Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar a progressão do ciclo celular de células-tronco neurais separadas e de sua linhagem isoladas da zona subventricular de camundongos transgênicos com fluorescência por ubiquitinação do ciclo celular, conhecidos como camundongos FCI. Isso é realizado primeiramente pela dissecção da zona subventricular dos cérebros de camundongos adultos transgênicos. O segundo passo consiste em dissociar o tecido neuronal em uma suspensão simples de células utilizando um tratamento com papaína.

Em seguida, as diferentes populações de células neurogênicas da zona subventricular são marcadas usando anticorpos, a fim de identificar células-tronco neurais quiescentes, células-tronco neurais ativadas, células de amplificação transitória e neuroblastos imaturos e migratórios. O passo final consiste em usar o aparelho de triagem celular para classificar diretamente as células em meio de cultura fresco antes de semeá-las em placas revestidas com poli-D-lisina. Por fim, utiliza-se microscopia de vídeo contínua com lapso de tempo para estudar a progressão do ciclo celular das células semeadas, já que as diversas células transgênicas fluorescem em diferentes momentos durante seu ciclo celular.

A combinação da técnica de classificação celular com a tecnologia Fuji permite a visualização e o isolamento das diferentes populações celulares da zona subventricular, possibilitando o estudo das propriedades e da dinâmica no cérebro adulto em movimento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no contexto do envelhecimento e das patologias cerebrais. No dia anterior ao experimento, adicione cerca de 200 microlitros de uma solução de poli-D-lisina a 10 microgramas por mililitro em cada poço de uma placa estéril de 96 poços com paredes pretas para revestir o fundo dos poços; cubra e incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte.

Remova a solução de poli-D-lisina e lave as placas três vezes com água destilada estéril antes de deixar a placa secar na câmara de fluxo laminar por pelo menos duas horas. Caso não seja usada imediatamente, armazene a placa revestida e seca a quatro graus Celsius por até sete dias.

Em seguida, prepare a solução de dissociação com papaína e esterilize-a passando a mistura por um filtro de 0,2 mícron. Pré-aqueça a solução a 37 graus Celsius antes de utilizá-la. Além disso, prepare uma solução inibidora de protease adicionando 0,7 miligramas por mililitro de tripsina no inibidor tipo dois ao meio TM F 12 estéril.

Filtre a solução utilizando um filtro de 0,2 mícron e aqueça previamente a solução a 37 graus Celsius antes de usá-la. Coloque a zona subventricular recém-dissecada do cérebro de um camundongo adulto fucci vermelho em uma placa de Petri contendo 0,6% de glicose em PBS e pique o tecido até que não restem pedaços grandes. Em seguida, transfira tudo para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 200 × g durante cinco minutos.

Uma vez que o tecido tenha sido pelotizado, descarte o sobrenadante e ressuspenda. Suspenda o tecido em um mililitro de papaína pré-aquecida, suplementada com 0,01 miligramas por mililitro de dna.One. Incube a mistura por 10 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius.

Em seguida, centrifugue novamente a 200 vezes G durante cinco minutos e descarte o sobrenadante. Adicione um mililitro da solução OVO MOID pré-aquecida para interromper a digestão enzimática. A seguir, use uma ponteira de micropipeta P1000 para pipetar suavemente para cima e para baixo 20 vezes, dissociando mecanicamente o tecido picado em uma suspensão de células simples durante a pipetagem.

Evite introduzir bolhas de ar na mistura, pois isso causaria estresse adicional às células. Passe a suspensão celular através de um filtro estéril de 20 mícrons em um novo tubo de 15 mililitros. Lave o filtro celular com dois mililitros de PBS contendo 0,15% de BSA para evitar perda de células.

Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 200 vezes G durante 10 minutos. Descarte o sobrenadante. Realize a marcação com anticorpos suspensos primeiro colocando as células de cada camundongo em 100 microlitros de PBS contendo 0,15% de BSA.

Utilize um décimo das células de um dos camundongos para preparar cada um dos quatro controles conforme descrito no protocolo textual acompanhante. Adicione os anticorpos primários listados aqui a cada um dos tubos utilizados para classificação celular e incube as misturas por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Após a incubação com os anticorpos primários, lave as células com um mililitro de PBS contendo 0,15% de BSA e, em seguida, centrifugue as células a 200 × g por 10 minutos.

Re-suspenda as células em 200 microlitros de PBS contendo 0,15% de BSA por cérebro e transfira-as para os tubos de separação apropriados. Coloque os tubos de separação celular no gelo e adicione um corante vital, como o corante Hoechst 33258, a dois microgramas por mililitro, às células imediatamente antes da separação celular, para discriminar células vivas de células mortas.

Em seguida, analise as células no tubo de controle negativo no citômetro e selecione as células utilizando os parâmetros de dispersão lateral e dispersão frontal. Exclua as células mortas fazendo o gate apenas nas células da fração negativa e os dupletos ao selecionar o pulso com fração negativa. Execute controles de cor única e ajuste as tensões dos tubos fotomultiplicadores, se necessário.

Realize a compensação de cor na janela de compensação do software. Execute os três controles de fluorescência menos um e desenhe as portas de separação. Após todas as portas serem configuradas, separe diretamente as células marcadas em 100 microlitros de cultura.

Plaqueie em placa de meio as células recém-separadas em uma densidade de 1000 a 3000 células por poço em placas de 96 poços revestidas com policolisina, adicionando 300 microlitros de meio de cultura. Incube as placas de cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos uma hora.

Para permitir a adesão celular, prepare um microscópio confocal a laser para aquisição de imagens pré-aquecendo a câmara controlada por temperatura acoplada a 37 graus Celsius sob uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono. Posicione a placa de 96 poços dentro da câmara pré-aquecida do microscópio e coloque o primeiro poço em foco. Em seguida, abra o software de aquisição de imagens e clique com o botão direito na janela principal para selecionar os controles de aquisição e a aquisição de DEAC.

Para abrir o painel do TI e selecionar em seguida o objetivo Plan A PO VC 20 XDIC, clique em controles de aquisição e depois abra as opções de lapso de tempo. Defina o centro de cada poço como posição da platina e selecione a opção de imagem grande para sete por sete milímetros quadrados. Observe uma imagem em mosaico ao redor do centro de cada poço.

Defina a sobreposição para a imagem em mosaico grande em 5% e ajuste a frequência para que as imagens sejam capturadas a cada 20 minutos durante 24 horas. Em configurações de um, selecione o nível de tensão do tubo multiplicador de fotoelétrons para cada fluorescência listada na barra de menu. Escolha adquirir imagens usando um scanner de ressonância de alta velocidade em um formato de 512 por 512 pixels e utilize contraste de interferência diferencial (DIC) para visualizar as células.

Em seguida, selecione uma pasta para salvar os arquivos de dados. Selecione o botão executar agora na janela de aquisição ND para iniciar a aquisição. Acompanhe o trabalho no computador durante pelo menos um ciclo para garantir que tudo esteja funcionando corretamente.

Ratos transgênicos Fuji vermelhos foram utilizados para acompanhar a fase G1 por meio de fluorescência vermelha, utilizando microscopia de vídeo com lapso de tempo. As células isoladas apresentam fluorescência vermelha durante a primeira fase de crescimento e perdem a cor durante a síntese, a segunda fase de crescimento e a mitose. Lex positivo eeg FR positivo e eeg.

Células positivas para FR de camundongos adultos jovens e de meia-idade foram semeadas e monitoradas por microscopia. Os comprimentos das fases S e G2/M não mostraram diferença entre células positivas para Lex, positivas para EGFR e positivas para EGFR, tanto em camundongos jovens quanto de meia-idade. No entanto, verificou-se que o comprimento da próxima fase de crescimento, a partir da primeira divisão até a desativação do marcador fluorescente vermelho, foi maior nas células mais velhas devido ao aumento da duração da fase G1.

Neuroesferas obtidas cinco dias após o plaqueamento são menores em células Lex positivas e EGFR positivas obtidas dos camundongos mais velhos. Todo o protocolo não deve exceder três horas para a dissecação e preparação do fax e mais três horas para a classificação celular ao trabalhar com 12 camundongos. Tenha em mente que trabalhar com muitos camundongos no mesmo dia resultará em um aumento da duração da classificação celular e possivelmente em maior morte celular ou diferenciação celular.