Mapeamento espacial e temporal da motilidade em Ex Vivo Preparações dos intestinos

Os objetivos gerais para a criação de um mapa espaço-temporal abrangente dos intestinos ex vivo são estudar a resposta ao conteúdo luminal, observando o movimento detalhado da parede intestinal ao longo de um segmento inteiro. A principal vantagem dessa técnica é que a atividade em diferentes regiões do mesmo segmento de tecido pode ser registrada e comparada no espaço e no tempo, permitindo a identificação de padrões complexos de motilidade em vez de simples contração ou relaxamento. Embora esse método possa fornecer informações sobre a motilidade intestinal normal, ele também pode ser aplicado à ideificação dos efeitos de vários medicamentos e agentes intraluminais, como nutrientes ou padrões de motilidade.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque, inicialmente, os mapas espaço-temporais podem ser difíceis de interpretar. Mas com o tempo, pode-se discernir padrões complexos de relance. Para começar, remova o cólon ou intestino de uma cobaia sacrificada.

Prenda-o com uma solução de Krebs quente. Na bandeja de dissecação, remova todo o conteúdo intraluminal perfundindo suavemente o tampão Krebs através do lúmen. Use uma seringa com cateter de extremidade romba e evite distender excessivamente o segmento do cólon durante a perfusão.

Em seguida, anexou dois, três milímetros de comprimento de tubos de polietileno a dois cateteres de tubo de vidro polido a fogo, que têm três milímetros de diâmetro. Em uma bandeja de dissecção aquecida, insira um cateter na extremidade oral da preparação do tecido e amarre uma sutura atrás do pequeno pedaço de tubo, envolvendo o cateter usando um nó de cirurgião. Tente puxar suavemente o cateter de volta para garantir que o nó esteja firme.

O pequeno pedaço de tubo de polietileno evita o deslizamento da sutura. Repita esse processo usando o outro cateter na extremidade aboral do tecido. Em seguida, remova o mesentério da preparação do tecido.

Com ambos os cateteres presos, transfira a preparação da bandeja de dissecção para um dos banhos de órgãos GIMM e posicione o tecido com a extremidade oral voltada para longe do usuário. Em seguida, prenda os cateteres de tubo de vidro ao banho de órgão usando argila modeladora, prendendo a extremidade do tubo de vidro na lateral do banho ou usando clipes de plástico para prender os cateteres aos postes acima do banho usado para prender as câmeras. Agora prenda um pedaço de tubo de cinco centímetros na extremidade aberta de cada cateter.

Para o cateter oral, conecte a peça de tubo curto a uma peça de tubo mais longa com um acessório de trava luer. Em seguida, conecte a seringa de cinco mililitros ao encaixe luer lock. Isso será usado para injetar tampão na preparação do tecido.

Para o cateter aboral, use o tubo para direcionar a saída luminal para um recipiente de coleta. Agora, usando a seringa anexada, lave lentamente o tecido com tampão Krebs aquecido para garantir que haja um bom fluxo, como visto pelo líquido que sai do cateter aboral. Prossiga calibrando o sistema de gravação de vídeo enquanto o tecido se equilibra por 30 minutos.

Calibre o posicionamento da altura da câmera, as configurações de vídeo para brilho e contraste e distância horizontal usando o software GIMM. Clique na guia do experimento para que a câmera seja calibrada. Em seguida, no menu Arquivo, clique em Calibrar.

Quando o vídeo aparecer na janela da estação de trabalho calibrada, coloque a câmera em uma altura em que a imagem inclua as extremidades dos cateteres inseridos no lúmen do cólon. Em seguida, calibre a distância horizontal visualizada na imagem na tela usando o adesivo de régua translúcido anexado a cada banho. Na mesma janela calibrar estação de trabalho, defina as linhas-guia verticais vermelhas para que fiquem separadas por 10 milímetros.

Em seguida, digite essa distância na janela do cursor de distância e clique no botão Cal. Em seguida, ajuste os controles deslizantes de ganho, brilho e obturador na janela da estação de trabalho calibrada para fazer com que o segmento de tecido apareça como uma silhueta escura em um fundo claro. Em seguida, ajuste os botões de foco e abertura na própria câmera para melhorar ainda mais a imagem.

Para concluir a calibração da imagem, clique em Salvar seguido de Sim na tela pop-up. Por fim, clique em Sair. Após o período de equilíbrio de meia hora, comece o experimento.

Comece nomeando o teste experimental. Em seguida, oclua o lúmen do tubo que se projeta do cateter abdominal com a pinça plástica. Em seguida, injete aproximadamente 7 mililitros de tampão Krebs no lúmen colônico proximal.

O objetivo é fornecer distensão suficiente para iniciar contrações propulsivas. Assim que o segmento for distendido pelo fluido luminal, inicie a gravação do vídeo. No software, clique duas vezes na avaliação nomeada para abrir a visualização da câmera experimental e, em seguida, clique no botão de alternância para a posição ativada para visualizar o campo da câmera.

Colete um comprimento predeterminado de dados de vídeo. No final deste teste inicial de distensão controlada, afrouxe ou remova o grampo para permitir que o segmento de tecido impulsione o líquido distendido para fora do lúmen. Permitiu que o tecido se reequilibrasse por 10 a 20 minutos e depois repetisse o procedimento usando o tratamento.

Uma única preparação de tecido pode passar por até cinco tratamentos de 10 minutos para os períodos de descanso apropriados entre os testes. Esteja ciente da descamação da mucosa, que sinaliza a degradação do tecido. para analisar a gravação, clique duas vezes no nome de um ensaio específico para abrir a janela de análise para a construção de um mapa ST.

Na área de reprodução de vídeo, ajuste os controles deslizantes de contraste e brilho para tornar a imagem apropriada para análise. Crie uma silhueta de tecido preto em um fundo claro. Em seguida, defina as diretrizes vermelhas horizontais e verticais dentro da janela de imagem de vídeo para isolar a região do tecido para análise e remover áreas que contenham artefatos.

Em seguida, defina o tempo para análise. Clique no botão verde A para selecionar o ponto inicial e clique no botão amarelo B para o ponto de parada quando o controle deslizante de tempo estiver nas posições corretas. Em seguida, selecione a guia Análise do motor para abrir a janela do mapa ST e clique no botão do cronômetro.

Comece a geração do mapa ST clicando no cursor da mira dentro da silhueta preta do tecido. A geração do mapa pode levar alguns minutos para ser concluída. Depois que o mapa ST for construído, selecione o recurso de zoom para ampliar a imagem.

Em seguida, selecione a opção de cor para ver a imagem em cores em vez de tons de cinza. Em seguida, selecione ativar para que o cursor possa ser usado para selecionar o pixel para análise. Para o tecido associado aos pixels selecionados, a mudança no diâmetro luminal ao longo do tempo é analisada e exibida como um traçado de diâmetro de grão à direita do mapa ST.

Após as análises, selecione Sair. Agora exporte o mapa ST para outras finalidades selecionando Arquivo e, em seguida, Exportar dados e, em seguida, Metafilo. Nomeie o arquivo e salve-o como um arquivo emf clicando em Salvar.

Os mapas gerados por essa técnica mostram mudanças no diâmetro luminal do tecido tanto na distância quanto no tempo. A distância horizontal está no eixo X e o tempo no eixo Y, com a hora de início na parte superior e a hora de término na parte inferior. No canto superior direito há uma legenda, que exibe os diâmetros luminais mínimo e máximo, bem como a escala para os eixos X e Y.

Assim, diferentes tons de pixel dentro da imagem em tons de cinza correspondem a diferentes diâmetros luminais. Pixels mais escuros correspondem a diâmetros mais largos e pixels mais claros correspondem a diâmetros menores. As ondas contráteis do músculo circular aparecerão como regiões de pixelização mais leve devido à redução do diâmetro luminal.

Em contraste, a distensão luminal devido ao relaxamento muscular circular ou a um grande bolo de líquido é mostrada com pixels mais escuros. Além das ondas de uma contração de propagação, o padrão de motilidade de mistura conhecido como segmentação também pode ser visualizado. Pequenas contrações estacionárias ocorrem em diferentes áreas ao mesmo tempo.

Com o tempo, essas pequenas contrações se movem em direção à extremidade anal aboral. O mesentério remanescente no tecido pode causar artefatos, que são exibidos como linhas verticais escuras. O movimento horizontal dessas linhas verticais artificiais pode ser usado para determinar o tempo do movimento muscular longitudinal.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar segmentos intestinais para gravação de vídeo e como gerar a representação subsequente da motilidade intestinal como mapas espaço-temporais. Após este procedimento, diferentes nutrientes podem ser adicionados à solução luminal para determinar como os componentes naturais induzem padrões específicos de motilidade para facilitar a digestão e absorção. O uso de agonistas farmacológicos específicos ou antagonistas de receptores para agentes humorais neurais pode ser usado para determinar os mecanismos pelos quais a motilidade é iniciada e propagada.

Essa técnica pode ajudar a produzir dados úteis para determinar compostos úteis para o tratamento de distúrbios de motilidade.