Mapeamento espacial e temporal da motilidade em

Os objetivos gerais para a criação de um mapa espaçotemporal abrangente de intestinos ex vivo são estudar a resposta ao conteúdo luminar por meio da observação do movimento detalhado da parede intestinal em todo um segmento. A principal vantagem dessa técnica é que a atividade em diferentes regiões do mesmo segmento de tecido pode ser registrada e comparada no espaço e no tempo, permitindo a identificação de padrões complexos de motilidade, em vez de simples contração ou relaxamento. Embora este método possa fornecer informações sobre a motilidade intestinal normal, ele também pode ser aplicado à identificação dos efeitos de diversas drogas e agentes intraluminais, como nutrientes ou padrões de motilidade.

De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois inicialmente os mapas espaciotemporais podem ser difíceis de interpretar. Com o tempo, no entanto, é possível discernir padrões complexos de imediato. Para começar, remova o cólon ou intestino de um porquinho-da-índia eutanasiado.

Fixe-o em solução de Krebs morna. Na bandeja de dissecação, remova todo o conteúdo intraluminal perfundindo suavemente tampão de Krebs através da luz. Utilize uma seringa com cateter de ponta romba e evite distender excessivamente o segmento do cólon durante a perfusão.

Em seguida, acople dois segmentos de tubo de polietileno, com três milímetros de comprimento, a dois cateteres de vidro com pontas polidas por chama, com três milímetros de diâmetro. Em uma bandeja de dissecação aquecida, insira um cateter na extremidade oral da preparação do tecido e amarre uma sutura atrás do pequeno segmento de tubo, envolvendo o cateter com um nó cirúrgico. Tente suavemente puxar o cateter para fora, a fim de garantir que o nó esteja firme.

O pequeno pedaço de tubo de polietileno evita o deslizamento da sutura. Repita este processo utilizando o outro cateter na extremidade aboral do tecido. Em seguida, remova o mesentério da preparação do tecido.

Com ambos os cateteres fixados, transfira o preparo da bandeja de dissecação para um dos banhos de órgão GIMM e posicione o tecido com a extremidade oral voltada para longe do usuário. Em seguida, fixe os cateteres de tubo de vidro ao banho de órgão usando massa de modelar, conectando a extremidade do tubo de vidro à lateral do banho, ou utilize clipes plásticos para prender os cateteres às hastes acima do banho, usadas para fixar as câmeras. Agora, conecte um pedaço de tubo de cinco centímetros a cada extremidade aberta dos cateteres.

Para o cateter oral, conecte o trecho curto de tubo a um trecho mais longo de tubo com uma conexão luer lock. Em seguida, conecte a seringa de cinco mililitros ao encaixe luer lock. Isso será usado para injetar tampão na preparação do tecido.

Para o cateter aboral, use o tubo para direcionar o fluxo luminar para um recipiente de coleta. Agora, utilizando a seringa acoplada, lave lentamente o tecido com solução de Krebs aquecida para garantir um bom fluxo, observado pelo líquido que sai do cateter aboral. Prossiga calibrando o sistema de gravação de vídeo enquanto o tecido se equilibra por 30 minutos.

Calibre a altura da câmera, as configurações de vídeo para brilho e contraste e a distância horizontal utilizando o software GIMM. Clique na guia experimento para a câmera que será calibrada. Em seguida, no menu Arquivo, clique em Calibrar.

Uma vez que o vídeo apareça na janela da estação de calibração, posicione a câmera em uma altura em que a imagem inclua as extremidades dos cateteres inseridos na luz colônica. Em seguida, calibre a distância horizontal visualizada na imagem na tela usando o adesivo de régua translúcida fixado em cada banho. Na mesma janela da estação de calibração, ajuste as linhas orientadoras verticais vermelhas para que fiquem distanciadas 10 milímetros uma da outra.

Em seguida, digite esta distância na janela do cursor de distância e clique no botão Cal. Ajuste então os controles deslizantes de ganho, brilho e obturador na janela da estação de calibração para fazer o segmento de tecido aparecer como uma silhueta escura sobre um fundo claro. Ajuste em seguida os botões de foco e abertura na própria câmera para melhorar ainda mais a imagem.

Para concluir a calibração da imagem, clique em Salvar seguido por Sim na tela pop-up. Por fim, clique em Sair. Após o período de equilíbrio de meia hora, inicie o experimento.

Comece nomeando o ensaio experimental. Em seguida, oclua a luz do tubo que se projeta a partir do cateter aboral com o prendedor de plástico. Então, injete aproximadamente 7 mililitros de tampão de Krebs na luz colônica proximal.

O objetivo é proporcionar distensão suficiente para iniciar contrações propulsivas. Uma vez que o segmento esteja distendido pelo fluido luminal, inicie a gravação do vídeo. No software, clique duas vezes no ensaio nomeado para abrir a visualização da câmera experimental e, em seguida, clique no interruptor de alternância na posição ligada para visualizar o campo da câmera.

Colete um comprimento predeterminado de dados em vídeo. No final deste ensaio inicial de distensão controlada, solte ou remova o grampo para permitir que o segmento de tecido expulse o líquido distensor da luz. Deixe o tecido reequilibrar por 10 a 20 minutos e, em seguida, repita o procedimento utilizando o tratamento.

Uma única preparação de tecido pode passar por até cinco tratamentos de 10 minutos, com os respectivos períodos de repouso adequados entre os testes. Esteja atento ao desprendimento da mucosa, que sinaliza a degradação do tecido. Para analisar o registro, clique duas vezes no nome de um ensaio específico para abrir a janela de análise destinada à construção de um mapa de ST.

No interior da área de reprodução de vídeo, ajuste os controles deslizantes de contraste e brilho para tornar a imagem adequada para análise. Crie um silhueta preta do tecido sobre um fundo claro. Em seguida, defina as linhas-guia vermelhas horizontais e verticais dentro da janela de imagem do vídeo para isolar a região do tecido destinada à análise e remover áreas que contenham artefatos.

Em seguida, defina o tempo para análise. Clique no botão verde A para selecionar o ponto inicial e clique no botão amarelo B para o ponto final quando o controle deslizante de tempo estiver nas posições corretas. Em seguida, selecione a aba Análise do Motor para abrir a janela do mapa ST e, depois, clique no botão cronômetro.

Inicie a geração do mapa ST clicando no cursor de mira dentro da silhueta preta do tecido. A geração do mapa pode levar alguns minutos para ser concluída. Após a construção do mapa ST, selecione o recurso de zoom para ampliar a imagem.

Em seguida, selecione a opção de cor para visualizar a imagem em cores em vez de escala de cinza. Depois, selecione ativar para que o cursor possa ser usado para selecionar o pixel a ser analisado. Para o tecido associado aos pixels selecionados, a alteração no diâmetro luminal ao longo do tempo é analisada e exibida como um traçado do diâmetro do grão à direita do mapa ST.

Após as análises, selecione Sair. Agora exporte o mapa ST para outras finalidades selecionando Arquivo e, em seguida, Exportar Dados e depois Metaarquivo. Nomeie o arquivo e salve-o como um arquivo emf clicando em Salvar.

Os mapas gerados por esta técnica mostram as alterações no diâmetro luminal do tecido em função da distância e do tempo. A distância horizontal está no eixo X e o tempo no eixo Y, com o tempo inicial na parte superior e o tempo final na parte inferior. No canto superior direito encontra-se uma legenda, que exibe os diâmetros luminais mínimo e máximo, bem como as escalas para os eixos X e Y.

Assim, diferentes tons de pixel na imagem em escala de cinza correspondem a diferentes diâmetros luminais. Pixels mais escuros correspondem a diâmetros maiores, e pixels mais claros correspondem a diâmetros menores. As ondas contráteis do músculo circular aparecerão como regiões de pixelação mais clara devido à redução do diâmetro luminal.

Em contraste, a distensão luminal devido ao relaxamento do músculo circular ou a uma grande quantidade de fluido é mostrada com pixels mais escuros. Além das ondas de contração propagada, o padrão de motilidade de mistura conhecido como segmentação também pode ser visualizado. Pequenas contrações estacionárias ocorrem em diferentes áreas ao mesmo tempo.

Com o tempo, essas pequenas contrações movem-se em direção ao extremo anal aboral. A mesentério que permanece no tecido pode causar artefatos, que aparecem como linhas verticais escuras. O movimento horizontal dessas linhas verticais artificiais pode ser utilizado para determinar o momento do movimento do músculo longitudinal.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar segmentos intestinais para gravação em vídeo e de como gerar a representação subsequente da motilidade intestinal na forma de mapas espaço-temporais. Após este procedimento, diferentes nutrientes podem ser adicionados à solução luminar para determinar como componentes naturais induzem padrões específicos de motilidade, facilitando a digestão e a absorção. O uso de agonistas ou antagonistas farmacológicos específicos para receptores de agentes neurais humorais pode ser empregado para determinar os mecanismos pelos quais a motilidade é iniciada e propagada.

Essa técnica poderia ajudar a produzir dados úteis para determinar compostos úteis no tratamento de distúrbios da motilidade.