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Cultura e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias

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JoVE Science Education Developmental Biology

Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation

2.7: An Introduction to Stem Cell Biology

2.9: Induced Pluripotency

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09:52 min

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April 30, 2023

Overview

A colheita de células-tronco embrionárias (ES) requer condições que mantenham essas células em um estado indiferenciado para preservar sua capacidade de autoconexão e pluripotência. Os biólogos de células-tronco estão continuamente otimizando métodos para melhorar a eficiência da cultura celular ES, e estão simultaneamente tentando direcionar a diferenciação das células ES para tipos de células específicas que poderiam ser usadas na medicina regenerativa.

Este vídeo descreve os princípios básicos da cultura celular ES, e demonstra um protocolo geral para crescer e passar células ES. Também damos uma olhada mais de perto no método de queda suspensa, que é usado para diferenciar células ES. Finalmente, este vídeo descreverá algumas aplicações da cultura celular ES e técnicas de diferenciação, incluindo um método usado para gerar células musculares cardíacas funcionais in vitro.

Procedure

Células-tronco embrionárias, ou células ES, têm uma série de propriedades únicas que as distinguem das células adultas regulares. Portanto, os cientistas criaram técnicas especiais de cultivo para manter ou tirar proveito dessas propriedades. Quando cultivadas corretamente, as células ES podem se dividir indefinidamente para fazer mais de si mesmas. Ao mesmo tempo, alterando as condições de cultivo, as células ES podem ser direcionadas para se diferenciar em quase qualquer tipo de célula encontrada em nosso corpo; essa habilidade de células ES é chamada de “pluripotência”.

Neste vídeo, você vai aprender como cultivar e passar células ES para que elas mantenham suas propriedades únicas, como induzir a diferenciação em células ES para formar tipos de células específicas e as maneiras pelas quais as técnicas de cultivo e diferenciação de células ES estão sendo usadas e refinadas pelos pesquisadores atualmente.

Antes de entrar em detalhes dos procedimentos para manutenção de células ES, é importante primeiro entender o que impede ou impulsiona a diferenciação celular ES. Para que as células ES mantenham suas propriedades únicas de pluripotência e autoconexão, elas devem ser cultivadas com fatores específicos em seu meio de crescimento que suprimem a diferenciação espontânea.

Isso é mais comumente feito por células ES em uma camada de “alimentadores”, geralmente fibroblastos embrionários de camundongos, ou MEFs. As células alimentadores “alimentam” as células ES de certos fatores, como a ativação A, que ajudam a manter as células ES em seu estado indiferenciado.

Recentemente, os cientistas também desenvolveram métodos de cultivo sem alimentadores nos quais as células ES são cultivadas na mídia com os fatores necessários adicionados em uma receita definida. Essa abordagem reduz a variabilidade e remove o componente não humano das culturas celulares ES, que é um pré-requisito para aplicações clínicas.

Outra característica das células ES é que elas crescem naturalmente em aglomerados ou colônias, e tendem a ter baixa taxa de sobrevivência quando dissociadas em células únicas, especialmente células ES humanas. Como resultado, a passagem de células ES humanas geralmente requer retê-las em aglomerados intactos através de “colheita” mecânica.

Quando as células ES são cultivadas em condições não aderentes, elas formam agregados 3D conhecidos como corpos embrionários, ou EBs, nos quais as células ES se diferenciarão em todos os tipos de células diferentes. Variando as condições de diferenciação, como a adição de fatores específicos de crescimento ao meio, os cientistas estão desenvolvendo métodos para direcionar a diferenciação celular ES para tipos de células específicas.

Agora que você entende os princípios por trás da manutenção e diferenciação de células ES, vamos ver como cultivar e passar células ES em alimentadores MEF.

Os MEFs são obtidos a partir de embriões de camundongos em estágio inicial, e são então inativados por produtos químicos ou radiação para evitar que se dividam ainda mais. MEFs inativados devem ser banhados em pratos de cultura de tecido gelatinizado pelo menos um dia antes de começar a cultivar células ES. Quando os alimentadores estão totalmente instalados, as células ES são descongeladas e semeadas nas placas.

Nos próximos dias, as células ES crescerão em grandes colônias. Antes que as colônias comecem a tocar e fundir, a cultura ES deve ser passagem. Deve-se observar a morfologia das células ES para ver se elas estão mostrando sinais de diferenciação. Colônias ES indiferenciadas geralmente parecem bem definidas e homogêneas, enquanto células diferenciadas se parecem com “paralelepípedos” em forma irregular e maçante.

Se as colônias mostrarem 70% ou mais de diferenciação, ou se forem esparsas, corte mecanicamente as colônias indiferenciadas e transfira-as para uma nova placa alimentadora. Caso contrário, basta remover as áreas ou colônias diferenciadas e proceder com a passagem.

Uma vez que as colônias diferenciadas tenham sido limpas, enzimas proteolíticas, como colagemnase, são adicionadas para levantar as células da placa com incubação a 37°C pelo tempo adequado. A mídia ES fresca é então adicionada para parar as reações enzimáticas. As colônias são mecanicamente desalojadas da placa e transferidas para um tubo de centrífuga, onde são divididas em tamanhos desejados com tubulação suave. As células ES são coletadas por centrifugação, resuspendidas em mídia ES e banhadas nas placas alimentadoras preparadas.

Depois de aprender a passar células ES, vamos olhar para uma das técnicas mais comuns usadas para diferenciar células ES em corpos embrionários – o método de queda de enforcamento.

Para começar, as células ES são separadas com a ajuda de enzimas proteolíticas como colagenase, e diluídas à concentração desejada em mídias que contêm fatores de diferenciação específicos da linhagem. A suspensão da célula ES é então depositada em gotas na tampa de uma placa de petri bacteriana. A tampa é rapidamente invertida e colocada sobre o prato, de modo que as gotas de mídia vão pendurar de cabeça para baixo e permitir que os corpos embrionários se desenvolvam.

Após cerca de dois dias, as gotas com EBs podem ser coletadas e emplacar em placas não aderentes para posterior cultivo. No ponto de tempo apropriado para a linhagem celular desejada, corpos embrióides são banhados de volta em pratos de cultura de tecido aderente gelatinizado para maior diferenciação.

Agora que cobrimos as técnicas básicas decultura e diferenciação de células ES, vamos ver como elas são adaptadas para necessidades experimentais específicas.

Como mencionado anteriormente, as células ES podem ser direcionadas para se diferenciar em tipos de células específicas em diferentes condições de cultivo. Neste experimento, os cientistas produziram neurônios motores a partir de células ES humanas. Isso foi feito pela primeira vez adicionando fatores à diferenciação de corpos embrionários que os direcionam para a linhagem neural, seguido por produtos químicos e condições de revestimento que transformam essas células especificamente em neurônios motores. Usando abordagens semelhantes, os pesquisadores têm sido bem sucedidos em diferenciar células ES em células musculares ritmicamente batidas cardíacas.

Como diferenciar células ES imita eventos que ocorrem à medida que os embriões se desenvolvem naturalmente, também podemos usá-los para investigar a biologia do desenvolvimento embrionário precoce. Um dos fenômenos estudados é a inativação do cromossomo X, ou XCI, o processo crucial pelo qual um dos dois cromossomos X é silenciado em cada célula de um mamífero fêmea. Ao visualizar a distribuição de RNAs e proteínas específicas no desenvolvimento de EBs, os cientistas ganharam insights valiosos sobre a biologia do XCI.

Finalmente, para aumentar a consistência e eficiência da experimentação celular ES, os cientistas estão continuamente tentando criar melhores técnicas para cultivar células ES. Uma abordagem é cultivar células ES em uma única camada, chamada de cultivo de monocamadas do tipo não colônia, ou NCM.

Lembra-se que as células ES humanas tendem a ser infelizes quando não estão crescendo como agregados 3D? Os cientistas mostraram que os produtos químicos conhecidos como inibidores de ROCHA aumentam a sobrevivência de células ES dissociadas, que permitem que elas sejam passagemdas como suspensões unicelulares, e sejam banhadas em alta densidade. A vantagem da técnica NCM é que cada célula estará mais igualmente exposta a fatores de crescimento e nutrientes no meio, reduzindo a heterogeneidade dentro da cultura, facilitando o cultivo de células ES em grande número.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre como cultivar e diferenciar células-tronco embrionárias. Agora você deve saber quais fatores são importantes para manter as células ES em seu estado indiferenciado, e como podemos aproveitar a pluripotência celular ES para gerar tipos de células específicas em um prato. Daqui para frente, os cientistas trabalharão para desenvolver condições de cultivo e diferenciação mais eficientes e bem definidas para produzir tipos de células especializadas que podem ser usadas em aplicações de medicamentos regenerativos. Obrigado por assistir!

Transcript

Embryonic stem cells, or ES cells, have a number of unique properties that distinguish them from regular adult cells. Therefore, scientists have devised special culturing techniques to maintain or take advantage of these properties. When cultured properly, ES cells can divide indefinitely to make more of themselves. At the same time, by altering the culturing conditions, ES cells can be directed to differentiate into almost any cell type found in our body; this ability of ES cells is called “pluripotency.”

In this video, you are going to learn how to culture and passage ES cells so that they maintain their unique properties, how to induce differentiation in ES cells to form specific cell types, and the ways in which ES cell culturing and differentiation techniques are being used and refined by researchers today.

Before going into details of the procedures for ES cell maintenance, it is important to first understand what prevents or drives ES cell differentiation. In order for ES cells to retain their unique properties of pluripotency and self-renewal, they must be cultured with specific factors in their growth medium that suppress spontaneous differentiation.

This is most commonly done by culturing ES cells on a layer of “feeders,” usually mouse embryonic fibroblasts, or MEFs. Feeder cells “feed” the ES cells certain factors, such as activin A, that help to maintain ES cells in their undifferentiated state.

Recently, scientists have also developed feeder-free culturing methods in which ES cells are grown in media with the necessary factors added in a defined recipe. This approach reduces variability and removes the non-human component from ES cell cultures, which is a prerequisite for clinical applications.

Another characteristic of ES cells is that they naturally grow in clusters or colonies, and tend to have low survival rate when dissociated into single cells, especially human ES cells. As a result, passaging human ES cells generally requires retaining them in intact clumps through mechanical “picking.”

When ES cells are grown in non-adherent conditions, they form 3D aggregates known as embryoid bodies, or EBs, in which the ES cells will differentiate into all different cell types. By varying the differentiation conditions, such as the addition of specific growth factors to the medium, scientists are developing methods to direct ES cell differentiation into specific cell types.

Now that you understand the principles behind ES cell maintenance and differentiation, let’s look at how to culture and passage ES cells on MEF feeders.

MEFs are obtained from early stage mouse embryos, and are then inactivated by chemicals or radiation to prevent them from further dividing. Inactivated MEFs should be plated onto gelatinized tissue culture dishes at least one day before starting to culture ES cells. When feeders are fully settled, ES cells are thawed and seeded onto the plates.

Over the next few days, ES cells will grow into large colonies. Before the colonies begin to touch and fuse, the ES culture should be passaged. One should observe the ES cells’ morphology to see if they are showing signs of differentiation. Undifferentiated ES colonies generally look well-defined and homogeneous, while differentiated cells would look like dull, irregular-shaped “cobblestones.”

If colonies show 70% or more of differentiation, or if they are sparse, mechanically cut out the undifferentiated colonies and transfer them to a new feeder plate. Otherwise, simply remove the differentiated areas or colonies and proceed with passaging.

Once the differentiated colonies have been cleaned up, proteolytic enzymes, like collagenase, are added to lift the cells from the plate with incubation at 37°C for the appropriate amount of time. Fresh ES media is then added to stop the enzymatic reactions. The colonies are mechanically dislodged from the plate and transferred to a centrifuge tube, where they are broken up into desired sizes with gentle pipetting. The ES cells are collected by centrifugation, resuspended in ES media, and plated onto the prepared feeder plates.

After learning how to passage ES cells, let’s look at one of the more common techniques used to differentiate ES cells into embryoid bodies-the hanging drop method.

To begin, ES cells are detached with the help of proteolytic enzymes like collagenase, and diluted to the desired concentration in media containing lineage-specific differentiation factors. The ES cell suspension is then deposited in drops onto the lid of a bacterial petri dish. The lid is quickly inverted and placed on the dish, so the media drops will hang upside down and allow the embryoid bodies to develop.

After about two days, the drops with EBs can be collected and plated onto non-adherent plates for further culturing. At the appropriate time point for the desired cell lineage, embryoid bodies are plated back onto gelatinized adherent tissue culture dishes for further differentiation.

Now that we’ve covered the basic techniques of culturing and differentiating ES cells, let’s look at how they are tailored for specific experimental needs.

As mentioned earlier, ES cells can be directed to differentiate into specific cell types under different culturing conditions. In this experiment, scientists produced motor neurons from human ES cells. This was done by first adding factors to differentiating embryoid bodies that direct them towards the neural lineage, followed by chemicals and plating conditions that turn these cells specifically into motor neurons. Using similar approaches, researchers have been successful in differentiating ES cells into rhythmically beating heart muscle cells.

Because differentiating ES cells mimic events that occur as embryos develop naturally, we can also use them to investigate the biology of early embryonic development. One of the phenomena being studied is X-chromosome inactivation, or XCI, the crucial process whereby one of the two X-chromosomes is silenced in each cell of a female mammal. By visualizing the distribution of specific RNAs and proteins in developing EBs, scientists have gained valuable insights into the biology of XCI.

Finally, to increase the consistency and efficiency of ES cell experimentation, scientists are continually trying to devise better techniques to culture ES cells. One approach is to grow ES cells in a single layer, called non-colony type monolayer culturing, or NCM.

Remember that human ES cells tend to be unhappy when they are not growing as 3D aggregates? Scientists have shown that chemicals known as ROCK inhibitors increase the survival of dissociated ES cells, which allow them to be passaged as single-cell suspensions, and to be plated at high density. The advantage of the NCM technique is that every cell will be more equally exposed to growth factors and nutrients in the medium, reducing heterogeneity within the culture while making it easier to grow ES cells in large numbers.

You’ve just watched JoVE’s video on how to culture and differentiate embryonic stem cells. You should now know what factors are important for maintaining ES cells in their undifferentiated state, and how we can take advantage of ES cell pluripotency to generate specific cell types in a dish. Going forward, scientists will be working to develop more efficient and well-defined culturing and differentiation conditions to produce specialized cell types that can be used in regenerative medicine applications. Thanks for watching!

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