Name: O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprenda a caracterizar células T foliculares auxiliares, células B de centro germinativo e plasmócitos por citometria de fluxo no modelo induzível BM12 de LES em camundongos C57BL/6. Este método permite estudar a progressão da doença em linhagens transgênicas.

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Este trabalho foi apoiado em parte pelo Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (para EMJ) e Albert J. Ryan Fellowship (para JK). Somos gratos pelo apoio e instrumentação fornecidos pelo Núcleo de Citometria de Fluxo de Pesquisa na Divisão de Reumatologia do Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati, apoiado em parte pelo NIH AR-47363, NIH DK78392 e NIH DK90971.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O modelo induzível BM12 é uma maneira relativamente fácil e eficiente para estudar os processos celulares e moleculares do LES. A activação crónica de células T CD4 adoptivamente transferidos dirigidos contra auto-antigénios conduz à acumulação de TFH, GC células B, e células de plasma que pode ser medido por citometria de fluxo, tal como descrito aqui. Estudos futuros utilizando este modelo pode rapidamente e facilmente interrogar o papel dos genes candidatos e novas terapias nos processos centros germinativos auto-imu...

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune caracterizada complexo prototipicamente pelo anticorpo anti-nuclear (ANA) produção e glomerulonefrite. Numerosas outras sequelas, incluindo dérmica, cardio-pulmonar, lesões hepáticas e estão associados com a doença em alguns indivíduos. As estimativas de prevalência em os EUA variam muito, desde 150,000-1,500,000 1,2, com particular incidência em alta mulheres e minorias 3. Embora a etiologia do LES tem sido difícil de discernir, pensa-se que surgem a partir da interação de vários fatores genéticos e ambientais, que culminam na auto-imunidade sistêmica. Inúmeros modelos animais têm sido empregados para fatores que levam ao início da doença e progressão estudar. Modelos clássicos de rato de SLE incluem estirpes de ratos geneticamente predispostos incluindo o NZB x NZW F1 modelo e os seus derivados, o NZM MLR / lpr estirpe, e a estirpe BXSB / Yaa e os sistemas indutíveis, tais como o pristane e modelos 4 doença crônica do enxerto-versus-hospedeiro (DECHc). Os primeiros relatórios de produção de autoanticorpos em modelos de GVHD usado várias linhagens de camundongos ou estirpes de hamster para pai em transferências F1 5 - 8; métodos mais comuns utilizados para estudar a doença de lúpus incluem atualmente o pai DBA / 2 → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, eo modelo de transferência BM12 descrito aqui. Cada modelo tem suas próprias advertências, mas eles geralmente compartilham um conjunto comum de características que se correlacionam com características clínicas da doença humana. Os parâmetros mais frequentemente reportados em modelos de murganho incluem esplenomegalia, linfadenopatia, nefrite, produção ANA, e ao nível celular, a expansão de células T helper (foliculares TFH), ao centro (GC), as células B e células germinais, de plasma. O modelo BM12 indutível é conseguida pela transferência adoptiva de linfócitos a partir de IA BM12 B6 (C) - H2 - Ab1 BM12 / KhEgJ (BM12) ratinhos, uma estirpe identical para murganhos C57BL / 6 com excepção de 3 substituições de aminoácidos no MHC de classe II, em IA b C57BL / 6 (B6) ratinhos. Aloactivação de doadores células T CD4 por destinatário APCs leva a cGVHD com sintomas muito semelhantes LES. Especificamente, estas incluem a expansão do derivado do doador TFH, a expansão das células B GC derivada do receptor e as células de plasma, e a produção de ANA incluindo anti-ADNcd e anti-ssDNA, anti-cromatina, e anticorpos anti-RBC 9. Ao longo do tempo, ratinhos receptores desenvolver glomerulonef rite associada com depósitos de IgG no glomerular, intersticial, e regiões vasculares dos rins 10. Mostrámos recentemente que, semelhante à doença humana, também há um papel crítico para o IFN tipo I neste modelo 11. Notavelmente, os critérios de definição para SLE humano incluem o desenvolvimento de nefrite compatível com SLE, na presença de anti-dsADN os anticorpos 12, ambos os quais são características proeminentes deste modelo de ratinho. Existem SEveral vantagens do modelo BM12 ao longo dos modelos espontâneos. Modelos clássicos que desenvolvam sinais LES-like espontaneamente dependem tanto linhagens de camundongos híbridos, linhagens puras não no fundo B6, ou grande loci genéticos no fundo B6, que fazem que cruzam a nocaute ou camundongos geneticamente modificado de outra forma difícil e demorado. Com o modelo indutível BM12, ratos geneticamente modificados podem servir quer como dador ou do receptor, permitindo a identificação mais rápida do compartimento celular em que os genes específicos podem ser importantes para a doença. Além disso, o desenvolvimento da doença no modelo BM12 é muito mais rápido, necessitando apenas de 2 semanas até ao aparecimento de ANA, em comparação a vários meses para os modelos mais espontâneas. Além disso, em contraste com os modelos espontâneos que desenvolvem a doença em diferentes pontos de tempo, o aparecimento e progressão da doença no modelo B6 BM12 → é altamente sincronizadas. Isto permite a geração de coortes de tamanho adequado que pode bE utilizada para estratégias de intervenção ou terapêuticos em qualquer fase do desenvolvimento da doença. O que se segue é um protocolo detalhado para iniciar a auto-imunidade de LES como pela transferência adoptiva de linfócitos BM12 em ratinhos C57BL / 6, ou variantes genéticas no fundo B6. Além disso, descreve-se um protocolo de coloração de citometria de fluxo para enumerar TFH, GC células B, células do plasma e os tipos de células associadas com a doença humana. Mais importante, estes protocolos podem também ser utilizados para caracterizar doença na maioria dos modelos de rato de SLE e identificar TFH, GC células B e as células de plasma em outros modelos de doenças.

<table><tbody><tr><td>B6. SJL-Ptprca Pepcb / BoyJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001162</td><td>CD45.1 + BoyJ cepa de camundongo</td></tr><tr><td>B6 (C) -H2-Ab1bm12 / KhEgJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001162</td><td>cepa de camundongo Bm12</td></tr><tr><td>FastDigest PsuI</td><td>Life Technologies</td><td>FD1554</td><td>Enzima de digestão de restrição para genotipagem</td></tr><tr><td>1X RBC Lysis Buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30228.01</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Separação de Plasma (PST)</td><td>BD</td><td>365974</td><td>Tubo de coleta de sangue com EDTA Dipotássico</td></tr><tr><td>Tubo de Separação de Soro (SST)</td><td>BD</td><td>365967</td><td>Tubo de coleta de sangue com ativador de coágulo / Gel SST</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td>Solução de separação de células de alta densidade</td></tr><tr><td>Linfólito-M</td><td>Cedarlane</td><td>CL5030</td><td>Solução de separação de células de alta densidade</td></tr><tr><td>GL-7-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-5902-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidin-BUV395</td><td>BD</td><td>564176</td><td></td></tr><tr><td>CD138-BV421</td><td>BioLegend</td><td>142508</td><td></td></tr><tr><td>CD4-BV510</td><td>BioLegend</td><td>100559</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta;-BV605</td><td>BD</td><td>562840</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1-BV711</td><td>BioLegend</td><td>110739</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-FITC</td><td>BioLegend</td><td>109806</td><td></td></tr><tr><td>PD-1-PE</td><td>BioLegend</td><td>135206</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PerCP</td><td>BioLegend</td><td>115532</td><td></td></tr><tr><td>Fas-PE-Cy7</td><td>BD</td><td>557653</td><td></td></tr><tr><td>CXCR5-APC</td><td>BioLegend</td><td>145506</td><td></td></tr><tr><td>Corante de viabilidade fixável ef780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>CD4-BV421</td><td>BioLegend</td><td>100443</td><td></td></tr><tr><td>1,2 ml FACS inserções de tubo, racked</td><td>USA Scientific</td><td>1412-1400</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon&trade; Tubos de fundo redondo</td><td>BD</td><td>352017</td><td></td></tr></tbody></table>

o inducible modelo bm12 de lúpus eritematoso sistêmico (les) em camundongos c57bl / 6

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune com diversas manifestações clínicas e imunológicas. Vários modelos animais espontâneos e induzíveis espelham componentes comuns de doenças humanas, incluindo o modelo de transferência de bm12. Após a transferência de esplenócitos bm12 ou células T CD4 purificadas, os camundongos C57BL / 6 desenvolvem rapidamente grandes frequências de células T foliculares auxiliares (Tfh), células B do centro germinativo (GC) e células plasmáticas, seguidas por altos níveis de anticorpos antinucleares circulantes. Como este modelo utiliza camundongos em um fundo C57BL / 6 puro, os pesquisadores podem estudar rápida e facilmente a progressão da doença em cepas de camundongos transgênicos ou knockout em um período de tempo relativamente curto. Aqui descrevemos protocolos para a indução do modelo e a quantificação de células Tfh, GC B e plasmócitos por citometria de fluxo multicolorida. É importante ressaltar que esses protocolos também podem ser usados para caracterizar a doença na maioria dos modelos de LES em camundongos e identificar Tfh, células B GC e células plasmáticas em outros modelos de doenças.

Ratinhos doentes desenvolvem esplenomegalia em menos de 14 dias, apresentando os baços 2-3 vezes o tamanho dos ratinhos saudável em termos de massa e celularidade (Figura 2). Os esplenócitos são sequencialmente fechado na dispersão de luz (FSC-SSC-A por A), a eliminação de dupletos (FSC-W ou -H pelo FSC-A), células viáveis ​​(baixa coloração do corante de viabilidade) e CD4 + TCRβ + (Figura 3A). Células dadoras são distinguidas das célu...

A transferência de linfócitos bm12 para um receptor C57BL/6 é um modelo estabelecido de lúpus eritematoso sistêmico. Aqui descrevemos como iniciar a doença usando este modelo e como caracterizar células T foliculares auxiliares, células B do centro germinativo e células plasmáticas por citometria de fluxo.

O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar a expansão de células T folliculares auxiliares, células do centro germinativo, células B e células plasmáticas por citometria de fluxo no modelo BM 12 de lúpus eritematoso sistêmico, ou SLE. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do lúpus, como se o bloqueio de vias moleculares específicas com agentes terapêuticos pode interromper ou retardar a progressão da doença. A principal vantagem deste modelo de SLE é que utiliza camundongos com background genético puro CPD sete black six, permitindo que os pesquisadores estudem rapidamente e com facilidade a progressão da doença em linhagens de camundongos transgênicos ou knockout em um período de tempo relativamente curto.Após isolar e injetar células doadoras BM 12 em camundongos, determinar a eficiência do enxerto e eutanasiar os camundongos conforme o protocolo descrito no texto, borrife levemente 70% de etanol para umedecer o abdômen do camundongo com uma tesoura cirúrgica. Faça uma pequena incisão superficial de aproximadamente um centímetro acima da genitália, puxe a pele do abdômen em direção ao esterno mantendo intacta a fáscia peritoneal. Adapte uma se

the-bm12-inducible-model-systemic-lupus-erythematosus-sle-c57bl6

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Este vídeo mostra como induzir hipofisite auto-imunes em camundongos SJL e como avaliar sua gravidade pela histopatologia.

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal estabelecido de esclerose múltipla. C57BL / 6 são imunizados com mielina de oligodendrócitos glicoproteína (MOG) peptídeo 35-55 (MOG 35-55), o que resulta em uma paralisia flácida ascendente causada por células imunes autorreactivas no sistema nervoso central. Protocolos para indução e monitoramento de doenças serão discutidos.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Este protocolo descreve como determinar se os tratamentos farmacológicos para encefalomielite autoimune experimental mostram proteção do SNC como consequência da supressão da infiltração de células imunes ou são neuroprotetores durante o ataque de infiltração de células imunes.

Determinar a supressão imune Sistema contra CNS Proteção para farmacológicos intervenções na desmielinização auto-imune

Aqui nós apresentamos um método eficaz para investigar a atividade antifibróticos de pilhas stromal mesenquimais humanas infundidas intravenosamente obtidas do cabo de cordão umbilical inteiro que segue a indução de ferimento de pulmão por uma injeção endotraqueal da bleomicina em C57Bl /6 ratos. Este protocolo pode facilmente ser estendido ao teste pré-clínico de outras terapêuticas.

Indução de lesão de pulmão de camundongo por injeção endotraqueal de bleomicina

O presente protocolo descreve um método para rastrear a progressão do lúpus em camundongos. Dois procedimentos adicionais são apresentados para caracterizar a nefrite lúpus com base na infiltração celular e na deposição de proteínas nos rins.

Análises de Proteinúria, Infiltração Renal de Leucócitos e Deposição Renal de Proteínas em Camundongos MRL/lpr propensos a Lúpus

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Aqui, relatamos um protocolo que estabelece um modelo de camundongo com artrite reumatóide (AR) por meio da transferência adotiva de células T CD4+ de camundongos SKG, fornecendo uma ferramenta experimental rápida e confiável para investigar os mecanismos imunológicos, progressão patológica e desenvolvimento de novos tratamentos para AR.

Um modelo de transferência adotiva de artrite reumatóide em camundongos

Aprenda a caracterizar células T foliculares auxiliares, células B de centro germinativo e plasmócitos por citometria de fluxo no modelo induzível BM12 de LES em camundongos C57BL/6. Este método permite estudar a progressão da doença em linhagens transgênicas.

O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

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