais adultas in vitro 21 e in vivo 22, mas nenhum deles teve vantagem de separação de células técnicas e geneticamente codificados sondas do ciclo celular fluorescentes para visualizar as fases do ciclo celular de células isoladas a um nível de uma única célula. Aqui, descrevemos um protocolo que tira proveito dos ratinhos transgénicos FUCCI em que as células são fluorescentes durante o seu ciclo de célula, permitindo a distinção entre G 1 e SG 2 / H 23 fases. Este protocolo mostra o isolamento como prospectivo de NSC e sua progênie de adulto FUCCI mice combinada com microscopia de lapso de tempo vídeo permite o estudo da dinâmica do ciclo celular em um nível de uma única célula.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultura de fundo de vidro não revestido de 96 poços&nbsp;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P96G-1.5-5-F</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Placas de 96 poços</td><td>Ibidi</td><td>89626</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina</td><td>Millipore</td><td>A003E</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult NSC Basal Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5700</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult NSC Suplemento de Proliferação&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5701</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore</td><td>GF144</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C-7352</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Promega</td><td>V4231</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Tipo de inibidor de tripsina II</td><td>Sigma</td><td>T9128</td><td>Ovomucoid</td></tr><tr><td>DMEM: F12 médio</td><td>Life Technologies</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; Filtro M&nbsp;</td><td>BD Medimachine Filcon</td><td>340622</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microtubos 3810X</td><td>Sigma</td><td>Z606340-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td>Solução de albumina de soro bovino</td></tr><tr><td>CD24 conjugado ficoeritrina-cianina7 [PC7]</td><td>Life Technologies</td><td>A14776</td><td>Mouse IgM; clone MMA. 1:50</td></tr><tr><td>CD15/LeX isotiocianato de fluoresceína [FITC] - conjugado</td><td>BD Biosciences</td><td>332778</td><td>Rato IgG2b; clone M1/69.&nbsp; 1:50</td></tr><tr><td>Camundongo anti-humano LeX anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>559045</td><td>Camundongo IgM; clone MAM.&nbsp; 1:50</td></tr><tr><td>Alexa647 - ligante EGF conjugado</td><td>Life Technologies</td><td>E35351</td><td>1:200; Ligante EGF conjugado com Ax647 no texto</td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD Biosciences</td><td>644204</td><td></td></tr><tr><td>colunas de separação MACS LS&nbsp;</td>Colunas de separação <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>(no manuscrito)</td></tr><tr><td>Microesferas IgM anti-rato&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-047-301</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>861405</td><td>HO (no manuscrito)</td></tr><tr><td>Classificador de células INFLUX</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Classificador FACS (no texto)</td></tr><tr><td>Sistema de microscópio confocal de varredura a laser Nikon A1R conectado a um ECLIPSE Ti invertido</td><td>Nikon Corp.</td><td></td><td>microscópio confocal de varredura a laser (no manuscrito)</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR.4.13.01 software de 64 bits</td><td>Nikon Corp.</td><td></td><td>Software NIS-Elements (no manuscrito)</td></tr><tr><td>Objetiva Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75)</td><td>Nikon Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara termostatizada ECLIPSE Ti</td><td>Nikon Corp.</td><td></td><td>câmara termostatizada (no manuscrito)</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>RBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Ashland, OU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>camundongos FUCCI</td><td>RIKEN BioResource Center, JAPÃO</td><td></td><td>Sakaue-Sawano et al. 2008</td></tr></tbody></table>

seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular zone e live-imagem de seus dynamics com o ciclo celular

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

As células estaminais neurais (NCCC) na zona subventricular dos ventrículos laterais (SVZ) sustentar neurogénese olfactiva durante toda a vida no cérebro de mamíferos. Eles geram sucessivamente células de trânsito amplificando (TAC) e neuroblasts que se diferenciam em neurônios, uma vez que integram os bulbos olfatórios. Emergindo de células activadas fluorescentes (FACS) técnicas permitiram o isolamento de NSCs, bem como seus descendentes e já começaram a lançar luz sobre redes de regulação de genes em nichos neurogênicos adultos. Descrevemos aqui uma separação de células técnica que permite distinguir a seguir e a dinâmica do ciclo celular das populações de células acima mencionados a partir do SVZ adulto com uma lex / EGFR / CD24 coloração tripla. Células isoladas são então banhado como células aderentes para explorar em detalhes a sua progressão do ciclo celular por microscopia de lapso de tempo vídeo. Para este fim, usamos transgénico indicador do ciclo celular de fluorescência Ubiquinação (FUCCI) ratinhos em que as células são vermelho fluorescente durang G 1 fase devido a uma G 1 específico repórter vermelho-CDT1. Este método revelou recentemente que NSC proliferação alongar progressivamente a sua fase G 1 durante o envelhecimento, levando a prejuízo neurogênese. Este método é facilmente transponível para outros sistemas e poderiam ser de grande interesse para o estudo da dinâmica do ciclo celular de células do cérebro, no contexto de patologias cerebrais.

A capacidade de discriminar de forma confiável entre as diferentes populações de células do rato adulto linhagem de células-tronco SVZ é primordial para investigar suas propriedades funcionais. Para esse efeito, temos desenvolvido uma LeX / EGFR / CD24 estratégia de rotulagem triplo permitindo a purificação de populações específicas de células de SVZ adulto: NSCs repouso (LeX brilhantes), NSCs ativados (LeX + EGFR +), TAC (EGFR +) , neuroblastos imaturos e migram (CD24 + CD24 + e EGFR +, respectivamente) 9 (Figura 1). Aplicado para ratinhos transgénicos FUCCI, a separação de células técnica permite a imagens ao vivo das fases do ciclo celular das diferentes populações neurogénicos ao nível de uma única célula 25. Camundongos FUCCI-vermelhos foram usados ​​para acompanhar a fase G 1 com microscopia de fluorescência vermelha usando vídeo time-lapse (Figura 2A). Células neg FUCCI-vermelhos representam as células em S-G 2 / M fases do ciclo celular, as células pos-vermelhos são FUCCI G 1 e células brilhantes FUCCI-vermelhos são células que saem ou para fora do ciclo celular (Figura 2B) 23,26. EGFR + de células jovens adulto (Figura 2C) e ratinhos de meia idade (Figura 2D) LeX + + e EGFR foram plaqueadas como células aderentes nas placas de cultura revestidas com poli-D-lisina. O primeiro SG 2 / H de fase foi identificada em células individuais uma vez que a fluorescência vermelha desliga-se até que a célula se divide. Como observado anteriormente, o SG 2 / M comprimento fase não mostrou nenhuma diferença entre as células EGFR + LeX + + e EGFR, tanto em camundongos jovens ou de meia-idade. Em seguida, calculamos a próxima fase G 1 comprimento da primeira divisão até que a fluorescência vermelha desliga. Curiosamente, uma fase de alongamento L 1 foi encontrada durante o envelhecimento em células LeX + EGFR + mas nãoem células EGFR + 25 (Figura 2C, D). Em consequência, neuroesferas obtidas 5 dias após o plaqueamento são menores em células EGFR + + LeX obtidos a partir de ratinhos envelhecidos, como mostrado na Figura 2E. FUCCI-verde ratinhos pode também ser utilizado para visualizar a SG 2 / H de fase com fluorescência verde (Figura 3A, B), mas as células têm de ser pré-seleccionadas utilizando colunas de separação como anticorpo LEX-FITC partilhavam o mesmo comprimento de onda de emissão do que o FUCCI- fluorescência verde (Figura 3C). Um exemplo de fluorescência FUCCI-verde para o primeiro SG 2 / H de fase de adulto jovem LeX + EGFR células EGFR + + e é mostrado na Figura 3D. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig1.jpg" /> Figura 1:. Estratégia de selecção de células por FACS (A) As células foram em primeiro lugar seleccionados de acordo com tmorfologia herdeiro usando dispersão lateral (SSC) vs dispersão para a frente (FSC) parâmetros. Para mais detalhes sobre a seleção portão morfologia, consulte Daynac et al. 9 (a &#39;) As células mortas foram marcadas usando o marcador HO e excluídos da seleção. (A&#39; &#39;) Parelhas foram excluídos com o parâmetro de largura de pulso. A fim de configurar a triagem portões, fluorescência menos um (FMO) controla para CD24-PC7 (LEX-FITC / FUCCI-Red / EGF-Ax647 rotulagem; B) e Lex-FITC (FUCCI-Red / EGF-Ax647 / CD24 &#39;foram usados) (C, C. B) Em seguida, portões de classificação foram determinados em LeX-FITC / FUCCI-Red / EGF-Ax647 / CD24-PC7 tubos rotulados, juntamente com controles FMO; rotulagem -PC7. Os percentuais médios de células totais são representados dentro dos portões. Se selecionar CD24 + células (neuroblastos), tenha cuidado para excluir as células que expressam CD24 brilhantes do portão. Na verdade, CD24 correspondem brilhante para ce ependymallls 2,9. C &#39;representa as células CD24 negativas (quadrado preto no C). Apenas LeX + EGFR + e EGFR + (C &#39;) portões de triagem foram usados ​​para este estudo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig2.jpg" /> Figura 2: análises ao vivo do ciclo celular usando ratos FUCCI-vermelhos (A) Representação esquemática do ciclo celular FUCCI-Red onde as células são vermelho-fluorescente durante a fase G1 e incolor durante SG 2 / M fases 23 de representação (B) FACS de.. fluorescência FUCCI-Red em células SVZ. (C, D) microscopia de vídeo com LeX + EGFR + e EGFR + células classificados do jovem (C) e de meia-idade (D) ratos FUCCI-Red permite o acompanhamento da fase G 1 com Considerando que a fluorescência vermelha SG 2 / H fases pode ser deduzida when a fluorescência vermelha desliga. Imagens sucessivas são mostrados com uma escala de tempo apresentada em D. (E) Imagens representativas de colónias (neuroesferas) obtido 5 dias após o plaqueamento. Barra de escala:. 10 mm (C, D), 30 um (E) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53247/53247fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig3.jpg" /> Figura 3:.. Estratégia para análises ao vivo do ciclo celular usando ratos FUCCI-verde (A) Representação esquemática do ciclo celular FUCCI-Verde onde as células são verdes durante SG 2 / M fase e incolor durante G 1 fase 23 (B) representação FACS de fluorescência FUCCI-Green: células neg FUCCI-verdes representam as células em fase G1 do ciclo celular enquanto FUCCI-Green células pos são células em SG 2 / M 23. (C) A fim de seguir o SG verde-fluorescente 2 / M fases da lex + EGFR + e células EGFR +, células SVZ teve de ser pré-classificadas com colunas de separação. As células foram marcadas com anticorpo anti-ratinho Lex e fracção LeX + foi retido na coluna usando microesferas anti-ratinho (ver protocolo 4.). Então, Lex + e Lex - frações foram eluídas e rotuladas com a EGF-Ax647 e anticorpos CD24-PC7 para separação por FACS (D) microscopia Vídeo de LeX + EGFR + e EGFR + células ordenadas de ratos jovens FUCCI-Green permite o acompanhamento de. O SG 2 / M fases com fluorescência verde. Imagens sucessivas são mostrados com uma escala de tempo apresentada em D. Barra de escala: 10 ^ M (D).

Relatamos um método baseado em Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) para isolar células-tronco neurais (NSCs) e sua progênie da zona subventricular (SVZ) do cérebro de camundongos adultos. Aplicado a camundongos transgênicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite o estudo da progressão do ciclo celular por imagens ao vivo.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar a progressão do ciclo celular de células-tronco neurais separadas e de sua linhagem isoladas da zona subventricular de camundongos transgênicos com fluorescência por ubiquitinação do ciclo celular, conhecidos como camundongos FCI. Isso é realizado primeiramente pela dissecção da zona subventricular dos cérebros de camundongos adultos transgênicos. O segundo passo consiste em dissociar o tecido neuronal em uma suspensão simples de células utilizando um tratamento com papaína.Em seguida, as diferentes populações de células neurogênicas da zona subventricular são marcadas usando anticorpos, a fim de identificar células-tronco neurais quiescentes, células-tronco neurais ativadas, células de amplificação transitória e neuroblastos imaturos e migratórios. O passo final consiste em usar o aparelho de triagem celular para classificar diretamente as células em meio de cultura fresco antes de semeá-las em placas revestidas com poli-D-lisina. Por fim, utiliza-se microscopia de vídeo contínua com lapso de tempo para estudar a progressão do ciclo celular das células semeadas, já que as diversas células transgênicas fluorescem em diferentes momentos durante seu ciclo celular.A combinação da técnica de classificação celular com a tecnologia Fuji permite a visualização e o isolamento das diferentes populações celulares da zona subventricular, possibilitando o estudo das propriedades e da dinâmica no cérebro adulto em movimento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no contexto do envelhecimento e das patologias cerebrais. No dia anterior ao experimento, adicione cerca de 200 microlitros de uma solução de poli-D-lisina a 10 microgramas por mililitro em cada poço de uma placa estéril de 96 poços com paredes pretas para revestir o fundo dos poços; cubra e incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte.Remova a solução de poli-D-lisina e lave as placas três vezes com água destilada estéril antes de deixar a placa secar na câmara de fluxo laminar por pelo menos duas horas. Caso não seja usada imediatamente, armazene a placa revestida e seca a quatro graus Celsius por até sete dias.Em seguida, prepare a solução de dissociação com papaína e esterilize-a passando a mistura por um filtro de 0,2 mícron. Pré-aqueça a solução a 37 graus Celsius antes de utilizá-la. Além disso, prepare uma solução inibidora de protease adicionando 0,7 miligramas por mililitro de tripsina no inibidor tipo dois ao meio TM F 12 estéril.Filtre a solução utilizando um filtro de 0,2 mícron e aqueça previamente a solução a 37 graus Celsius antes de usá-la. Coloque a zona subventricular recém-dissecada do cérebro de um camundongo adulto fucci vermelho em uma placa de Petri contendo 0,6% de glicose em PBS e pique o tecido até que não restem pedaços grandes. Em seguida, transfira tudo para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 200 × g durante cinco minutos.Uma vez que o tecido tenha sido pelotizado, descarte o sobrenadante e ressuspenda. Suspenda o tecido em um mililitro de papaína pré-aquecida, suplementada com 0,01 miligramas por mililitro de dna.One. Incube a mistura por 10 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius.Em seguida, centrifugue novamente a 200 vezes G durante cinco minutos e descarte o sobrenadante. Adicione um mililitro da solução OVO MOID pré-aquecida para interromper a digestão enzimática. A seguir, use uma ponteira de micropipeta P1000 para pipetar suavemente para cima e para baixo 20 vezes, dissociando mecanicamente o tecido picado em uma suspensão de células simples durante a pipetagem.Evite introduzir bolhas de ar na mistura, pois isso causaria estresse adicional às células. Passe a suspensão celular através de um filtro estéril de 20 mícrons em um novo tubo de 15 mililitros. Lave o filtro celular com dois mililitros de PBS contendo 0,15% de BSA para evitar perda de células.Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 200 vezes G durante 10 minutos. Descarte o sobrenadante. Realize a marcação com anticorpos suspensos primeiro colocando as células de cada camundongo em 100 microlitros de PBS contendo 0,15% de BSA.Utilize um décimo das células de um dos camundongos para preparar cada um dos quatro controles conforme descrito no protocolo textual acompanhante. Adicione os anticorpos primários listados aqui a cada um dos tubos utilizados para classificação celular e incube as misturas por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Após a incubação com os anticorpos primários, lave as células com um mililitro de PBS contendo 0,15% de BSA e, em seguida, centrifugue as células a 200 × g por 10 minutos.Re-suspenda as células em 200 microlitros de PBS contendo 0,15% de BSA por cérebro e transfira-as para os tubos de separação apropriados. Coloque os tubos de separação celular no gelo e adicione um corante vital, como o corante Hoechst 33258, a dois microgramas por mililitro, às células imediatamente antes da separação celular, para discriminar células vivas de células mortas.Em seguida, analise as células no tubo de controle negativo no citômetro e selecione as células utilizando os parâmetros de dispersão lateral e dispersão frontal. Exclua as células mortas fazendo o gate apenas nas células da fração negativa e os dupletos ao selecionar o pulso com fração negativa. Execute controles de cor única e ajuste as tensões dos tubos fotomultiplicadores, se necessário.Realize a compensação de cor na janela de compensação do software. Execute os três controles de fluorescência menos um e desenhe as portas de separação. Após todas as portas serem configuradas, separe diretamente as células marcadas em 100 microlitros de cultura.Plaqueie em placa de meio as células recém-separadas em uma densidade de 1000 a 3000 células por poço em placas de 96 poços revestidas com policolisina, adicionando 300 microlitros de meio de cultura. Incube as placas de cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos uma hora.Para permitir a adesão celular, prepare um microscópio confocal a laser para aquisição de imagens pré-aquecendo a câmara controlada por temperatura acoplada a 37 graus Celsius sob uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono. Posicione a placa de 96 poços dentro da câmara pré-aquecida do microscópio e coloque o primeiro poço em foco. Em seguida, abra o software de aquisição de imagens e clique com o botão direito na janela principal para selecionar os controles de aquisição e a aquisição de DEAC.Para abrir o painel do TI e selecionar em seguida o objetivo Plan A PO VC 20 XDIC, clique em controles de aquisição e depois abra as opções de lapso de tempo. Defina o centro de cada poço como posição da platina e selecione a opção de imagem grande para sete por sete milímetros quadrados. Observe uma imagem em mosaico ao redor do centro de cada poço.Defina a sobreposição para a imagem em mosaico grande em 5% e ajuste a frequência para que as imagens sejam capturadas a cada 20 minutos durante 24 horas. Em configurações de um, selecione o nível de tensão do tubo multiplicador de fotoelétrons para cada fluorescência listada na barra de menu. Escolha adquirir imagens usando um scanner de ressonância de alta velocidade em um formato de 512 por 512 pixels e utilize contraste de interferência diferencial (DIC) para visualizar as células.Em seguida, selecione uma pasta para salvar os arquivos de dados. Selecione o botão executar agora na janela de aquisição ND para iniciar a aquisição. Acompanhe o trabalho no computador durante pelo menos um ciclo para garantir que tudo esteja funcionando corretamente.Ratos transgênicos Fuji vermelhos foram utilizados para acompanhar a fase G1 por meio de fluorescência vermelha, utilizando microscopia de vídeo com lapso de tempo. As células isoladas apresentam fluorescência vermelha durante a primeira fase de crescimento e perdem a cor durante a síntese, a segunda fase de crescimento e a mitose. Lex positivo eeg FR positivo e eeg.Células positivas para FR de camundongos adultos jovens e de meia-idade foram semeadas e monitoradas por microscopia. Os comprimentos das fases S e G2/M não mostraram diferença entre células positivas para Lex, positivas para EGFR e positivas para EGFR, tanto em camundongos jovens quanto de meia-idade. No entanto, verificou-se que o comprimento da próxima fase de crescimento, a partir da primeira divisão até a desativação do marcador fluorescente vermelho, foi maior nas células mais velhas devido ao aumento da duração da fase G1.Neuroesferas obtidas cinco dias após o plaqueamento são menores em células Lex positivas e EGFR positivas obtidas dos camundongos mais velhos. Todo o protocolo não deve exceder três horas para a dissecação e preparação do fax e mais três horas para a classificação celular ao trabalhar com 12 camundongos. Tenha em mente que trabalhar com muitos camundongos no mesmo dia resultará em um aumento da duração da classificação celular e possivelmente em maior morte celular ou diferenciação celular.

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Research

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Neuroscience

Neurociência

Imagem tecido embrionário em tempo real, é um desafio durante longos períodos de tempo. Aqui nós apresentamos um ensaio para o monitoramento das alterações celulares e sub-celular na medula espinhal pinto por longos períodos com resolução espacial e temporal. Esta técnica pode ser adaptado para outras regiões do sistema nervoso e embrião em desenvolvimento.

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

Nós descrevemos um protocolo em tempo real videoimaging da migração neuronal no cérebro anterior mouse. A migração de viralmente etiquetados ou enxertado precursores neuronais foi gravado em fatias agudas vivo usando largo campo de imagem fluorescente, com um intervalo de aquisição relativamente rápida para estudar as diferentes fases da migração de células, incluindo as durações das fases estacionária e de migração e da velocidade da migração.

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

Fonte: Gómez-Villafuertes, R., et. al., imagens ao vivo seguidas de rastreamento de célula única para monitorar a biologia celular e a progressão da linhagem de várias populações neurais. J. Vis. exp. (2017) O O vídeo demonstra o processo de preparação, imagem e rastreamento de células-tronco neurais adultas em tempo real para estudar comportamentos celulares, incluindo divisão e diferenciação.

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Fonte: Daynac, M., et. al. Classificação celular de células-tronco neurais e progenitoras da zona subventricular de camundongos adultos e imagens ao vivo de sua dinâmica do ciclo celular. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra imagens de lapso de tempo de células-tronco neurais (NSCs) de um cérebro de camundongo transgênico usando um microscópio confocal de varredura a laser. Os NSCs fluorescem em vermelho durante a fase G1 e não são fluorescentes em outras fases do ciclo celular. Uma cultura...

Imagem de lapso de tempo da divisão de células-tronco neurais de camundongo usando microscopia confocal

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

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Aqui descrevemos um procedimento baseado no uso de partículas lentivirais para a modificação genética de longo prazo de células-tronco neurais e/ou suas células ependimárias adjacentes no nicho neurogênico ventricular-subventricular adulto que permite a análise separada de efeitos celulares autônomos e não autônomos, dependentes de nicho em células-tronco neurais.

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa para estudar comportamentos celulares em tempo real. Aqui, descrevemos um protocolo para Time-Lapse vídeo-microscopia das células do córtex cerebral primário que permite uma análise detalhada das fases promulgada durante a progressão da linhagem de células-tronco neurais primárias diferenciada de neurônios e glia.

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É descrito um protocolo robusto para monitorar as populações neurais por vídeo-microscopia de lapso de tempo seguido baseado em software de pós-processamento. Este método representa uma ferramenta poderosa para identificar os eventos biológicos em uma população selecionada durante as experiências de imagens ao vivo.

Viver a imagem, seguida por uma única célula de rastreamento para biologia celular de Monitor e a progressão da linhagem de várias populações neurais

Citometria de fluxo em tempo real fornecendo sensibilidade de célula única, é especialmente adequada para quantificar as funções do receptor multimodal de culturas vivas. A função de receptor P2X7 usando células progenitoras neurais adulto, foi avaliada através do influxo de cálcio, detectado pelo corante indicador de cálcio, formação do poro transmembrana pela absorção do brometo de etídio e fagocitose usando grânulos látex fluorescentes.

Citometria de fluxo de viver-pilha em tempo real para investigar o influxo de cálcio, formação de poros e fagocitose pelos receptores P2X7 em células progenitoras neurais adulto

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

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Aqui, descrevemos um sistema de nucleofecção projetado para aumentar a eficiência da entrega de genes em células-tronco neurais expandidas (NSCs) isoladas da zona subventricular murina adulta. Os resultados demonstram que este método melhora significativamente a perturbação gênica em NSCs, superando a eficácia dos protocolos tradicionais de transfecção e aumentando a taxa de sobrevivência celular.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Aprenda a isolar células-tronco neurais da zona subventricular de camundongos adultos usando FACS e imagem ao vivo com tecnologia FUCCI. Este método permite estudar a progressão do ciclo celular em neurogênese.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular (Vídeo) | JoVE Journal

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