sinalizado-Bigode Eyeblink condicionamento clássico em Ratos fixo-Cabeça

O objetivo geral deste protocolo é utilizar os avanços genéticos em camundongos e nosso entendimento do sistema de vibrissas para investigar a base neurobiológica do condicionamento do reflexo palpebral, um paradigma passível de transposição para o estudo da aprendizagem e da memória. Este método pode ajudar a responder questões mecanicistas sobre aprendizagem e memória por meio de imageamento de cálcio e eletrofisiologia em camundongos geneticamente manipulados, enquanto estimula vibrissas específicas durante o condicionamento. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de fixar a cabeça dos camundongos minimizando o estresse, permitindo que os animais se desloquem em seu próprio ritmo sobre uma esteira cilíndrica.

As implicações dessa técnica estendem-se a tratamentos potenciais para déficits de memória, incluindo aqueles associados ao envelhecimento normal e à doença de Alzheimer. A preparação do cilindro e do sistema de estimulação dos vibrissas são abordadas no protocolo textual. Esta seção aborda a preparação da peça craniana.

A tira do conector é uma tira moldada de sete furos impressa em 3D, baseada na tira de náilon da série Amphenol 221, que já não é mais fabricada comercialmente. A partir da peça impressa em 3D, rosqueie o primeiro furo para um parafuso mecânico de 0-80 por uma polegada e deixe um furo vazio após o primeiro furo. Em seguida, utilizando um torno de bancada, insira cinco pinos banhados a ouro nos cinco furos restantes.

Insira os pinos através dos orifícios mais estreitos do plástico. Em seguida, utilizando um descarnador térmico, remova meio centímetro do revestimento de poliimida. Depois, solde a extremidade descarnada a um dos pinos onde houver uma abertura.

Corte o fio soldado entre seis e sete milímetros e descasque cerca de dois milímetros do fio. Agora, repita este processo para fixar quatro fios no total aos cinco pinos. Os dois primeiros fios registrarão respostas de EMG da pálpebra, enquanto os dois seguintes fornecerão estimulação elétrica à região periorbital.

Na quinta pino, solde um fio de aço inoxidável descoberto de cinco centímetros para servir como terra elétrico. Após fazer todas as conexões, verifique cada uma delas com um multímetro para garantir a continuidade elétrica. Comece com um animal completamente anestesiado, confirmado por um aperto no dedo do pé.

Administre uma dose de cloridrato de buprenorfina como analgésico. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica nas córneas e retire os pelos da parte superior da cabeça do animal. A seguir, fixe a cabeça do animal em um estereotáxico e desinfete o couro cabeludo com três esfregaços alternados de iodopovidona e álcool.

Com uma lâmina de bisturi número 10 ou 15, faça uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo, expondo o crânio desde a frente dos olhos até além do osso interparietal. Retraia os retalhos de pele com seis microclips, expondo o máximo possível do crânio, incluindo os lados e a parte posterior. Em seguida, use o bisturi para remover o periósteo do crânio.

Em seguida, limpe a parte superior do crânio com peróxido de hidrogênio a 3% três vezes. Após o crânio estar seco, faça dois orifícios com uma broca cônica invertida nº 34, tomando cuidado para não danificar o cérebro. Posicione um orifício à frente do bregma e o outro à frente do lambda, à esquerda da linha média ao condicionar o olho direito, ou vice-versa.

Esses orifícios devem ser perfurados com cuidado para acomodar os parafusos, e deve-se fazer um grande esforço para não danificar o cérebro. Nos orifícios, coloque parafusos para as conexões elétricas. Cada volta completa abaixa o parafuso em 0,28 milímetros, portanto duas voltas completas são suficientes.

Em seguida, crie várias pequenas reentrâncias no crânio para aumentar a área de superfície para a cimentação. A partir da peça craniana concluída, enrole o fio de terra em uma configuração em forma de oito ao redor dos dois parafusos. Deixe alguma folga no fio de terra para que a peça craniana possa ser posicionada corretamente.

Agora, aplique o cimento de fixação frio. Cubra abundantemente o crânio e os parafusos e deixe o cimento secar. Após a secagem do cimento, posicione a peça craniana verticalmente, com os pinos voltados para cima, acima do crânio.

Fixe a peça craniana com um suporte preso a um braço do quadro. O suporte deve ter cinco soquetes revestidos a ouro para receber os pinos da peça craniana. Posicione os dois fios de EMG sobre o músculo orbicular dos olhos acima da órbita ocular.

Em seguida, posicione os dois fios estimuladores. Coloque as extremidades descascadas sob a pele, de dois a quatro milímetros diretamente caudal ao olho. Não permita que as extremidades deles se toquem.

Se os fios forem tão longos que possam arranhar o olho do animal, corte-os ou dobre-os para trás. Uma pequena parte do fio nu deve permanecer exposta. Agora, fixe a base dos fios ao crânio com um pouco mais de cimento luting e deixe secar.

Use cerca de metade do volume anteriormente utilizado. Para prosseguir, remova os microclips e reposicione a pele. Deixe a pele acomodar-se naturalmente para evitar tensão que distorceria a pálpebra, inibindo o piscar e, consequentemente, comprometendo o experimento.

Uma vez que a pele esteja acomodada, remova o suporte do dispositivo craniano e selar a área exposta com cimento dental. Evite gotejar cimento nos olhos ou nos pinos do dispositivo craniano. Em seguida, use um cotonete umedecido com solvente de cimento dental para alisar e moldar o cimento parcialmente curado conforme necessário.

Uma vez que o cimento tenha secado completamente, retire o animal do estereotáxico e permita que ele se recupere sobre uma superfície aquecida antes de devolvê-lo à sua gaiola de origem. Inicie a habituação dos camundongos após eles terem tido pelo menos cinco dias de tempo de recuperação. Para imobilizar o camundongo, segure-o brevemente pela cauda para prendê-lo atrás dos ombros.

Em seguida, levante o camundongo por baixo do abdômen e do tronco. Depois, acople um conector à peça craniana e aperte o parafuso de travamento. Em seguida, coloque o camundongo suavemente sobre o cilindro e mantenha-o imóvel enquanto usa dois parafusos para fixar o conector nas barras acima do cilindro.

Em seguida, solte o camundongo. Nas duas primeiras sessões, permita que o camundongo se habitue ao cilindro pelo mesmo período de tempo de uma sessão de condicionamento. Durante a habituação, registre a frequência espontânea de piscadas.

Além disso, exponha previamente os camundongos ao estimulador de vibração dos vibrissas sem aplicar estimulação elétrica. Com o sistema piezo próximo ao lado condicionado, passe os dentes do pente sobre os vibrissas individuais. Selecione os mesmos vibrissas em todas as sessões.

Em seguida, prossiga com o treinamento de condicionamento clássico conforme apresentado no texto. Camundongos machos C57 Black 6J com idade entre oito e dez semanas foram treinados com condicionamento de piscar de olhos com intervalo na esteira cilíndrica com cabeça fixada. Foram realizados registros de EMG de cada ensaio.

Os EMGs foram retificados e integrados com uma constante de tempo de 10 milissegundos, e depois foram médias entre todos os ensaios. A evolução das respostas condicionadas ao longo de 10 sessões de treinamento mostra que gradualmente a resposta aumentou em amplitude e a latência da resposta tornou-se mais curta. Essa evolução não é observada nas respostas dos camundongos pseudocondicionados, nos quais os estímulos são apresentados em ordem aleatória.

A evolução de respostas condicionadas bem sincronizadas, e portanto bem aprendidas, também pode ser observada nos histogramas do tempo até o pico da resposta após o início do CS. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar a peça craniana, implantar cirurgicamente a peça craniana em um camundongo e posicionar o camundongo na esteira cilíndrica, para o condicionamento do reflexo palpebral com a cabeça fixada. Seus camundongos devem apresentar uma boa curva de aprendizado ao longo dos dias à medida que adquirem o condicionamento.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de permanecer atento à observação de qualquer sinal de desconforto nos animais. Devem ser tomadas medidas apropriadas para minimizar o estresse dos animais.