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Developmental Biology

Uma Introdução à Genética do Desenvolvimento

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Developmental Biology

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JoVE Science Education Developmental Biology

An Introduction to Developmental Genetics

2.2: Gene Silencing with Morpholinos

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09:06 min

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April 30, 2023

Overview

Desenvolvimento é o processo complexo através do qual um embrião unicelular se transforma em um organismo multicelular. Os processos de desenvolvimento são guiados por informações codificadas no DNA de um organismo, e os geneticistas estão tentando entender como essas informações levam a um organismo totalmente formado.

Este vídeo revisa pesquisas seminal no campo da biologia do desenvolvimento, incluindo a identificação de genes específicos que controlam vários processos embrionários. Uma introdução às principais perguntas feitas pelos geneticistas do desenvolvimento, e os métodos proeminentes usados para respondê-las, também é fornecida. Finalmente, várias aplicações desses métodos proeminentes são discutidas, a fim de mostrar experimentos específicos atualmente sendo realizados neste campo.

Procedure

O desenvolvimento de cada organismo é guiado pelas informações genéticas codificadas em seu DNA. Ao estudar como os genes controlam processos de desenvolvimento, como migração celular e diferenciação, cientistas do campo da genética do desenvolvimento estão tentando entender melhor como as estruturas complexas dos organismos multicelulares são formadas.

Este vídeo apresentará algumas das principais descobertas neste campo, uma série de perguntas fundamentais feitas por geneticistas do desenvolvimento, principais ferramentas que os cientistas usam para responder a essas perguntas e, finalmente, estudos específicos que estão sendo conduzidos sobre genética do desenvolvimento hoje.

Vamos começar revendo algumas das descobertas importantes que moldaram o campo da genética do desenvolvimento.

Em 1865, um monge austríaco, Gregor Mendel, realizou experimentos de reprodução com ervilhas. Ele observou que os traços visíveis das ervilhas ou “fenótipos”, como a cor das sementes, foram herdados de acordo com regras consistentes. Ao propor que esses fenótipos sejam realmente controlados por alguns fatores de hereditariedade invisíveis e discretos, Mendel plantou as sementes do campo da genética.

Esses fatores de herediidade foram chamados de “genes” pelo botânico dinamarquês Wilhelm Johannsen em 1909. Então, em 1910, Thomas Hunt Morgan e seus alunos usaram a mosca-das-frutas Drosophila como um organismo modelo para descobrir que genes são encontrados em estruturas físicas no núcleo celular chamado cromossomos.

Em 1938, Salomé Gluecksohn-Waelsch mostrou que um gene específico era necessário para o desenvolvimento de uma estrutura embrionária conhecida como notochord. Esta foi uma das primeiras evidências de que os genes controlam os processos de desenvolvimento precoce.

Em 1940, Conrad Hal Waddington propôs que as células em um embrião se diferenciam ao longo de caminhos, ou “destinos”, que são controlados por genes. Ele formulou uma metáfora para este processo, refinada ao longo dos próximos 17 anos, chamada de “paisagem epigenética”, onde uma célula é vista como um mármore rolando por uma encosta em direção a diferentes destinos celulares. Os caminhos tomados pela célula seguem os cumes e vales da paisagem, que por sua vez são controlados por genes e seus padrões de expressão.

Em 1952, Wolfgang Beermann confirmou que, embora diferentes células em um organismo tenham o mesmo conteúdo genético, diferentes regiões dos cromossomos estão ativas, e essa expressão genética diferencial define a identidade celular.

Uma vez determinado que a expressão genética influencia o desenvolvimento, a próxima pergunta foi, quais genes? Para responder a isso, na década de 1970, Edward B. Lewis, Christiane Nusslein-Volhard e Eric Weischaus usaram produtos químicos para mutar aleatoriamente genes em moscas frutíferas. Através dessas telas de mutação, os cientistas identificaram um grande número de genes controlando cada etapa do processo de desenvolvimento.

Em 2007, um consórcio internacional de cientistas começou a trabalhar na criação de uma coleção de ratos em que cada gene, um em cada rato, é excluído ou “nocauteado”. O fenótipo de cada um desses camundongos está sendo caracterizado, e nos dará o primeiro catálogo da função de todos os genes em um mamífero.

Agora que revisamos as raízes do campo, vamos olhar para algumas perguntas-chave que os geneticistas do desenvolvimento estão tentando responder.

Alguns pesquisadores estão focando nos primeiros eventos durante a transformação de ovos fertilizados, ou zigotes, em embriões multicelulares. Esses eventos dependem de RNAs e proteínas que são depositadas no óvulo pela mãe, em um fenômeno conhecido como “contribuição materna” ou “efeito materno”. Os cientistas estão interessados em aprender como o genótipo de uma mãe influencia o fenótipo de um embrião.

Outra questão central na genética do desenvolvimento é: como as células geneticamente idênticas adotam diferentes destinos celulares? Os cientistas estão identificando os muitos fatores que controlam a expressão genética diferencial entre diferentes células, incluindo as vias de sinalização que dizem à célula quais genes expressar, e quando expressá-los, durante o desenvolvimento.

Finalmente, os cientistas também perguntam como o embrião precoce, uma massa amorfa de células, se transforma em um organismo complexo com partes distintas e funcionais. A formação deste plano corporal é chamada de morfogênese, e os cientistas estão tentando identificar os genes e caminhos que governam esse processo.

Agora que você conhece algumas das perguntas que os geneticistas do desenvolvimento estão fazendo, vamos rever as técnicas que eles estão usando para responder a essas perguntas.

Os cientistas podem estudar o papel de genes específicos no desenvolvimento, interrompendo sua expressão. Uma maneira de fazer isso é “nocauteando” o gene no DNA do organismo introduzindo mutações, ou substituindo-o por DNA não funcional. Alternativamente, a expressão genética pode ser “derrubada” introduzindo oligonucleotídeos que se ligarão às sequências mRNA alvo e impedirão a produção de proteínas funcionais.

Para identificar quais genes são responsáveis por fenótipos específicos, os cientistas podem realizar telas genéticas. Em uma tela genética avançada, mutações são geradas aleatoriamente em organismos por radiação ou produtos químicos conhecidos como mutagens. Quando um mutante é encontrado para exibir um fenótipo de interesse, o gene desconhecido que foi mutado pode então ser identificado. A abordagem oposta é uma tela genética reversa, onde os cientistas primeiro visam um grande número de genes candidatos específicos para a interrupção, e depois olham para os fenótipos resultantes dos mutantes.

Finalmente, os biólogos também estão interessados em determinar a expressão genética em diferentes estágios de desenvolvimento. Uma ferramenta para medir a expressão genética é a microarray, que é um chip pontilhado com oligonucleotídeos contendo sequências dos genes a serem testados. Em um experimento típico, o RNA extraído de organismos em dois estágios diferentes de desenvolvimento é usado para gerar dois conjuntos diferentes de sondas fluorescentes rotuladas, que são então hibridizadas para a microarray. Alterações na expressão genética podem então ser interpretadas a partir do sinal fluorescente em cada ponto na matriz.

Com essas técnicas experimentais em mente, vamos dar uma olhada em como os pesquisadores estão aplicando-as para estudar genética do desenvolvimento.

Cientistas estão realizando telas genéticas em larga escala em organismos modelo, como C. elegans, para procurar genes que afetam o desenvolvimento. Isso geralmente é feito através da interferência de RNA, ou RNAi, um processo pelo qual os genes são silenciados usando pequenas moléculas de RNA. Aqui, os cientistas alimentaram vermes com bactérias contendo uma biblioteca RNAi projetada contra um grande número de genes de vermes, e analisaram o efeito da derrubada genética no desenvolvimento dos animais.

Outros pesquisadores estão realizando telas genéticas avançadas usando mutagênese aleatória para identificar fenótipos de desenvolvimento. Neste experimento, os pesquisadores usaram a técnica gene-trap para mutagenizar embriões de zebrafish, onde uma construção de repórter é aleatoriamente direcionada a introns de genes e torná-los não funcionais. Os cientistas podem então identificar facilmente os animais em que o gene é interrompido com sucesso procurando o sinal do repórter, e aqueles que exibem um defeito de desenvolvimento podem ter o gene responsável identificado.

Finalmente, a expressão genética de diferentes tipos de células em um organismo em desenvolvimento pode ser perfilada por microarrays para identificar quais genes são ligados ou desligados durante a diferenciação e especialização celular. Neste estudo, células neuronais únicas de diferentes tipos celulares foram isoladas da retina em desenvolvimento. O RNA foi então extraído dessas células para análise de microarray para identificar genes que desempenham um papel no desenvolvimento de cada tipo celular específico.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à genética do desenvolvimento. Este vídeo revisou alguns destaques históricos deste campo, as grandes perguntas feitas pelos geneticistas do desenvolvimento, alguns dos métodos proeminentes atualmente sendo usados em laboratórios, e aplicações específicas dessas abordagens para estudar biologia do desenvolvimento. Como sempre, obrigado por assistir!

Transcript

The development of every organism is guided by the genetic information encoded in its DNA. By studying how genes control developmental processes, such as cell migration and differentiation, scientists in the field of developmental genetics are trying to better understand how the complex structures of multicellular organisms are formed.

This video will present some of the major discoveries in this field, a number of fundamental questions asked by developmental geneticists, major tools that scientists use to answer these questions, and finally, specific studies being conducted on developmental genetics today.

Let’s begin by reviewing some of the important discoveries that have shaped the field of developmental genetics.

In 1865, an Austrian monk, Gregor Mendel, performed breeding experiments with peas. He observed that the peas’ visible traits or “phenotypes,” such as seed color, were inherited according to consistent rules. By proposing that these phenotypes are actually controlled by some invisible, discrete heredity factors, Mendel planted the seeds of the field of genetics.

These heredity factors were named “genes” by Danish botanist Wilhelm Johannsen in 1909. Then, in 1910, Thomas Hunt Morgan and his students used the fruit fly Drosophila as a model organism to discover that genes are found on physical structures in the cell nucleus called chromosomes.

In 1938, Salome Gluecksohn-Waelsch showed that a specific gene was needed for the development of an embryonic structure known as the notochord. This was among the earliest evidence that genes control early developmental processes.

In 1940, Conrad Hal Waddington proposed that cells in an embryo differentiate along paths, or “fates,” that are controlled by genes. He formulated a metaphor for this process, refined over the next 17 years, called the “epigenetic landscape,” where a cell is seen as a marble rolling down a hillside towards different cell fates. The paths taken by the cell follow the ridges and valleys in the landscape, which in turn are controlled by genes and their expression patterns.

In 1952, Wolfgang Beermann confirmed that while different cells in an organism have the same genetic content, different regions of the chromosomes are active, and this differential gene expression defines cell identity.

Once it was determined that gene expression influences development, the next question was, which genes? To answer this, in the 1970s, Edward B. Lewis, Christiane Nusslein-Volhard and Eric Weischaus used chemicals to randomly mutate genes in fruit flies. Through these mutation screens, the scientists identified a large number of genes controlling every step of the development process.

In 2007, an international consortium of scientists began work on creating a collection of mice in which every single gene, one in each mouse, is deleted or “knocked out.” The phenotype of each of these mice is currently being characterized, and will give us the first catalogue of the function of all genes in a mammal.

Now that we’ve reviewed the roots of the field, let’s look at a few key questions that developmental geneticists are trying to answer.

Some researchers are focusing on the early events during the transformation of fertilized eggs, or zygotes, into multicellular embryos. These events depend on RNAs and proteins that are deposited in the egg by the mother, in a phenomenon known as “maternal contribution” or “maternal effect.” Scientists are interested in learning how a mother’s genotype influences an embryo’s phenotype.

Another central question in developmental genetics is: how do genetically identical cells adopt different cell fates? Scientists are identifying the many factors that control differential gene expression among different cells, including the signaling pathways that tell the cell what genes to express, and when to express them, during development.

Finally, scientists are also asking how does the early embryo, an amorphous mass of cells, transform into a complex organism with distinct, functional parts. The formation of this body plan is called morphogenesis, and scientists are trying to identify the genes and pathways that govern this process.

Now that you know some of the questions that developmental geneticists are asking, let’s review the techniques they are using to answer these questions.

Scientists can study the role of specific genes in development by disrupting their expression. One way to do this is by “knocking out” the gene in the organism’s DNA by introducing mutations, or replacing it with nonfunctional DNA. Alternatively, gene expression can be “knocked down” by introducing oligonucleotides that will bind to the target mRNA sequences and prevent the production of functional proteins.

To identify which genes are responsible for particular phenotypes, scientists can carry out genetic screens. In a forward genetic screen, mutations are randomly generated in organisms by either radiation or chemicals known as mutagens. When a mutant is found to display a phenotype of interest, the unknown gene that was mutated can then be identified. The opposite approach is a reverse genetic screen, where scientists first target a large number of specific candidate genes for disruption, and then look at the resultant phenotypes of the mutants.

Finally, biologists are also interested in determining gene expression at different developmental stages. One tool for measuring gene expression is the microarray, which is a chip dotted with oligonucleotides containing sequences of the genes to be tested. In a typical experiment, RNA extracted from organisms at two different developmental stages is used to generate two different sets of fluorescently labeled probes, which are then hybridized to the microarray. Changes in gene expression can then be interpreted from the fluorescent signal at each dot on the array.

With these experimental techniques in mind, let’s take a look at how researchers are applying them to study developmental genetics.

Scientists are performing large-scale genetic screens in model organisms, such as C. elegans, to look for genes that affect development. This is usually done through RNA interference, or RNAi, a process whereby genes are silenced using small RNA molecules. Here, scientists fed worms with bacteria containing an RNAi library designed against a large number of worm genes, and analyzed the effect of gene knockdown on the animals’ development.

Other researchers are performing forward genetic screens using random mutagenesis to identify developmental phenotypes. In this experiment, researchers used the gene-trap technique to mutagenize zebrafish embryos, where a reporter construct is randomly targeted to introns of genes and render them nonfunctional. Scientists can then easily identify the animals in which the gene is successfully disrupted by looking for the reporter signal, and those that exhibit a developmental defect can have the responsible gene identified.

Finally, the gene expression of different cell types in a developing organism can be profiled by microarrays to identify which genes are turned on or off during cell differentiation and specialization. In this study, single neuronal cells of different cell types were isolated from the developing retina. RNA was then extracted from these cells for microarray analysis to identify genes that play a role in the development of each specific cell type.

You’ve just watched JoVE’s introduction to developmental genetics. This video reviewed some historical highlights of this field, the big questions asked by developmental geneticists, a few of the prominent methods currently being used in labs, and specific applications of these approaches to studying developmental biology. As always, thanks for watching!

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