sinalizado-Bigode Eyeblink condicionamento clássico em Ratos fixo-Cabeça

O objetivo geral deste protocolo é usar os avanços genéticos em camundongos e nossa compreensão do sistema de bigode para investigar a base neurobiológica do condicionamento do piscar de olhos, um paradigma traduzível para estudar o aprendizado e a memória. Este método pode ajudar a responder a questões mecanicistas de aprendizagem e memória usando imagens de cálcio e eletrofisiologia em camundongos geneticamente manipulados, enquanto estimula bigodes específicos durante o condicionamento. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de proteger as cabeças dos camundongos enquanto minimiza o estresse, permitindo que os camundongos deambulem em seu próprio ritmo em uma esteira cilíndrica.

As implicações dessa técnica se estendem a possíveis tratamentos para deficiências de memória, incluindo aquelas associadas ao envelhecimento normal e à doença de Alzheimer. A preparação do cilindro e o sistema de estimulação do bigode são abordados no protocolo de texto. Esta seção cobre a preparação do capacete.

A tira do capacete é uma tira de sete furos impressa em 3D modelada a partir da tira de nylon da série Amphenol 221 que não é mais fabricada comercialmente. A partir da peça impressa em 3D, bata no primeiro orifício na tira para o parafuso de máquina de 0 a 80 por uma polegada e deixe um orifício vazio após o primeiro orifício. Em seguida, usando um torno, coloque cinco pinos banhados a ouro nos cinco orifícios restantes.

Empurre os pinos pelos orifícios mais estreitos do plástico. Em seguida, usando um decapante térmico, retire meio centímetro de revestimento de poliimida. Em seguida, solde a extremidade descascada em um dos pinos onde o pino tem uma abertura.

Corte o fio soldado entre seis e sete milímetros e descasque cerca de dois milímetros do fio. Agora, repita esse processo para conectar quatro fios no total aos cinco pinos. Os dois primeiros fios registrarão as respostas EMG das pálpebras, enquanto os dois segundos fornecerão estimulação elétrica à região periorbital.

No quinto pino, solde um fio de aço inoxidável não isolado de cinco centímetros para servir como aterramento elétrico. Depois de fazer todas as conexões, verifique cada uma delas com um multímetro para garantir sua continuidade elétrica. Comece com um animal totalmente anestesiado, confirmado por uma pitada no dedo do pé.

Injete uma dose de cloridrato de buprenorfina como analgésico. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica nas córneas e raspe o topo da cabeça do animal. Em seguida, prenda a cabeça do animal em uma estrutura estereotáxica e desinfete o couro cabeludo com três esfoliações alternadas de iodopovidona e álcool.

Com uma lâmina de bisturi número 10 ou 15, faça uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo, expondo o crânio da frente dos olhos até o osso interparietal. Retraia as abas da pele com seis microclipes, expondo o máximo possível do crânio, incluindo os lados e as costas. Em seguida, use o bisturi para raspar o perióstio do crânio.

Em seguida, limpe a parte superior do crânio com peróxido de hidrogênio a 3% três vezes. Depois que o crânio secar, faça dois furos com uma broca cônica invertida tamanho 34, tomando cuidado para não danificar o cérebro. Coloque um orifício na frente de bregma e coloque o outro orifício na frente de lambda, à esquerda da linha média ao condicionar o olho direito, ou vice-versa.

Esses orifícios devem ser feitos com cuidado para encaixar os parafusos, e um grande esforço deve ser feito para não danificar o cérebro. Nos orifícios, coloque parafusos para as conexões elétricas. Cada volta completa abaixará o parafuso em 0,28 milímetros, portanto, duas voltas completas são suficientes.

Em seguida, crie várias pequenas divits no crânio para aumentar a área de superfície do cimento. A partir do capacete completo, enrole o fio terra em uma configuração em forma de oito em torno dos dois parafusos. Deixe alguma folga no fio terra para que o capacete possa ser posicionado corretamente.

Agora, aplique cimento de cimentação frio. Cubra o crânio e os parafusos generosamente e deixe o cimento secar. Depois que o cimento estiver seco, posicione o capacete verticalmente, com os pinos acima do crânio.

Prenda o capacete com um suporte preso a um braço da estrutura. O suporte deve ter cinco soquetes banhados a ouro para aceitar os pinos do capacete. Posicione os dois fios EMG na muscular orbicular do olho acima da órbita ocular.

Em seguida, posicione os dois fios estimulantes. Coloque as pontas descascadas sob a pele de dois a quatro milímetros diretamente caudais ao olho. Não deixe que suas pontas se toquem.

Se os fios forem tão longos que possam arranhar o olho do animal, corte-os ou dobre-os para trás. Algum fio desencapado deve permanecer exposto. Agora, cimente a base dos fios no crânio com um pouco mais de cimento e deixe secar.

Use cerca de metade do volume usado anteriormente. Para prosseguir, remova os microclipes e reposicione a pele. Deixe a pele assentar naturalmente para evitar tensão na pele que distorceria a pálpebra, inibindo o piscar e, assim, arruinando o experimento.

Assim que a pele estiver assentada, remova o suporte do capacete e sele a área exposta com cimento dentário. Evite pingar cimento nos olhos ou nos pinos do capacete. Em seguida, use um cotonete umedecido com solvente de cimento dental para alisar e manipular o cimento parcialmente curado conforme necessário.

Assim que o cimento secar completamente, remova o animal da estrutura estereotáxica e deixe-o se recuperar em uma superfície quente antes de devolvê-lo à sua gaiola de origem. Comece a habituar os ratos depois que eles tiverem pelo menos cinco dias de recuperação. Para prender o mouse, prenda-o brevemente pela cauda para prendê-lo atrás dos ombros.

Em seguida, levante o mouse sob o abdômen e o tronco. Em seguida, conecte um conector ao capacete e gire o parafuso de travamento. Em seguida, coloque o mouse suavemente no cilindro e segure-o enquanto usa dois parafusos para prender o conector às barras acima do cilindro.

Em seguida, solte o mouse. Nas duas primeiras sessões, deixe o mouse se habituar ao cilindro pelo mesmo período de tempo de uma sessão de condicionamento. Durante a habituação, registre a taxa de piscar espontâneo.

Além disso, pré-exponha os ratos ao estimulador de vibração do bigode sem aplicar estimulação elétrica. Com o sistema piezoelétrico próximo ao lado condicionado, deslize os dentes do pente sobre os bigodes individuais. Selecione os mesmos bigodes para cada sessão.

Em seguida, prossiga com o treinamento de condicionamento clássico, conforme apresentado no texto. Camundongos C57 Black 6J machos de oito a dez semanas de idade foram treinados com condicionamento de piscar de olhos na esteira cilíndrica com cabeça fixa. Foram feitas gravações EMG de cada ensaio.

Os EMGs foram retificados e integrados com uma constante de tempo de 10 milissegundos e, em seguida, calculados em média em todos os ensaios. A evolução das respostas condicionadas ao longo de 10 sessões de treinamento mostra que, gradualmente, a resposta foi aumentando em amplitude e a latência da resposta tornou-se mais curta. Essa evolução não é observada nas respostas dos camundongos pseudocondicionados, onde os estímulos são apresentados em ordem aleatória.

A evolução de respostas condicionadas bem cronometradas e, portanto, bem aprendidas, também pode ser vista nos histogramas do tempo até o pico da resposta após o início da CS. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como preparar o capacete, implantá-lo cirurgicamente em um mouse e colocá-lo na esteira cilíndrica, para condicionamento do piscar dos olhos fixo. Seus ratos devem exibir uma boa curva de aprendizado ao longo dos dias à medida que adquirem o condicionamento.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de permanecer vigilante ao observar qualquer angústia dos animais. Devem ser tomadas medidas adequadas para minimizar o stress dos animais.