Name: Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a isolar e expandir células iNKT do baço de camundongo usando separação magnética e citometria de fluxo. Este protocolo otimizado aumenta o rendimento celular com recursos mínimos para estudos imunológicos.

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D.E. e M.B.D. são membros de uma plataforma de pesquisa multidisciplinar (MRP) da Universidade de Ghent e do consórcio Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID).

Neste estudo, foram utilizados para adultos (6-8 semanas) fêmeas C57BL / 6. Os ratos foram alojados e produzido de acordo com as diretrizes do biotério da Universidade de Ghent. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Cuidado Animal Institucional. 1. Preparação de células mononucleares (MNC) a partir de baço de murganho <ol><li> Sacrifique o rato por deslocamento cervical. </li><li> Posicione o mouse de volta para baixo na placa de dissecação e corrigir o traseiras e dianteiras com alfinetes. </li><li> Esterilizar a-superfície da pele com 70% (vol / vol) de etanol / H 2 O. </li><li> Corte a pele ao longo da linha média do abdome para o tórax e expor o baço utilizando instrumentos cirúrgicos estéreis. </li><li> Após o corte dos tecidos gordos circundantes, colocar o baço em uma placa de 24 poços contendo 1 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) à temperatura ambiente. </li><li> Dissecar do baço utilizando um escalpelo estéril e transferir as peças para um filtro de nylon de 70 um colocado dentro de uma tina 50 mle. </li><li> Usando 2 ml de um êmbolo da seringa, triturar suavemente os pedaços de baço através do filtro de células e lava-se com 5 ml de PBS 1x. </li><li> Adicionar 3 ml de Ficoll-Paque para um tubo de 15 ml e sobrepor a forma do gradiente de densidade com 5 ml de suspensão celular. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 20 min à temperatura ambiente sem travão. </li><li> Transferir a interfase para um novo tubo de 15 ml, adicionar 10 ml de PBS 1x frio e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células em 2 ml de PBS 1x contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (tampão FACS). Transferir 10 uL da suspensão de células para um pequeno tubo, misturar com 10 ul de 0,4% </li></ol> 2. Enriquecimento, detecção e purificação de células do rato iNKT <ol><li> Enriquecimento de rato splenic linfócitos CD5positive (CD5 +). <ol><li> (Opcional) Mancha 10 5 células com FITC-conjugado anti-CD5 (4 ul de diluição 1:30 / 10 6 células)durante 30 min a 4 ° C no escuro, lava-se com 200 ul de tampão de FACS e ressuspender em 500 ul de tampão de FACS. Preparar uma solução de trabalho a 20 uM de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBS 1x, adicionar 1 mL da mesma a 10 5 células em tampão de SCAF e incubar à TA durante 5 min. Adquirir 10 4 células pré-enriquecido no citómetro de fluxo. <ol><li> Usando FCS-H e FCS-W, porta eletronicamente em células lo FSC-W para excluir dupletos celulares e agregados (Figura 1A). Então eletronicamente portão fora DAPI + (células mortas) dentro do W-lo FSC população (Figura 1B), e usar SSC-A e FCS-A para selecionar eletronicamente a população de linfócitos pelo tamanho (Figura 1C). </li><li> Usando células, dentro da porta de linfócitos, traçar SSC-A versus CD5 e electronicamente portão CD5 + linfócitos, como mostrado na Figura 1D. Adquirir o restante da amostra de pré-enriquecido no citómetro de fluxo. </li&gt; </ol></li><li> Ajustar as contagens de células para 10 7 culas por 90 uL em tampão de SCAF e adicionar 10 ul de microesferas anti-CD5. </li><li> Incubar a 4 ° C durante 15 minutos, lavar uma vez com 4 mL de tampão de FACS e ressuspender em 500 ul de tampão de FACS frio. Enriqueça para CD5 + linfócitos usando separação de células magnéticas (MACS) colunas de acordo com as recomendações do fabricante. </li><li> Opcional) Stain 10 5 células com anti-CD5 FITC-conjugado (4 ul de diluição de 1:30 / 10 6 células) e DAPI como em 2.1.1. Adquirir 10 4 linfócitos enriquecidos no citômetro de fluxo e verifique se as portas eletrônicas criado em 2.1.1. selecione CD5 + linfócitos na fracção celular enriquecido. Adquirir 10 5 células no citómetro de fluxo e análise da percentagem de linfócitos CD5 + presentes na fracção enriquecida tal como mostrado na Figura 1E - H. </li></ol></li><li> Detecção e isolamento de rato iNKT cells por FACS. <ol><li> Ressuspender linfócitos enriquecidos CD5 + a uma concentração de aproximadamente 10 6 células por 20 uL em tampão de SCAF contendo anti-CD16 / CD32 (4 ul de diluição 1:50 / 10 6 células) e αGalCer conjugado com PE / CD1d tetrâmero (1 ug / 10 6 células). </li><li> Incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Dilui-se anticorpos de ratinho (mAcs) anti-CD3ε V500 (4 ul de diluição de 1:20 / 10 6 células), anti-CD19 E450 (4 ul de diluição 1:50 / 10 6 células) e anti-CD8a E450 (4 ul de diluição 1:50 / 10 6 células) em tampão de SCAF, adicionar aos linfócitos CD5 + e incubar durante 30 min a 4 ° C no escuro. </li><li> Lavam-se as células com 1 ml de tampão de FACS por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender em 4 ml de tampão de FACS a uma concentração final de 10 7 células / ml. </li><li> Filtrar as células através de um coador de células de 30 ^ m e colocar as células em gelo. </li><li> Calibrar o citômetro de fluxo para separação de células de acordo com as recomendações do fabricante 14,15. NOTA: A calibração de um citómetro de fluxo para separação de células requer treino e pode ser realizada por um operador experiente, ou um técnico treinado. </li><li> Adicionar 10 ul de uma solução de trabalho a 20 ^ M de DAPI por 10 6 células e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Adquirir aproximadamente 10 4 enriquecidos + linfócitos CD5 no citômetro de fluxo. Eletronicamente portão em células lo FSC-W para excluir dupletos celulares e agregados (Figura 2A). Então eletronicamente portão fora DAPI + CD8 + CD19 + células (canal dump) dentro do FSC-lo W população (Figura 2B), e usá-SSC-A e FCS-A para selecionar eletronicamente linfócitos (Figura 2C), como descrito em 2.1.1.1 . <ol><li> Plot αGalCer / CD1d tetrâmero por CD3ε e eletronicamente portão αGalCer / CD1dcélulas tetrâmero + + CD3ε iNKT como mostrado na Figura 2D. Adquirir mais de 2 x 10 5 CD5 + linfócitos enriquecidos para determinar a percentagem αGalCer / CD1d tetrâmero + + CD3ε iTNK células presentes na fracção celular enriquecido. </li></ol></li><li> Utilizando as portas electrónicas criadas em 2.2.7., Células de tipo FACS αGalCer / CD1d tetrâmero + + iNKT CD3ε no citómetro de fluxo, a 70 psi, utilizando um bocal de 70 um, com um caudal de &#39;1,5&#39;. Recolha iNKT células ordenadas em um tubo FACS contendo 1 ml de 100% FCS. Subsequentemente enxaguar células iNKT classificadas a partir do lado do tubo de FACS utilizando 10 ml de RPMI 1640 e centrifugar as células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células iNKT classificados em 1 ml de RPMI 1640 e 40 ul do mesmo adquirir num citómetro de fluxo para avaliar a pureza das células iNKT ordenadas. Selecione FSC-W lo DAPI - linfócitoss como descrito em 2.2.7. (Figura 2E - G) e electronicamente portão αGalCer / células tetrâmero + + iNKT CD3ε CD1d, como mostrado na Figura 2H. </li></ol></li></ol> 3. Cultura e Expansão do mouse iNKT Cells Dia 0 <ol><li> Revestimento uma placa de 96 poços de fundo plano com anticorpo anti-CD3ε purificados (3 ug / ml) por poço durante 1 h à TA. Lavar duas vezes com 200 ul de PBS 1x e uma vez com 200 ul de meio completo RPMI 1640 (10% vol / vol de FCS, 100 U / ml de penicilina-estreptomicina, 5,5 uM β-mercaptoetanol). </li><li> Contar o número de células viáveis ​​ordenadas iNKT (passo 2.2.8), utilizando um hemocitómetro 0,4% como em 1.11., Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender em 5 x 10 5 células / ml em meio completo RPMI 1640 contendo IL-2 recombinante de murino (10 ng / ml), recombinante IL-12 murina (1 ng / ml) e solúvel de CD28 anti-rato (5 ug / mL). Placasorted células iNKT 5 a 10 células / poço em placas revestidas com anti-CD3ε e incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante 2 dias. </li></ol> Dia 2 <ol start="3"><li> Transferir as células para um não revestido de fundo plano de placa de 96 poços de cultura fresco e as células sob condições de repouso, em meio completo RPMI 1640 a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante 2 dias. </li></ol> Dia 4 <ol start="4"><li> Desalojar as células da placa por pipetagem suave e transferência das células para um novo tubo de 15 ml. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C, ressuspender em 5 x 10 5 células / ml em meio completo RPMI 1640 contendo IL-7 recombinante de murino (5 ng / ml), e a placa 10 5 células / poço numa plano- placa de 96 poços de fundo durante 4 dias a 37 ° C em uma incubadora de CO 2. </li></ol> Dia 8 <ol start="5"><li> Recolher as células num tubo fresco, centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender em 5 x 10 5 culas / ml em meio completo RPMI 1640 contendo anti-CD28 solúvel (5 ug / mL). </li><li> Revestimento uma placa de 96 poços de fundo plano com anticorpo anti-CD3ε purificados (3 ug / ml) por poço e lavar como em 3.1. Placa 10 5 células / poço em anti-CD3ε placas revestidas e incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 até o dia 11. </li></ol> Dia 11-18 <ol start="7"><li> Repita os passos 3,4-3,6. </li></ol> Dia 19-20 <ol start="8"><li> Transferir as células para um novo tubo de 15 ml, centrifugar a 300 x g e ressuspender em 5 x 10 5 culas / ml em meio completo RPMI 1640. </li><li> As células em placa a 10 5 células / poço numa placa de 96 poços de fundo plano e permitir que as células em repouso durante 2 dias a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 antes da sua utilização num ensaio. </li></ol> 4. produção de citocinas por células de rato iNKT Usando um CD1d PlatEnsaio de e-bound <ol><li> Revestimento uma placa de 96 poços de fundo plano com 100 uL de murino recombinante CD1d (10 ug / mL em 1x PBS) por poço e incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar quatro vezes com 200 ul de PBS 1x, adicionar 200 ul de 2% de FCS em PBS 1x (solução de bloqueamento) por poço e incubar durante 2 horas a 37 ° C. </li><li> Remover a solução de bloqueio, adicionar 200 ul de αGalCer (5 ng / ul) por poço e incubar a placa a 37 ° C durante 16 horas. [Para a preparação da solução αGalCer, adicionar 1,085 μ 1x PBS para 55 ug de αGalCer dissolvidos em veículo que contém 96 mg / mL de sacarose, 10 mg / ml de desoxicolato de sódio e 5 mg / ml de Tween 20]. </li><li> Após incubação, eliminar a solução e lavar o αGalCer bem duas vezes com 200 ul de PBS 1x seguido por 200 ul de meio completo RPMI 1640. </li><li> Recolher as células iNKT expandidas in vitro no dia 21, as células de centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender em R completoPMI 1640 a uma concentração de 0,5 x 10 6 células / ml. </li><li> Adicionar 200 ul da ressuspensão iTNK célula por poço e incubar durante 72 horas a 37 ° C em uma incubadora de CO 2. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante e medem citocinas de interesse por ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol>

<ol><li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells%3A+development%2C+specificity%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li>
<li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immuno%22%5BJournal%5D)">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+glycosphingolipid+recognition+by+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells.</a> Science. 306, 1786-1789 (2004).</li>
<li>Cardell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1-restricted+CD4%2B+T+cells+in+major+histocompatibility+complex+class+II-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice.</a> J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).</li>
<li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d-restricted+and+TCR-mediated+activation+of+valpha14+NKT+cells+by+glycosylceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides.</a> Science. 278, 1626-1629 (1997).</li>
<li>Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+in+rheumatic+disease%3A+a+joint+dilemma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).</li>
<li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+cells+in+immunoregulation+of+tumor+immunity%3A+a+new+immunoregulatory+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis.</a> Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).</li>
<li>Molling, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li>
<li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li>
<li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li>
<li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection%2C+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li>
<li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li>
<li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+%27real+time%27%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li>
<li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.

Etapas críticas do protocolo atual incluem o isolamento e enriquecimento posterior de CD5 + linfócitos (Seção 1 &amp; 2), FACS classificação (Seção 3) eo revestimento inicial de células iNKT (Seção 4). Dos passos realizados na Seção 1, lembre-se para a camada cuidadosamente a suspensão celular splenic a médio gradiente de densidade tal que uma interfase celulares distintos é gerado após a centrifugação. O enriquecimento posterior para CD5 + linfócitos por separação magnética de células (Seção 2) mi...

Murino células T assassinas naturais invariante (iNKT) são uma população distinta de linfócitos T inatas selecionados no timo por expressando CD1d timócitos corticais 1,2. iNKT células expressam um receptor de células T (TCR) composta de uma cadeia Vα14-Jα18 TCR invariante emparelhado com qualquer Vβ8, Vβ7 Vβ2 TCRs ou 3, que é capaz de reconhecer endógena, bem como os antigénios de lípidos estranhos no contexto da CD1d. Por exemplo, células de murino iNKT reconhecer e são activados por um chamado lípido isoglobotrihexosylceramide antigénio endógeno (iGb3) 4, bem como α-galactosilceramida (αGalCer) 5,6, um glicolípido isolado a partir de esponjas marinhas. TCR-dependente de activação de células iNKT promove a iniciação de respostas imunitárias adaptativas, e como um resultado, as células iNKT foram mostrados para ser funcionalmente envolvidos na melhoria ou o desenvolvimento de uma variedade de patologias incluindo a doença reumática 7 e cancro &lt;sup&gt; 8. Actualmente, os ligandos celulares iTNK sintéticos constituem novos adjuvantes de vacinas promissoras, que podem ser capazes de regular a um número de condições imunopatológicas. Foi previamente demonstrado que as células iNKT podem ser gerados in vitro após isolamento a partir de tecido de rato no entanto; muitos destes estudos emprega a utilização de células primárias de apresentação de antigénio (APCs) e / ou linhas de células 9, Vα14 TCR transgénicos (Tg) de 10 ratinhos, timomas ou para a geração de iNKT derivadas de células hibridomas 11,12. Além disso, um grande número de ratos, altos volumes de reagentes, tais como dímeros CD1d αGalCer-carregados, e tempos de cultivo longas fazer alguns protocolos publicados há menos de forma ética e economicamente atraente 9,13. Neste relatório nós descrevemos um método adaptado para o isolamento e expansão in vitro de células de rato iNKT baço. Mais especificamente, o protocolo descreve um métodopara o enriquecimento de células de baço de ratinho iNKT que reduz os ratos, os reagentes e tempo necessários para FACS separação de células, e propõe uma abordagem otimizada para expansão de células esplênicas iNKT ordenados in vitro.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>murino recombinante IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>murino recombinante IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>murino recombinante IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>purificado anti-rato CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>purificado anti-rato CD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugado anti-rato CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugado anti-rato CD8&alpha; (53-6,7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD5 anti-rato conjugado com FITC (53-7.3)</td><td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>CD3&épsilon anti-rato conjugado com V500; (500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD5 (Ly-1) microesferas</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>purificado anti-mouse CD16/32 (2.4G2)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Columns</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 médio</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca2+/Mg2+ - livre]</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>de soro bovinoSigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG&</td><td></td></tr><tr><td>beta;-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Fundo F Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tubo</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>tubo de falcão de 50 ml</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; filtro m</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 &micro; m filtro</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS separador</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS Colunas</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 com camisa de água</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissecção</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biociências</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante natural killer t de rato spleen

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

A capacidade de secretar citocinas rapidamente com a estimulação é uma característica funcional da invariante natural killer T (iNKT) linhagem celular. iNKT células são portanto caracterizado como uma população de células T capazes de activar inata e adaptativa direcção respostas imunes. O desenvolvimento de técnicas melhoradas para a cultura e expansão de células iNKT murino facilita o estudo de biologia celular iNKT in vitro e em sistemas modelo in vivo. Aqui, descrevemos um processo aperfeiçoado para o isolamento e a expansão de células esplénicas murinas iNKT. Os baços de ratinhos C57BL / 6 são removidos, dissecados e tenso e a suspensão celular resultante é colocado em camadas sobre meios de gradiente de densidade. Após centrifugação, as células mononucleares esplénicas (MNCs) são recolhidos e linfócitos CD5-CD5 positivas (+) são enriquecidos para usando esferas magnéticas. iNKT células dentro da fracção CD5 + são subsequentemente corados com ^5; GalCer-carregado CD1d tetrâmero e purificou-se por selecção de células activadas de fluorescência (FACS). Separadas por FACS, em seguida, as células são iNKT inicialmente cultivadas in vitro, utilizando uma combinação de citocinas recombinantes de murideo e receptor de células T de placa ligado (TCR), antes de ser expandido estímulos em presença de murino IL-7 recombinante. Usando esta técnica, aproximadamente 10 8 iNKT células pode ser gerada dentro de 18-20 dias de cultura, após o que eles podem ser utilizados para ensaios funcionais in vitro, ou para experiências in vivo em ratinhos de transferência.

Isolamento de células mononucleares esplénicas utilizando um gradiente de densidade leva cerca de 1 hora e elimina a utilização de reagentes necessários para a lise de glóbulos vermelhos (RBC). Um elevado rendimento de células viáveis ​​é obtida usando este método e detritos gerados durante a deformação do órgão é removido. Tipicamente, a frequência de células iNKT dentro do conjunto de linfócitos do baço varia entre 1 e 5% de linfócitos T totais no entanto, isto pode variar, dependendo do estado a idade, sexo e saúde d...

Aqui apresentamos um protocolo adaptado que pode ser usado para gerar um grande número de células T natural killer invariantes murinas do baço de camundongo. O protocolo descreve uma abordagem pela qual as células iNKT esplênicas podem ser enriquecidas, isoladas e expandidas in vitro usando um número limitado de animais e reagentes.

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

O objetivo geral deste procedimento é expandir células T naturais do tipo variante, ou células INKT, obtidas do baço de camundongo. Isso é realizado primeiramente isolando-se células mononucleares esplênicas, seguido pelo enriquecimento da população de linfócitos positivos para CD5 por separação magnética de células. A fração de células INKT esplênicas é então posteriormente isolada por meio de classificação celular ativada por fluorescência.No passo final, as células INKT classificadas são semeadas para expansão in vitro. Em última análise, o perfil de citocinas das células INKT expandidas pode ser avaliado por Eliza. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois a purificação e expansão de células INKT requer a combinação de diferentes técnicas realizadas.Este procedimento será realizado por um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Após a coleta do baço, transfira o tecido para um filtro de náilon de 70 mícrons, depois use o êmbolo de uma seringa de dois mililitros para esmagar suavemente o baço através do filtro para um tubo cônico de 50 mililitros e lave o filtro com cinco mililitros de PBS. Em seguida, adicione três mililitros do meio de gradiente a um tubo de 15 mililitros e sobreponha o gradiente de densidade com os cinco mililitros de suspensão celular.Se pare as células por centrifugação e transfira a interface para um novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, lave as células com 10 mililitros de PBS frio e re-suspenda o pellet em dois mililitros de tampão fax para enriquecer os linfócitos esplênicos positivos para CD5. Ajuste a diluição celular para um vezes 10 à sétima células por 90 microlitros com mais tampão fax e adicione 10 microlitros de microesferas anti-CD5 às células.Após 15 minutos a quatro graus Celsius, lave as células com quatro mililitros de tampão fax e re-suspenda o pellet em 500 microlitros de tampão fax fresco. Isole as células CD cinco positivas por separação magnética de células de acordo com a recomendação do fabricante. Em seguida, dilua os linfócitos enriquecidos CD cinco positivos a uma vez 10 à sexta células por 20 microlitros de tampão inax contendo anti-CD 16, CD 32 e tetramero PE conjugado alfa gals air CD 1D à temperatura ambiente no escuro. Após 30 minutos, incube as células com os anticorpos de interesse a quatro graus Celsius no escuro por mais 30 minutos.Em seguida, lave as células em tampão fax fresco e marque-as com 10 microlitros de uma solução trabalho de 20 micromolar de DPI por um vezes 10 à sexta células durante cinco minutos. Agora, adquira aproximadamente um vezes 10 à quarta eventos de linfócitos CD5 positivos enriquecidos no citômetro de fluxo, fazendo o gate eletrônico com base no espalhamento para a frente com baixa célula para excluir dupletas e agregados celulares eletronicamente. Elimine as células DAPI positivas, CD8 positivas e CD19 positivas dentro da população com baixo espalhamento para a frente, e utilize os gráficos de área de espalhamento lateral e espalhamento para a frente.Para selecionar eletronicamente os linfócitos, plote os tetrameros alfa gal SER CD 1D por CD três épsilon e marque eletronicamente as células INKT positivas para tetramero alfa gal ser CD 1D e positivas para CD três épsilon, conforme indicado. Em seguida, adquirindo não mais do que duas vezes 10 à quinta células linfoides enriquecidas CD cinco positivas, determine a porcentagem de células INKT positivas para tetramero alfa gal SER CD 1D e positivas para CD três épsilon presentes na fração celular enriquecida. Usando esse gradiente de classificação baixa, classifique as células INKT positivas para tetramero alfa alser CD 1D e positivas para CD três épsilon em um tubo FACS contendo um mililitro de soro fetal bovino ao final da classificação.Lave as células T-NK isoladas da parede do tubo de centrífuga com 10 mililitros de meio RPMI 1640. Em seguida, centrifugue as células, reconstitua o pellet em um mililitro de RPMI 1640 e utilize uma alíquota de 40 microlitros das células para avaliar a pureza das células classificadas. Utilizando a mesma estratégia de seleção de eventos.No que diz respeito ao estabelecimento dos parâmetros de cultivo para expansão das células INKT, centrifugue as células e reconstitua as células isoladas a cinco vezes 10 à quinta células por mililitro em meio RPMI 1640 completo suplementado com IL-2, IL-12 e anti-CD28. Em seguida, semeie as células a uma concentração de uma vez 10 à quinta células INKT por poço em uma placa de 96 poços com fundo plano revestido com anti-CD3 épsilon e incube-as a 37 graus Celsius em uma estufa de cultura celular. Após dois dias, transfira as células para uma placa fresca de 96 poços com fundo plano e não revestida, para cultivo em condições de repouso em RPMI 1640 completo.Médio para outra incubação de dois dias. No quarto dia após a separação, pipete suavemente o sobrenatante em cada poço para desprender as células e reúna-as em um tubo cônico de 15 mililitros. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet em cinco vezes 10 à quinta células por mililitro.Em meio RPMI 1640 completo suplementado com IL-7, semear uma vez 10 à quinta potência de células por poço. Em uma nova placa de 96 poços com fundo plano, retornar as células ao incubador após quatro dias e transferi-las para um tubo cônico de 15 mililitros novo para centrifugação. Re-suspender o pellet em meio RPMI 1640 completo contendo anti-CD28 solúvel e semear as células em uma placa de 96 poços com fundo plano revestida com anti-CD3 epsilon, na concentração de uma vez 10 à quinta potência de células por poço, e retornar as células ao incubador por mais três dias, quatro dias, de 11 a 18.Repita o tratamento com IL-7, anti-CD28 e anti-CD3 épsilon conforme demonstrado no dia 19. Transfira as células para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue e resuspenda o pellet em 5 × 10⁵ células por mililitro em meio RPMI 1640 completo.Em seguida, semeie as células a uma concentração de um vezes 10 à quinta células por poço em uma placa de 96 poços com fundo plano e deixe as células repousarem por dois dias no incubador de cultura celular. A estimulação de células INKT classificadas com anti-CD3 épsilon ligado à placa na presença de IL-2, IL-12 e anti-CD28 solúvel resulta em uma expansão de aproximadamente três vezes no número de células INKT após dois dias de cultura. A expansão subsequente das células INKT na presença de IL-7 resulta em um aumento de três a quatro vezes no número de células INKT presentes no quarto dia de cultura.Notavelmente, a repetição dessas condições de cultivo pode gerar uma média de sete vezes 10 à sétima células INKT após duas rodadas de expansão, sem perda visível de células entre as trocas de meio de cultura em dias diferentes, resultando em uma expansão de pelo menos 70 vezes em 18 dias. Células INKT expandidas adicionalmente, ativadas com CD1D murino recombinante fixado em placa e carregado com alfa-alser, produzem IL-2, IL-4, IFN-gama, TNF-alfa e IL-6 às 48 horas após a estimulação, demonstrando que as células INKT mantêm sua capacidade de produzir citocinas do tipo TH1 e TH2 após a expansão.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a coloração adequada de células INKT com cdre carregado com alfa-ceramida é essencial para identificar as células INKT durante a citometria de fluxo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo descreve o enriquecimento de células T do baço de um camundongo por seleção negativa usando um separador magnético. A técnica envolve direcionar as outras células da amostra para depleção usando anticorpos ou ligantes direcionados contra antígenos específicos da superfície celular.

Enriquecimento de células T: uma técnica para isolar células T da população de células mistas por separação magnética

Este vídeo demonstra o isolamento de linfócitos, incluindo células natural killer ou células NK, do tecido hepático humano para expansão seletiva. A digestão enzimática e mecânica, seguida de separação por gradiente de densidade, promove o isolamento de linfócitos, incluindo células NK. Os linfócitos coletados podem ser usados para a expansão seletiva das células NK.

Isolamento de células assassinas naturais do tecido hepático para expansão seletiva

Este vídeo descreve um protocolo para isolar células T CD8+ específicas de antígenos raros usando células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs) baseadas em nanopartículas magnéticas funcionalizadas com MHC-Igs carregados de peptídeos antigênicos e anticorpos anti-CD28. A interação dos aAPCs com células T CD8+ que expressam especificamente os receptores de células T direcionados a peptídeos antigênicos, seguida de sua expansão in vitro, resulta no enriquecimento e expansão dessa...

Enriquecimento baseado em nanopartículas e expansão de células T CD8+ específicas para antígenos

Este vídeo demonstra a indução da doença intestinal do enxerto contra o hospedeiro, GvHD, em um camundongo receptor letalmente irradiado usando células-tronco hematopoiéticas alogênicas e linfócitos T alorreativos esplênicos indutores de GvHD. Este protocolo ajuda a estabelecer um modelo de GvHD intestinal aguda grave para entender o mecanismo da doença e desenvolver opções terapêuticas inovadoras.

Indução da doença do enxerto contra o hospedeiro em modelos de camundongos via transplante alogênico de medula óssea e células esplênicas

Este vídeo ilustra um método para isolar células T natural killer invariantes, também conhecidas como células iNKT. O procedimento começa com a injeção de um glicolipídio sintético em um camundongo para estimular a ativação e proliferação de células iNKT no baço. Posteriormente, suspensões unicelulares são preparadas a partir do baço e incubadas com complexos de reconhecimento de células iNKT marcados com fluoróforos, seguidos de separação baseada em esferas magnéticas, para isolar as células...

Isolando células T assassinas naturais invariantes de um modelo de camundongo

As células T CD4+ virgens polarizam para vários subconjuntos, dependendo do ambiente no momento da ativação.  A diferenciação de células T CD4+ virgens em vários subconjuntos efetores pode ser alcançada in vitro através da adição de estímulos de receptores de células T e sinais específicos de citocinas.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve o transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico e permite repetitivas avaliações miniendoscópica do cólon distal in situ para a presença, as características e gravidade da inflamação do cólon dentro ao vivo ratos sofrem intestinal enxerto versus doença-- host.

Indução de Intestinal enxerto versus doença-- host e sua avaliação endoscópica-Mini em ratos ao vivo

Descrevemos um protocolo rápido e robusto para enriquecer células T (iNKT) invariantes do assassino natural do baço do rato e expandi-las in vitro para números adequados para estudos in vitro e in vivo.

Purificação e Expansão de Células T Assassinos Naturais Invariantes para Estudos In vitro e In vivo

Aqui, apresentamos um método para expandir o natural killer do sangue periférico (PBNK), células NK de tecidos hepáticos e células do receptor de antígeno quimérico (CAR)-NK derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou sangue do cordão umbilical (CB). Este protocolo demonstra a expansão das células NK e CAR-NK usando células alimentadoras de 221-mIL-21, além da pureza otimizada das células NK expandidas.

Natural Killer (NK) e Método de Expansão Celular CAR-NK usando a Linha Celular B Modificada por IL-21 Ligada à Membrana

Aprenda a isolar e expandir células iNKT do baço de camundongo usando separação magnética e citometria de fluxo. Este protocolo otimizado aumenta o rendimento celular com recursos mínimos para estudos imunológicos.

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

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