Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

O objetivo geral deste procedimento é expandir em células T ou INKT natural killer variantes colhidas do baço de camundongo. Isso é feito primeiro isolando as células mononucleares esplênicas, seguido pelo enriquecimento da população de linfócitos positivos para CD cinco por separação de células magnéticas. A fração de células INKT esplênicas é então isolada por classificação de células ativadas por fluorescência.

Na etapa final, as células INKT classificadas são assentadas para expansão in vitro. Em última análise, o perfil de citocinas das células INKT expandidas pode ser avaliado por Eliza. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois a purificação e expansão das células INKT requer a combinação de diferentes técnicas.

Este procedimento será shrogen um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Após a colheita do baço, transfira o tecido para um filtro de náilon de 70 mícrons e, em seguida, use um êmbolo de seringa de dois mililitros para esmagar suavemente o baço através do filtro em um tubo cônico de 50 mililitros e lave o filtro com cinco mililitros de PBS. Em seguida, adicione três mililitros do pacote de carvão a um tubo de 15 mililitros e sobreponha o gradiente de densidade com os cinco mililitros de suspensão celular.

Separe as células por centrifugação e transfira a interface para um novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, lave as células em 10 mililitros de PBS frio e ressuspenda o pellet em dois mililitros de tampão fax para enriquecer para o CD cinco linfócitos esplênicos positivos. Ajuste a diluição da célula para uma vez 10 elevado às sétimas células por 90 microlitros com mais tampão de fax e adicione 10 microlitros de anti CD cinco microesferas às células.

Após 15 minutos a quatro graus Celsius, lave as células com quatro mililitros de tampão de fax e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de fax fresco. Isole as células positivas do CD cinco por separação magnética de células de acordo com a recomendação do fabricante. Em seguida, dilua o CD enriquecido cinco linfócitos positivos de uma vez 10 para as seis células por 20 microlitros de tampão inax contendo anti CD 16, CD 32 e tetrâmero alfa gals conjugado com PE à temperatura ambiente no escuro após 30 minutos, incube as células com os anticorpos de interesse a quatro graus Celsius no escuro por mais 30 minutos.

Em seguida, lave as células em tampão de fax fresco e core-as com 10 microlitros de uma solução de trabalho de 20 micromolares de DPI por um vezes 10 para as seis células por cinco minutos. À temperatura ambiente, agora adquira aproximadamente uma vez 10 elevado ao quarto CD enriquecido, cinco eventos linfocitários positivos no citômetro de fluxo, eletronicamente acionando a dispersão direta com células baixas para excluir os dublês celulares e agregados eletronicamente. Bloqueie o CD positivo DAPI oito células positivas CD 19 positivas dentro da dispersão direta com baixa população e use gráficos de dispersão lateral e de dispersão direta.

Para selecionar eletronicamente os linfócitos, plote os tetrâmeros alfa gal SER CD 1D por CD três épsilon e eletronicamente ga o alfa gal ser CD 1D tetrâmero positivo CD três células INKT positivas épsilon, conforme indicado. Em seguida, adquirindo não mais do que duas vezes 10 elevado ao quinto CD, cinco linfócitos enriquecidos positivos determinam a porcentagem de alfa gal SER, CD 1D tetrâmero positivo, três células INKT positivas épsilon presentes na fração celular enriquecida. Usando esta classificação de porta baixa, o alfa alser CD 1D tetrâmero positivo CD três células INKT positivas épsilon em um tubo de fax contendo um mililitro de soro fetal de bezerro no final da classificação.

Enxágue as células NKT isoladas da lateral do tubo de fax com 10 mililitros de meio RPMI 1640. Em seguida, gire as células, ressuspenda o pellet em um mililitro de RPMI 1640 e use uma alíquota de 40 microlitros das células para avaliar a pureza das células classificadas. Usando a mesma estratégia de gating.

Quanto à configuração dos parâmetros de classificação para expandir as células INKT, gire as células e ressuspenda as células isoladas em cinco vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro em meio RPMI 1640 completo suplementado com IL dois IL 12 e anti CD 28. Em seguida, semeie as células de uma só vez 10 para as quintas células INKT por poço em uma placa revestida com três épsilon anti CD de fundo plano de 96 poços e incube-as a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de células. Após dois dias, transfira as células para uma nova placa de fundo plano não revestida de 96 poços para cultura em condições de repouso em RPMI 1640 completo.

Médio para mais dois dias de incubação. No quarto dia após a triagem, pipetar suavemente o sobrenadante em cada poço para desalojar as células e agrupá-las em um tubo cônico de 15 mililitros. Após centrifugação, suspenda novamente o palato em cinco vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro.

Em meio RPMI 16 completo suplementado com IL sete e semente um vezes 10 elevado à quinta células por poço. Em uma nova placa de fundo plano de 96 poços, retorne as células à incubadora após quatro dias, puxe-as em um novo tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Suspenda novamente o pellet em meio RPMI 1640 completo contendo anti CD 28 solúvel e semeie as células em uma placa de fundo plano de 96 poços revestida com anti CD três épsilon de uma vez 10 das quintas células por poço e retorne as células à incubadora por mais três dias, quatro dias, 11 a 18.

Repita o tratamento IL seven anti CD 28 e anti CD three épsilon conforme demonstrado no dia 19. Transfira as células para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Gire-os para baixo e ressuspenda o pellet em cinco vezes 10 elevado à quinta células por mililitro em RPMI 1640.Medium completo.

Em seguida, semeie as células de uma vez 10 a quinta células por poço em uma placa de fundo plano de 96 poços e deixe as células descansarem por dois dias na incubadora de cultura de células. A estimulação de células INKT classificadas com anti CD três épsilon ligado à placa na presença de IL dois IL 12 e anti CD 28 solúvel resulta em uma expansão de aproximadamente três vezes do número de INKT após dois dias de cultivo. A expansão subsequente das células INKT na presença de IL sete resulta em um aumento de três a quatro vezes no número de células INKT presentes no quarto dia em cultura.

Notavelmente, a repetição dessas condições de cultura pode produzir uma média de sete vezes 10 para as sétimas células INKT após duas rodadas de expansão sem qualquer perda visível de células entre as mudanças nos meios de cultura em dias diferentes, resultando em uma expansão de pelo menos 70 vezes em 18 dias. Células INKT expandidas ainda mais ativadas com murino recombinante ligado a placas. CD 1D carregado com alfa alser produz IL dois IL quatro IFN gama, TNF alfa e IL seis 48 horas após a estimulação, demonstrando que as células INKT mantêm sua capacidade de produzir TH uma e TH duas citocinas pós-expansão.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a coloração adequada das células INKT com cdre carregado com ceramida alfa é essencial para identificar as células INKT durante a citometria de fluxo. Certo.