Name: sinalizado-Bigode Eyeblink condicionamento clássico em Ratos fixo-Cabeça (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda o condicionamento clássico do reflexo de piscar sinalizado por bigodes em camundongos de cabeça fixa. Este método permite estudar os mecanismos neurobiológicos da aprendizagem e memória com imagem de cálcio e eletrofisiologia.

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Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa (W81XWH-13-01-0243) e os Institutos Nacionais de Saúde (R37 AG008796). Agradecemos Alan Baker em oficina mecânica da Universidade Northwestern para a construção do aparelho de cilindro fixo-cabeça. Agradecemos ao Dr. Shoai Hattori por sua orientação em MATLAB e Solidworks. Agradecemos ao Dr. John Power para o software LabView que controlava o experimento.

Todos os procedimentos envolvendo ratos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Animal Care Institucional da Universidade Northwestern e do Comitê Use com base nas diretrizes emitidas pelo Instituto Nacional de Saúde. 1. O cilindro (Figura 2A) <ol><li> Construir o cilindro, como descrito por Chettih et ai. E Heiney et al., A partir de um cilindro de espuma de longa 14-15. Cortar um comprimento de 10 cm de cilindro e perfurar um furo através do centro para encaixar o eixo, um metal haste de 12,7 mm (0,5 pol.) De diâmetro. Montar o cilindro com o seu eixo para uma placa de ensaio óptico de metal tal como descrito por Heiney et al., Ou outro suporte (por exemplo, Plexiglas) 15. </li><li> Erigir duas hastes metálicas verticais de 12,7 mm de diâmetro em cada lado do cilindro. </li><li> Anexar duas montagens de ângulo à direita para as hastes de metal. </li><li> Garantir mais duas hastes (5 cm de comprimento, 12,7 mm de diâmetro) através dos suportes em ângulo reto. Bevel the extremidades destas hastes e nivelar as suas extremidades acima do centro do cilindro (Figura 2G). </li><li> Perfurar e bater um buraco através das extremidades niveladas das hastes para caber dois 4-40 parafusos de máquina que irá realizar as asas do conector no lugar (Figura 2G). </li></ol> 2. Montagem do sistema de estimulação Bigode (Figura 2B) <ol><li> Cortar um segmento de 10 dente de pente de uma pente de cabelo normal. </li><li> Cortar uma fenda de cerca de 2-3 mm de largura e cerca de 5 mm de profundidade na parte superior do pente para aceitar um actuador 2-camada flexão rectangular. </li><li> Soldar um fio de cada uma das superfícies do actuador de flexão. Utilize a solda e fluxo fornecidos pelo fabricante. Cubra o atuador e solda com fita isolante para proteger o mouse eo usuário da corrente elétrica. </li><li> Deslizamento da tira de actuador na fenda cortada no pente de modo que a tira de actuador de flexão fica perpendicular ao plano do pente. Ângulo o pente para que ele está inclinado a 45 ° e mais naturalmente segue a curva do rosto do mouse. </li><li> Prender a extremidade da tira de actuador ao topo do pente com epoxi de secagem rápida. Nota: Os fios soldados à tira de dobra actuador deve ser ligada a um reóstato que liberta 40 volts para o actuador. As experiências anteriores demonstraram que a 40 volts é eficaz para o condicionamento mas não evoca qualquer resposta de sobressalto. </li><li> Coloque o actuador de flexão e o pente em uma montagem móvel. Um suporte de pipeta ligado a uma base magnética, como normalmente utilizado in vitro para electrofisiologia plataformas funciona bem. </li></ol> 3. Montagem do conector que monta para Rods acima do cilindro (Figura 2C, 2E) Nota: O conector é um 3-D impressa tira 7 buracos modelada a partir da faixa de nylon 221 séries Amphenol utilizado para a corda por Weiss e Disterhoft e Galvez et al 10,17. <ol><li> Toque no primeiro buraco na faixa para um 0-80 x-1&quot;Parafuso de máquina. Isto servirá como um parafuso de fixação para fixar a peça de cabeça para o conector. Juntar uma porca 0-80 para a cabeça do parafuso de fixação com cola cianoacrílico com o fim de facilitar a rodar o parafuso à mão. </li><li> Deixar um buraco vazio após o furo roscado (para permitir espaço para a porca 0-80 máquina) e empurre cinco bases relia-tac banhados a ouro através dos restantes cinco buracos. </li><li> Tira o revestimento fora cinco fios longos (fios obtidos a partir de um cabo Ethernet) e solda para as extremidades dos soquetes. Nota: Os dois primeiros fios irá ser utilizado para gravar os sinais de eletromiográficas (EMG) que irá detectar uma resposta eyeblink seguinte filtragem do sinal e amplificação a partir de um amplificador. O segundo dois vai entregar o sinal de choque de um isolador de estímulo. O último fio servirá como uma ligação à terra. Estes fios serão conectados aos sistemas utilizados para a entrega cronometrado CS-US. </li><li> Garantir a conectividade elétrica entre os fios e os sockets com um multiMeter. Coloque o multímetro na configuração da continuidade e segure uma das sondas para o pino e a outra sonda para as extremidades descarnadas do fio. Os pinos e os fios estão ligados electricamente quando a resistência é baixa e o multímetro emite um tom. <ol><li> Alternativamente, se o multímetro não tem uma configuração de continuidade, medir a resistência entre os pinos e os fios. Não há continuidade eléctrica se há muito pouca resistência medida. </li></ol></li><li> Prepare as asas do conector de dois para-220 transistores de estilo. Cortar os fios emissor, base e coletor do transistor e nivelar a superfície para que ele possa ser aposta no conector. </li><li> Cortar a borda da guia de montagem para violar o buraco para que o guia pode deslizar por baixo da cabeça do parafuso. </li><li> Epoxy os transistores ao conector. O furo na guia de montagem vai ser utilizado para fixar o conector para as hastes de cima do cilindro. </li><li> Aplicar epoxi à base de fios protruding a partir das tomadas e permitir que a epoxi seque. O epoxi vai isolar e proteger as ligações. </li></ol> 4. Preparar o capacete (Figura 2D, 2E) Nota: A tira capacete é um 3-D impressa tira 7 buracos modelada a partir da faixa de séries de nylon Amphenol 221 usado para o capacete por Weiss e Disterhoft e Galvez et al 10,17.. Esta parte não é mais fabricado comercialmente. O arquivo de impressora pode ser baixado do website do jornal. <ol><li> Toque no primeiro buraco na faixa para um parafuso de máquina 0-80 x 1 &quot;e deixar um buraco vazio após o primeiro buraco. </li><li> Empurrar cinco pinos banhados a ouro através da parte inferior dos restantes cinco furos (através das extremidades mais estreitas). Use um torno para facilitar empurrar os pinos para a faixa uniformemente. </li><li> Usando uma stripper térmica, remover cerca de 0,5 cm de poliimida revestimento fora da extremidade de um fio de aço inoxidável (0,005 pol. De diâmetro), soldar a extremidade descarnada do Wira para a abertura de um dos pinos e de cortar o fio para 0,6-0,7 cm. </li><li> Tira cerca de 0,2 cm a partir da extremidade do fio para permitir que a corrente passe para o animal. </li><li> Repita os passos de 4,3-4,4 para os restantes três fios. Nota: Os dois primeiros fios irá gravar as respostas EMG, enquanto os outros dois servirão para entregar um choque para o animal. </li><li> Como o último (quinto) do fio vai servir como um fio de terra, cortar cerca de 5 cm de arame de aço inoxidável não revestido (0,005 pol. De diâmetro), e solda para o pino restante. </li><li> Assegurar a continuidade entre os fios e os pinos com um multímetro. (No caso do fio de terra, que é não revestido, a sonda multímetro pode ser colocado em qualquer lugar ao longo do fio). </li></ol> 5. Preparação cirúrgica (Figura 2F) <ol><li> Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo o capacete. Esteriliza-se o capacete por imersão em álcool e, em seguida, a lavagem com solução salina estéril. </li><li> Anestesiar o mouse em uma câmara de indução com 3-4% vaporized isoflurano misturado com um caudal de 1-2 L de oxigénio por minuto. </li><li> Verificar que o animal é completamente anestesiado com uma pitada do dedo do pé. O mouse é totalmente anestesiado quando ele não responder reflexivamente a pitada dedo do pé. </li><li> Uma vez que o animal tenha sido completamente anestesiado, injectar uma dose de cloridrato de buprenorfina como um analgésico (0,05-2 mg / kg, sc), raspar o topo da cabeça do animal, colocar sobre uma almofada de aquecimento coberto na base da armação estereotáxica , verificar que o animal está completamente anestesiado, e proteger a cabeça para o quadro. Manter o fluxo de isoflurano vaporizado ao animal, alternando a 2% com um caudal de 1-2 L de oxigénio por minuto. Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica para as córneas. </li><li> Desinfectar o couro cabeludo com povidona-iodo e álcool três vezes cada, alternando entre os dois. </li><li> Com uma lâmina de número 10 ou 15 bisturi, fazer uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo, expondo o crânio a partir da parte dianteira do tele os olhos para além do osso do interparietal (~ 1,5-2 cm). </li><li> Segurar as abas de pele com micro clips. Coloque um grampo acima do olho, um ao longo do meio do eixo rostral-caudal, e um na parte posterior do crânio bilateralmente (isto é, seis usar grampos em tudo). A fim de evitar headpiece avulsão, expor tanto do crânio quanto possível, incluindo os lados e para trás. Isto irá aumentar a área de superfície para a aplicação da película de cimentação adesiva. </li><li> Usando o bisturi, raspagem ao longo da parte superior do crânio para remover o periósteo e assegurar uma superfície de trabalho limpo e seco. Limpar o topo do crânio com 3% de peróxido de hidrogénio três vezes. </li><li> Faça dois furos no crânio com um tamanho 34 burr cone invertido ou 1,6 milímetros fresa de gravar broca para aceitar 00-90 parafusos (0,0625 in. De comprimento). Os parafusos irá fornecer a ligação à terra. Coloque um orifício na frente de bregma, e o outro em frente da Lambda, à esquerda da linha média, quando o condicionamento do Right olho. Coloque um parafuso em cada buraco. Abaixe o parafuso de 0,28 mm no crânio para cada volta completa; duas voltas completas é suficiente. </li><li> Criar vários pequenos torrões de aproximadamente 0,75 mm de diâmetro sobre o crânio, a fim de aumentar a área da superfície e da força de preensão para o cimento. </li><li> Tome o capacete concluído e enrolar o fio terra em uma configuração em forma de oito em torno dos dois parafusos. Permitir alguma folga (~ 1,5 cm entre o capacete eo parafuso) no fio terra assim que o capacete pode ser posicionado corretamente mais tarde. Nota: O número oito geralmente garante uma boa conexão elétrica entre o fio e os parafusos de terra. O fio pode também ser soldado ao parafuso para garantir uma ligação eléctrica. </li><li> Aplicar o cimento cimentação adesiva. Siga as instruções do fabricante para a mistura do cimentação cimento cola ou misture 4 colheres de mix L-Pó, 8 gotas de base, e 2 gotas de catalisador em um prato de mistura de cerâmica fria (garantir a faixa de temperatura on o prato de mistura é completamente preto.) A temperatura fria estende o tempo de trabalho do cimento. <ol><li> Brasão do crânio e os parafusos liberalmente com o cimento resinoso e permitir que o cimento secar. Isto deve levar apenas alguns minutos. </li></ol></li><li> Depois que o cimento secar, coloque o capacete na vertical, com os pinos de pé, acima do crânio. Segurar o capacete no lugar com um suporte semelhante ao conector Nota: Consulte &quot;3. Montagem do conector&quot; O titular só precisa de ser uma faixa de cinco buraco com soquetes banhados a ouro, a fim de receber os pinos do capacete. O titular é anexado a um braço sobre o quadro estereotáxico. O uso do suporte e o braço facilita o posicionamento da peça de cabeça e os fios. </li><li> Após o capacete foi posicionado, descascar a pele ao redor da área periorbital e posicionar os dois fios de choque para permitir que os 0,2 cm extremidade descarnada para descansar debaixo da pele e cerca de 2-4 mm diretamente caudal ao eye. Não permita que as extremidades dos dois fios se toquem. Posicione os dois fios da EMG na muscularis orbicular dos olhos acima da órbita do olho. <ol><li> Se necessário, cortar as pontas dos fios se eles são demasiado longos e parece que eles podem arranhar diretamente a órbita e resultar em infecção. Se cortar as pontas do fio, certifique-se de que não é o suficiente fio desencapado exposto. Em alternativa, se os fios parecem muito tempo, dobrar o fio de volta para a base, onde elas se estendem para fora da peça de cabeça. </li><li> Cimento a base dos fios (ou seja, a extremidade mais próxima da peça de cabeça) no lugar sobre o crânio com um pequeno propagação do cimento cimentação adesiva e deixar secar (utilização metade da porção descrito anteriormente). </li></ol></li><li> Retire as micro grampos e gentilmente dobre as abas de pele para trás sobre o cimento. Permitir que a pele para resolver naturalmente para evitar a tensão em qualquer parte da pele, a fim de evitar distorções da pálpebra, a prevenção da resposta eyeblink,e sofrimento para o animal. </li><li> Selar a área exposta com cimento dental, abrangendo desde a incisão da pele para a borda de topo da peça de cabeça com cimento. Tome cuidado extra para evitar gotejamento de cimento sobre os olhos ou os pinos do capacete. Parcialmente cimento curado podem ser suavizadas e manipulados com um pedaço de algodão umedecido com solvente de cimento dental. Permitir que o cimento secar completamente antes de remover o suporte do capacete. </li><li> Permitir ao animal recuperar da anestesia em uma superfície aquecida antes de substituir o animal de volta em sua gaiola. Administrar Metacam (1 mg / kg, SQ) e, em seguida, colocar o animal de volta em sua gaiola. </li><li> Permitir que o animal 5-7 dias de recuperação antes do teste ou treinamento. Manter cuidados pós-operatórios padrão para o animal de acordo com as diretrizes da sua instituição. O animal deve ser verificado pelo menos uma vez por dia depois de ter recuperado de uma cirurgia. Atenção aos sinais de má alimentação e / ou beber e comportamento apático. Se a doré suspeita, fornecer Metacam cada 24 horas (mesma dose que no final de pós-cirurgia) até aliviado. A lidocaína pode ser aplicado localmente na ferida se o animal está se coçando ou apresenta sinais de desconforto. </li></ol> 6. Colocar o mouse sobre o cilindro e Formação (Figura 2G) <ol><li> Para colocar o mouse sobre o cilindro, conter o mouse com a mão brevemente, segurando-o pelo rabo com uma mão e, em seguida, segurando o mouse por trás dos ombros com o indicador e polegar com o outro. Enrole os dedos restantes ao redor do abdômen e tronco do mouse. </li><li> Com a mão não restringindo o mouse, conecte o conector para o capacete na cabeça do mouse e girar o parafuso de bloqueio. </li><li> Posicione o mouse suavemente no cilindro e segurá-la no lugar enquanto anexando o conector para o quadro. Use os dois parafusos para fixar o conector para as barras de cima do cilindro. </li><li> Uma vez que o conector tenha sido fixadas à estrutura do cilindro, release o domínio sobre o mouse. Dê o mouse de um dia duas sessões de habituação ao cilindro. Permitir que cada sessão de habituação a mesma duração que cada sessão condicionado. <ol><li> Ficha taxa de intermitência espontânea durante habituação e pré-expor os ratos para a vibração suiça CS, a fim de minimizar a ocorrência de respostas de alarme. Aplique o CS como durante uma sessão real condicionado, mas sem o choque eléctrico US. </li><li> Aplicar a estimulação whisker CS, colocando o sistema Piezo próximo (cerca de 0,5 cm) para o lado ar (do lado direito) do mouse, enquanto deslizando os dentes do pente sobre bigodes individuais. Certifique-se de que os mesmos bigodes são estimulados dia a dia, colocando o sistema Piezo na mesma posição de dia para dia. </li></ol></li><li> Começar a treinar o mouse sobre o condicionamento clássico. Entregar duas sessões de treinamento por dia durante cinco dias. Deixar cerca de duas horas entre cada sessão de treinamento. <ol><li> Para o grupo condicionado, deliver trinta ensaios por sessão de 250 ms de comprimento suiça vibração CS (60 Hz) emparelhado com um pulso elétrico 100 ms de comprimento EUA (0,3 mA - 3 mA, entregues a partir de um WPI A385R estímulo isolador). Separe o CS e os EUA com um ms longo intervalo de rastreamento 250 livre de estímulo para tornar a tarefa dependente do hipocampo (Figura 1) 23. </li><li> Ajustar a intensidade do choque eléctrico para cada animal, de modo que um piscar é evocado. ensaios separados com um intervalo inter aleatória de 30-60 segundos (média de 45 segundos, a duração total de 30 minutos por sessão.) </li><li> Deliver trinta CS desemparelhado isoladamente e nos sozinhos ensaios cada (para um total de sessenta ensaios) para o grupo pseudoconditioned, utilizando os mesmos parâmetros de estímulo como indicado para o grupo condicionado. Certifique-se de que o CS sozinho e US ensaios só são pseudorandomized tal que nenhum estímulo é apresentado mais de duas vezes consecutivas. Separe cada ensaio com um intervalo inter média de 22,5 seg. </li></ol></li><li> defígado ruído de fundo em 65 dB em toda a habituação e da formação, a fim de mascarar qualquer barulho da vibração gerada pelo estimulador triz. </li></ol>

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<li>Joachimsthaler, B., Brugger, D., Skodras, A., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+loss+in+primary+somatosensory+cortex+during+trace+eyeblink+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spine loss in primary somatosensory cortex during trace eyeblink conditioning.</a> J Neurosci. 35 (9), 3772-3781 (2015).</li>
<li>Boele, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+and+extracerebellar+involvement+in+mouse+eyeblink+conditioning%3A+the+ACDC+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model.</a> Front in Cell Neurosci. 3 (19), (2010).</li>
<li>Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+kinetic+and+frequency-domain+properties+of+eyelid+responses+in+mice+with+magnetic+distance+measurement+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique.</a> J Neurophysiol. 88 (4), 2124-2133 (2002).</li>
<li>Ward, R. L., Flores, L. C., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infragranular+barrel+cortex+activity+is+enhanced+with+learning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Infragranular barrel cortex activity is enhanced with learning.</a> J Neurophysiol. 108 (5), 1278-1287 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Classical eyeblink condicionado é uma forma de aprendizagem associativa que é uma ferramenta útil para a compreensão das bases neurais subjacentes à aprendizagem e memória. Os métodos anteriores empregues para o condicionamento de piscar de roedores, tais como ratinhos envolveu uma câmara que permitiu que o animal se mover livremente. A preparação fixa-cabeça para o condicionamento de piscar de ratinhos, usando o aparelho descrito por Chettih et ai. E Heiney et ai., E utilizados mais recentemente, em l...

condicionado piscar de olhos é uma forma de condicionamento pavloviano e um sistema modelo para investigar os mecanismos neurais de aprendizagem associativa e memória. Tem sido investigada em várias espécies, incluindo humanos, coelhos, gatos, ratos e ratinhos. O paradigma envolve a apresentação de dois estímulos emparelhados: um estímulo neutro condicionado (CS; por exemplo, um tom, um flash de luz, ou a estimulação whisker), e um estímulo incondicionado saliente (US; por exemplo, um sopro de ar para o olho, ou choque periorbital). Os EUA provoca uma incondicionada, a resposta eyeblink reflexiva (ou seja, UR). Eventualmente, após várias apresentações do emparelhado CS-US, o sujeito aprende a associar o CS com os EUA. Essa aprendizagem se manifesta sob a forma de uma resposta condicionada (CR), um piscar de olhos provocada pelo CS sozinho que precede a apresentação de os EUA. condicionado piscar de olhos, sob a forma de rastreamento inclui um intervalo livre de estímulo de poucos hmilissegundos undred que separa o CS e os EUA (Figura 1). Traço condicionado é uma forma de aprendizado declarativo, uma vez que requer consciência das contingências de estímulo 1. O intervalo temporal que requer o animal a manter um neural &#39;trace&#39; do CS em regiões frontais do cérebro, como o hipocampo para que os EUA e a CS a associar-se 1-6. Juntamente com as regiões do cérebro anterior, o condicionamento é também dependente do cerebelo 7. condicionado Eyeblink é, portanto, um paradigma útil para a investigação das múltiplas facetas da memória, incluindo a aquisição, consolidação e recuperação. Durante o condicionamento piscar de olhos, um grupo de animais de controlo é apresentada com estímulos desemparelhados por ordem aleatória para testar pseudoconditioning ou sensibilizados respostas ao CS que podem ser causadas por apresentação só nos EUA, em vez de uma associação aprendido CS-US. Um appara utilizadatus para a investigação de condicionamento de piscar de roedores é uma câmara em que os roedores estão autorizados a circular livremente durante o processo de formação 8-10. Com este tipo de dispositivo, um cabo é normalmente ligado a um capacete que está afixado ao crânio do roedor. A corda permite a entrega de os EUA (e por vezes, a CS) e para transmitir a resposta do animal aos estímulos (ou seja, a resposta de piscar) 10. O cabo pode ele próprio ser modificado com base no tipo de estímulos entregues e como a resposta eyeblink é gravado. A razão para usar &quot;livremente em movimento&quot; ratos amarrados para o condicionamento eyeblink é que os ratos lutar contra contenção. Apesar de outras espécies podem ser mais receptivos a contenção, a grande vantagem de usar ratinhos em experimentos de condicionamento eyeblink é que a maioria das estirpes mutantes geneticamente modificados estão disponíveis estirpes de ratinho. Além lutam, res completostraint de ratos resulta em sofrimento agudo. Uma preparação rato fixo-cabeça que minimiza o stress aumentaria a informação fisiológica que pode ser obtida durante o condicionamento piscar de olhos. Por exemplo, este sistema permitiria imagens de neurônios corticais com microscopia de dois fótons de 11. Preparações fixo de cabeça têm sido usados ​​em experiências anteriores para imagiologia óptica do córtex através de implantes cranianos removíveis, in vivo registos electrofisiolicos do cérebro de roedores com matrizes tetrode, imagem de cálcio de dois fotões, e também como uma plataforma para o condicionamento de piscar de ratinhos 11 -16. No sistema fixo-cabeça, estimulação e gravações de confiança são assegurados sem restrição completa do mouse (Figura 2). Um capacete como o usado no sistema movendo-se livremente é afixada ao crânio do mouse. Durante o treinamento, o capacete é afixada a um conector que está ligado a bares maisuma esteira cilíndrica, a fim de estabilizar a cabeça do roedor (Figura 2A). A esteira cilíndrica permite que o mouse para descansar confortavelmente, mas se o mouse assim o desejar, também permite que ele seja executado ou a andar. Com a utilização deste sistema, os ratos podem ser formados com uma vibração suiça como o CS e um choque eléctrico suave periorbital como os EUA (Figura 1). Os EUA é entregue através de fios cirurgicamente colocado debaixo da pele lateral, para o olho. O CS é entregue através de um pente que é ligado a um actuador 2-camada flexão rectangular (Figura 2B). O pente e flexão do actuador são, então, ligado a uma base magnética que é movido para a posição adequada durante o treino, e é ajustada para entrega ideal para cada animal individual. O pente está posicionada para escarranchar os bigodes selecionados. Durante a entrega do CS, é enviado um sinal para o actuador de flexão que desloca o pente e leva a vibração dos bigodes 17. 16,18,19. A estimulação suiça razão é escolhida para o CS neste paradigma experimental, é a dependência de animais de murino na sua vibrissas para a entrada de informação somatossensorial durante a exploração. Estimulação suiça foi demonstrado ser um fiável e eficaz CS 20. Além disso, dado o substrato cortical bem estabelecida e organizada do sistema vibrissae (ou seja, o córtex barril), a estimulação suiça como o CS fornece uma ferramenta elegante para mapear alterações corticais e plasticidade associados com a aprendizagem eyeblink condicionado 20,21. Um sistema fixo-cabeça permite a estimulação precisa de bigodes selecionados para comparar as respostas entre os neurônios e neurônios que recebem entradas de bigodes não estimuladas estimuladas. Finalmente, muitas linhagens de camundongos apresentam perda auditiva relacionada à idade como adultos relativamente jovens <sup&gt; 22, e fechamento das pálpebras durante o piscar condicionado altera a CS visual (embora um CS visuais faz melhorar questões com respostas de sobressalto 16). suiça estimulação não é afectada por qualquer uma destas complicações. Aqui apresentados são modificações únicas e importantes sobre outras preparações fixo-cabeça para o condicionamento piscar de olhos, incluindo métodos de entrega CS e US, bem como a aquisição da resposta eyeblink. A confiabilidade deste aparelho eo paradigma de formação no condicionamento eyeblink é demonstrado pelas curvas de ratos condicionados e uma curva de aprendizagem relativamente plana de animais de controle pseudoconditioned (Figura 7A) de aprendizagem.

<table><tbody><tr><td>Rolo de Espuma TeraNova Exervo 36" x 6"&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>B002ONUM0E</td><td>Para cilindro</td></tr><tr><td>de Plexiglas</td><td></td><td></td><td>Feito sob medida;</td></tr><tr><td>Varetas de Metal de 1 cm de espessura (12.7&nbsp; mm de diâmetro)</td><td></td><td></td> Parafuso <td>de máquina 4-40 feito sob medida</td></tr><tr><td>(.25&nbsp; em. longo)</td><td>Amazon Supply</td><td>B00F33Q8QO</td><td>Para cilindro</td></tr><tr><td>Design Clássico Pente de Cabelo</td><td>Conair</td><td>93505WG-320</td><td>Para estimulação de bigode</td></tr><tr><td>Atuador de Dobra Retangular de 2 Camadas</td><td>Piezo Systems</td><td>T220-A4-303X&nbsp;</td><td>Para estimulação do bigode</td></tr><tr><td>Kit de solda e fluxo</td><td>Sistemas piezoelétricos</td><td>MSF-003-NI</td><td>Para estimulação do bigode</td></tr><tr><td>Base magnética</td><td>Thor Labs</td><td>MB175</td><td>Para estimulação do bigode</td></tr><tr><td>Haste roscada para base</td><td></td><td></td> magnética <td>Tiras feitas</td></tr><tr><td>sob medida com base em conectores de tira de nylon da série 221 da Electronic Connector Corp.</td><td></td><td></td><td>Feito sob medida, baseado em Weiss e Disterhoft,</td></tr><tr><td>Transistor Estilo TO-220</td> 2008 <td>Amazon Supply</td><td>B0002ZPZYO&nbsp;</td><td>Para conector; para as asas</td></tr><tr><td>Soquetes Relia-Tac Conector</td><td>Eletrônico Corp.</td><td>220-S02</td><td>Para conector</td></tr><tr><td>Relia-Tac Pins</td><td>Electronic Connector Corp.</td><td>220-P02</td><td>Para cabeça</td></tr><tr><td>0-80 parafuso de máquina de aço inoxidável (1 pol. de comprimento)</td> Parafuso <td>de</td><td>Bloqueio</td> <td>Amazon Supply</td></tr><tr><td>B000FN68EE 0-80 parafuso de máquina de aço inoxidável porca sextavada (5/32 pol. de espessura)</td> <td>Amazon Supply</td><td>B000N2TK7Y</td><td>Cabeça de Parafuso</td></tr><tr><td>de Travamento Loctite Super Cola-Loctite Líquida</td><td></td><td>1365896</td><td>Cola cianoacrílica; para o parafuso de travamento</td></tr><tr><td>Ajuste Rápido Epoxy</td><td>Ace Hardware</td><td>18613</td><td>Para sistema de estimulação de conector e bigode</td></tr><tr><td>Fios de</td><td></td><td></td> Cabo Ethernet <td>O cabo Ethernet pode ser desmontado para usar os fios individuais para o conector</td></tr><tr><td>Fios de aço inoxidável revestidos com poliimida (2&nbsp; em. de comprimento, 0,005 pol. diâmetro)</td><td>PlasticsOne</td><td>005sw/2.0 37365 S-S&nbsp;</td><td>Para antena, EMG e fios de choque</td></tr><tr><td>Fio de aço inoxidável não revestido (.005&nbsp; em. diâmetro)</td> <td>AM Systems</td><td>792800</td><td>Para capacete, fios terra</td></tr><tr><td>Tenma Autotransformador Variável</td><td>Tenma</td><td>72-110</td><td>Para a estimulação do bigode; reostato para ajustar a corrente para o atuador de flexão</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>A-M Systems</td><td>1700</td><td>Amplificador para filtrar e amplificar sinais EMG</td></tr><tr><td>WPI A385R isolador de estímulo World</td><td>Precision Instruments</td><td>31405</td><td>Para o choque elétrico</td></tr><tr><td>Isothesia (Isoflurano)</td><td>Henry Schein: Saúde Animal</td><td>50031</td><td>Para cirurgia; anestesia</td></tr><tr><td>Buprenex Injetável CIII</td><td>Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>Para cirurgia; analgésico</td></tr><tr><td>Akwa Tears: Lubrificante Pomada Oftálmica&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td>Pomada lacrimal artificial para prevenir olhos secos enquanto sob anestesia</td></tr><tr><td>Almofadas de Preparação de Povidina-Iodo</td><td>PDI</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td>Para cirurgia; Almofadas</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de Preparação de Álcool antisséptico <td>Podem ser compradas em qualquer farmácia padrão</td></tr><tr><td>Cabos de bisturi cirúrgico de aço inoxidável (no.3)</td><td>Integra Miltex&nbsp;</td><td>4-7.Para</td> <td>cirurgia</td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi cirúrgico de aço inoxidável</td><td>Integra Miltex</td><td>4-310 ou 4-315</td><td>Para cirurgia; lâmina de bisturi número 10 ou 15</td></tr> 3<tr><td>% de Peróxido de</td><td></td><td></td> Hidrogênio <td>Pode ser comprado de qualquer farmácia padrão</td></tr><tr><td>Micro Clip</td><td>Roboz</td><td>RS-5459</td><td>Para cirurgia, para segurar a pele</td></tr><tr><td>00-90 parafuso de máquina de aço inoxidável (0.0625&nbsp; em. longo)</td><td>Amazon Supply</td><td>B002SG89X4&nbsp;</td><td>Para cirurgia, para enrolar o fio terra ao redor</td></tr><tr><td>Ferramenta rotativa profissional</td><td>Walnut Hollow</td><td>29637</td><td>Broca manual para cirurgia, para fazer furos no crânio</td></tr><tr><td>Rebarba de cone invertido</td><td>Roboz</td><td>RS-6282C-34</td><td>Tamanho da rebarba de cone invertido 34; para cirurgia, para fazer furos no crânio</td></tr><tr><td>Broca de corte de gravação</td><td>Dremel</td><td>106</td><td>Cortador de gravura; broca de 1,6 mm; para cirurgia, para fazer furos no crânio</td></tr><tr><td>C & B Metabond-Rápido! Sistema de cimento "B" Base Rápida</td><td>Parkell</td><td>S398</td><td>Para cirurgia; sistema de cimento cimentante adesivo; importante para evitar a avulsão</td></tr><tr><td>do capacete C & B Metabond-Rápido! Sistema de cimento L-Powder</td><td>transparente Parkell</td><td>S399</td><td>Para cirurgia; sistema de cimento de cimentação adesiva; importante para evitar a avulsão</td></tr><tr><td>do capacete C & B Metabond-Rápido! Catalizador universal 0,7 ml</td><td>Parkell</td><td>S371</td> do sistema "C" <td>TBB do cimento Para a cirurgia; sistema de cimento de cimentação adesiva; importante impedir a avulsão</td></tr><tr><td>C& do headpiece B Metabond-Rápido! Sistema de Cimento Prato de Mistura de Cerâmica com faixa de temperatura</td><td>Parkell</td><td>S387</td><td>Para cirurgia; sistema de cimento de cimentação com adesivo; importante para prevenir a avulsão do capacete</td></tr><tr><td>Pinças Suíças, estilo #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>504506</td><td>Para cirurgia</td></tr><tr><td>Aplicadores Puritanos com Ponta de Algodão</td><td>VWR International</td><td>10806-005&nbsp;</td><td>Para cirurgia</td></tr><tr><td>Kit de cimento de aperto de calafetagem dental</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>Para cirurgia; cimento dental</td></tr></tbody></table>

sinalizado-bigode eyeblink condicionamento clássico em ratos fixo-cabeça

Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice

O condicionamento do piscar de olhos é um paradigma comum para investigar os mecanismos neurais subjacentes ao aprendizado e à memória. Para melhor utilizar o extenso repertório de técnicas científicas disponíveis para estudar o aprendizado e a memória no nível celular, é ideal ter uma plataforma craniana estável. Como os camundongos não toleram prontamente a contenção, eles geralmente são treinados enquanto se movem livremente em uma câmara. As informações de estímulo condicionado (CS) e estímulo incondicionado (US) são fornecidas e as respostas de piscar de olhos são registradas por meio de uma corda conectada à cabeça do mouse. No aparelho de cabeça fixa apresentado aqui, os ratos podem correr como quiserem enquanto suas cabeças estão presas para facilitar a experimentação. O condicionamento confiável da resposta ao piscar de olhos é obtido com este aparelho de treinamento, que permite a administração de estimulação do bigode como o CS, um choque elétrico periorbital como o US e a análise da atividade eletromiográfica (EMG) da pálpebra para detectar respostas ao piscar.

8-10 semana do sexo masculino de idade ratinhos C57BL6 / J foram treinados sobre trace eyeblink condicionado no aparelho esteira cilíndrico fixo-cabeça. 8 ratos foram treinados com apresentações emparelhadas CS-americanos (grupo condicionado) e 9 ratos foram treinados com apresentações CS e US desemparelhados (grupo pseudoconditioned). Exemplo EMG gravações de uma resposta condicionada de um ratinho condicionados são apresenta...

A preparação apresentada aqui para o condicionamento do piscar de olhos sinalizado pelo bigode em camundongos com a cabeça fixa estimula precisamente bigodes específicos, permitindo que os camundongos deambulem em uma esteira cilíndrica. Um estímulo condicionado de estimulação de bigode (CS) emparelhado com um estímulo incondicionado de choque periorbital (US) resulta em aprendizado associativo confiável neste aparelho.

sinalizado-Bigode Eyeblink condicionamento clássico em Ratos fixo-Cabeça

Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive ...

O objetivo geral deste protocolo é utilizar os avanços genéticos em camundongos e nosso entendimento do sistema de vibrissas para investigar a base neurobiológica do condicionamento do reflexo palpebral, um paradigma passível de transposição para o estudo da aprendizagem e da memória. Este método pode ajudar a responder questões mecanicistas sobre aprendizagem e memória por meio de imageamento de cálcio e eletrofisiologia em camundongos geneticamente manipulados, enquanto estimula vibrissas específicas durante o condicionamento. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de fixar a cabeça dos camundongos minimizando o estresse, permitindo que os animais se desloquem em seu próprio ritmo sobre uma esteira cilíndrica.As implicações dessa técnica estendem-se a tratamentos potenciais para déficits de memória, incluindo aqueles associados ao envelhecimento normal e à doença de Alzheimer. A preparação do cilindro e do sistema de estimulação dos vibrissas são abordadas no protocolo textual. Esta seção aborda a preparação da peça craniana.A tira do conector é uma tira moldada de sete furos impressa em 3D, baseada na tira de náilon da série Amphenol 221, que já não é mais fabricada comercialmente. A partir da peça impressa em 3D, rosqueie o primeiro furo para um parafuso mecânico de 0-80 por uma polegada e deixe um furo vazio após o primeiro furo. Em seguida, utilizando um torno de bancada, insira cinco pinos banhados a ouro nos cinco furos restantes.Insira os pinos através dos orifícios mais estreitos do plástico. Em seguida, utilizando um descarnador térmico, remova meio centímetro do revestimento de poliimida. Depois, solde a extremidade descarnada a um dos pinos onde houver uma abertura.Corte o fio soldado entre seis e sete milímetros e descasque cerca de dois milímetros do fio. Agora, repita este processo para fixar quatro fios no total aos cinco pinos. Os dois primeiros fios registrarão respostas de EMG da pálpebra, enquanto os dois seguintes fornecerão estimulação elétrica à região periorbital.Na quinta pino, solde um fio de aço inoxidável descoberto de cinco centímetros para servir como terra elétrico. Após fazer todas as conexões, verifique cada uma delas com um multímetro para garantir a continuidade elétrica. Comece com um animal completamente anestesiado, confirmado por um aperto no dedo do pé.Administre uma dose de cloridrato de buprenorfina como analgésico. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica nas córneas e retire os pelos da parte superior da cabeça do animal. A seguir, fixe a cabeça do animal em um estereotáxico e desinfete o couro cabeludo com três esfregaços alternados de iodopovidona e álcool.Com uma lâmina de bisturi número 10 ou 15, faça uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo, expondo o crânio desde a frente dos olhos até além do osso interparietal. Retraia os retalhos de pele com seis microclips, expondo o máximo possível do crânio, incluindo os lados e a parte posterior. Em seguida, use o bisturi para remover o periósteo do crânio.Em seguida, limpe a parte superior do crânio com peróxido de hidrogênio a 3% três vezes. Após o crânio estar seco, faça dois orifícios com uma broca cônica invertida nº 34, tomando cuidado para não danificar o cérebro. Posicione um orifício à frente do bregma e o outro à frente do lambda, à esquerda da linha média ao condicionar o olho direito, ou vice-versa.Esses orifícios devem ser perfurados com cuidado para acomodar os parafusos, e deve-se fazer um grande esforço para não danificar o cérebro. Nos orifícios, coloque parafusos para as conexões elétricas. Cada volta completa abaixa o parafuso em 0,28 milímetros, portanto duas voltas completas são suficientes.Em seguida, crie várias pequenas reentrâncias no crânio para aumentar a área de superfície para a cimentação. A partir da peça craniana concluída, enrole o fio de terra em uma configuração em forma de oito ao redor dos dois parafusos. Deixe alguma folga no fio de terra para que a peça craniana possa ser posicionada corretamente.Agora, aplique o cimento de fixação frio. Cubra abundantemente o crânio e os parafusos e deixe o cimento secar. Após a secagem do cimento, posicione a peça craniana verticalmente, com os pinos voltados para cima, acima do crânio.Fixe a peça craniana com um suporte preso a um braço do quadro. O suporte deve ter cinco soquetes revestidos a ouro para receber os pinos da peça craniana. Posicione os dois fios de EMG sobre o músculo orbicular dos olhos acima da órbita ocular.Em seguida, posicione os dois fios estimuladores. Coloque as extremidades descascadas sob a pele, de dois a quatro milímetros diretamente caudal ao olho. Não permita que as extremidades deles se toquem.Se os fios forem tão longos que possam arranhar o olho do animal, corte-os ou dobre-os para trás. Uma pequena parte do fio nu deve permanecer exposta. Agora, fixe a base dos fios ao crânio com um pouco mais de cimento luting e deixe secar.Use cerca de metade do volume anteriormente utilizado. Para prosseguir, remova os microclips e reposicione a pele. Deixe a pele acomodar-se naturalmente para evitar tensão que distorceria a pálpebra, inibindo o piscar e, consequentemente, comprometendo o experimento.Uma vez que a pele esteja acomodada, remova o suporte do dispositivo craniano e selar a área exposta com cimento dental. Evite gotejar cimento nos olhos ou nos pinos do dispositivo craniano. Em seguida, use um cotonete umedecido com solvente de cimento dental para alisar e moldar o cimento parcialmente curado conforme necessário.Uma vez que o cimento tenha secado completamente, retire o animal do estereotáxico e permita que ele se recupere sobre uma superfície aquecida antes de devolvê-lo à sua gaiola de origem. Inicie a habituação dos camundongos após eles terem tido pelo menos cinco dias de tempo de recuperação. Para imobilizar o camundongo, segure-o brevemente pela cauda para prendê-lo atrás dos ombros.Em seguida, levante o camundongo por baixo do abdômen e do tronco. Depois, acople um conector à peça craniana e aperte o parafuso de travamento. Em seguida, coloque o camundongo suavemente sobre o cilindro e mantenha-o imóvel enquanto usa dois parafusos para fixar o conector nas barras acima do cilindro.Em seguida, solte o camundongo. Nas duas primeiras sessões, permita que o camundongo se habitue ao cilindro pelo mesmo período de tempo de uma sessão de condicionamento. Durante a habituação, registre a frequência espontânea de piscadas.Além disso, exponha previamente os camundongos ao estimulador de vibração dos vibrissas sem aplicar estimulação elétrica. Com o sistema piezo próximo ao lado condicionado, passe os dentes do pente sobre os vibrissas individuais. Selecione os mesmos vibrissas em todas as sessões.Em seguida, prossiga com o treinamento de condicionamento clássico conforme apresentado no texto. Camundongos machos C57 Black 6J com idade entre oito e dez semanas foram treinados com condicionamento de piscar de olhos com intervalo na esteira cilíndrica com cabeça fixada. Foram realizados registros de EMG de cada ensaio.Os EMGs foram retificados e integrados com uma constante de tempo de 10 milissegundos, e depois foram médias entre todos os ensaios. A evolução das respostas condicionadas ao longo de 10 sessões de treinamento mostra que gradualmente a resposta aumentou em amplitude e a latência da resposta tornou-se mais curta. Essa evolução não é observada nas respostas dos camundongos pseudocondicionados, nos quais os estímulos são apresentados em ordem aleatória.A evolução de respostas condicionadas bem sincronizadas, e portanto bem aprendidas, também pode ser observada nos histogramas do tempo até o pico da resposta após o início do CS. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar a peça craniana, implantar cirurgicamente a peça craniana em um camundongo e posicionar o camundongo na esteira cilíndrica, para o condicionamento do reflexo palpebral com a cabeça fixada. Seus camundongos devem apresentar uma boa curva de aprendizado ao longo dos dias à medida que adquirem o condicionamento.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de permanecer atento à observação de qualquer sinal de desconforto nos animais. Devem ser tomadas medidas apropriadas para minimizar o estresse dos animais.

whisker-signaled-eyeblink-classical-conditioning-in-head-fixed-mice

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Este protocolo descreve como silenciar temporária e remotamente a atividade neuronal em regiões cerebrais discretas enquanto os ratos estão envolvidos em tarefas de aprendizado e memória. A abordagem combina farmacogenética (Designer-Receptors-Exclusivamente-Ativados-por-Designer-Drugs) com um paradigma comportamental (pré-condicionamento sensorial) que é projetado para distinguir entre diferentes componentes de aprendizagem.

Um método para a atividade neural remotamente Silenciando em Roedores Durante fases distintas de Aprendizagem

Condicionamento de rastreamento eyeblink clássico (ECC) foi utilizado para avaliar aprendizagem associativa de hipocampo-dependente em ratos adultos que foram administrados uma alta concentração (11,9% v/v) de álcool durante o desenvolvimento cerebral neonatal precoce. Em geral, procedimentos ECC são som ferramentas de diagnóstico para a detecção de disfunção cerebral em muitas configurações psicológicas e biomédicas.

O uso do condicionamento de rastreamento Eyeblink clássico para avaliar disfunção Hippocampal em um modelo do rato de transtornos do espectro do álcool Fetal

O desenvolvimento de novas estratégias de refinamento para ratos de laboratório é uma tarefa desafiadora que contribui para o cumprimento do princípio 3R. Este protocolo introduz o treinamento com clicker como um programa de enriquecimento cognitivo para ratos de laboratório.

Apresentando Clicker Formação como um enriquecimento cognitivo para Laboratório Mice

Este protocolo descreve um eyeblink condicionado paradigma adequada para experiências com crianças de um ano de idade. Equipamento comercial ou feitos sob medido pode ser usado para entregar os estímulos, e análise e coleta de dados devem ser realizadas sobre as gravações de vídeo.

Condicionamento clássico curto-atraso Eyeblink em crianças de um ano de idade

Descrito aqui é um novo sistema experimental automatizado que oferece uma alternativa ao teste de três câmaras e também resolve várias ressalvas. Este sistema fornece múltiplos parâmetros comportamentais que permitem uma análise rigorosa da dinâmica comportamental de pequenos roedores durante os testes de preferência de preferência social e novidade social.

Um sistema para acompanhar a dinâmica do comportamento de preferência social em pequenos roedores

Desenvolvemos uma única plataforma para rastrear o comportamento animal durante duas tarefas de aprendizagem associativa dependentes de fibras. O design de baixo custo permite a integração com experimentos optogenéticos ou de imagem direcionados à atividade cerebelar associada à fibra.

Uma plataforma flexível para monitorar o aprendizado associativo sensorial dependente do cerebellum

Para estudar comportamentos de voo em um contexto de medo, introduzimos um protocolo modificado de condicionamento do medo. Esse protocolo garante que os camundongos exibam consistentemente comportamentos de voo durante a apresentação da pista no condicionamento do medo.

Condicionamento de medo modificado para induzir comportamentos de voo em camundongos

O paradigma do medo observacional avalia o congelamento vicário em roedores como um modelo de empatia afetiva. Este procedimento envolve a exposição de roedores observadores a demonstradores coespecíficos que recebem choques aversivos nas patas para provocar respostas empáticas de congelamento. Ao empregar ensaios observacionais de medo, os pesquisadores podem investigar os mecanismos neurais subjacentes à empatia afetiva.

Medo observacional como modelo de empatia afetiva em camundongos

Este protocolo fornece um método para rastrear o estrabismo ocular automatizado em roedores ao longo do tempo de maneira compatível com o bloqueio de tempo para medidas neurofisiológicas. Espera-se que este protocolo seja útil para pesquisadores que estudam mecanismos de distúrbios dolorosos, como a enxaqueca.

Um método automatizado de estrabismo para comportamento de sincronização de tempo e dinâmica cerebral em estudos de dor em camundongos

O protocolo descreve como medir a resposta optomotora em esquilos terrestres de 13 linhas, uma espécie dominante de cone com características retinianas semelhantes à mácula humana. O design da plataforma melhora o manuseio e reduz a ansiedade, melhorando a capacidade do animal de permanecer na plataforma elevada, permitindo uma avaliação não invasiva das alterações na função visual.

Contenção animal não aversiva que permite o registro do reflexo optomotor em esquilos terrestres

Aprenda o condicionamento clássico do reflexo de piscar sinalizado por bigodes em camundongos de cabeça fixa. Este método permite estudar os mecanismos neurobiológicos da aprendizagem e memória com imagem de cálcio e eletrofisiologia.

sinalizado-Bigode Eyeblink condicionamento clássico em Ratos fixo-Cabeça

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