Cultura e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias

Células-tronco embrionárias, ou células ES, têm uma série de propriedades únicas que as distinguem das células adultas regulares. Portanto, os cientistas criaram técnicas especiais de cultivo para manter ou tirar proveito dessas propriedades. Quando cultivadas corretamente, as células ES podem se dividir indefinidamente para fazer mais de si mesmas. Ao mesmo tempo, alterando as condições de cultivo, as células ES podem ser direcionadas para se diferenciar em quase qualquer tipo de célula encontrada em nosso corpo; essa habilidade de células ES é chamada de "pluripotência".

Neste vídeo, você vai aprender como cultivar e passar células ES para que elas mantenham suas propriedades únicas, como induzir a diferenciação em células ES para formar tipos de células específicas e as maneiras pelas quais as técnicas de cultivo e diferenciação de células ES estão sendo usadas e refinadas pelos pesquisadores atualmente.

Antes de entrar em detalhes dos procedimentos para manutenção de células ES, é importante primeiro entender o que impede ou impulsiona a diferenciação celular ES. Para que as células ES mantenham suas propriedades únicas de pluripotência e autoconexão, elas devem ser cultivadas com fatores específicos em seu meio de crescimento que suprimem a diferenciação espontânea.

Isso é mais comumente feito por células ES em uma camada de "alimentadores", geralmente fibroblastos embrionários de camundongos, ou MEFs. As células alimentadores "alimentam" as células ES de certos fatores, como a ativação A, que ajudam a manter as células ES em seu estado indiferenciado.

Recentemente, os cientistas também desenvolveram métodos de cultivo sem alimentadores nos quais as células ES são cultivadas na mídia com os fatores necessários adicionados em uma receita definida. Essa abordagem reduz a variabilidade e remove o componente não humano das culturas celulares ES, que é um pré-requisito para aplicações clínicas.

Outra característica das células ES é que elas crescem naturalmente em aglomerados ou colônias, e tendem a ter baixa taxa de sobrevivência quando dissociadas em células únicas, especialmente células ES humanas. Como resultado, a passagem de células ES humanas geralmente requer retê-las em aglomerados intactos através de "colheita" mecânica.

Quando as células ES são cultivadas em condições não aderentes, elas formam agregados 3D conhecidos como corpos embrionários, ou EBs, nos quais as células ES se diferenciarão em todos os tipos de células diferentes. Variando as condições de diferenciação, como a adição de fatores específicos de crescimento ao meio, os cientistas estão desenvolvendo métodos para direcionar a diferenciação celular ES para tipos de células específicas.

Agora que você entende os princípios por trás da manutenção e diferenciação de células ES, vamos ver como cultivar e passar células ES em alimentadores MEF.

Os MEFs são obtidos a partir de embriões de camundongos em estágio inicial, e são então inativados por produtos químicos ou radiação para evitar que se dividam ainda mais. MEFs inativados devem ser banhados em pratos de cultura de tecido gelatinizado pelo menos um dia antes de começar a cultivar células ES. Quando os alimentadores estão totalmente instalados, as células ES são descongeladas e semeadas nas placas.

Nos próximos dias, as células ES crescerão em grandes colônias. Antes que as colônias comecem a tocar e fundir, a cultura ES deve ser passagem. Deve-se observar a morfologia das células ES para ver se elas estão mostrando sinais de diferenciação. Colônias ES indiferenciadas geralmente parecem bem definidas e homogêneas, enquanto células diferenciadas se parecem com "paralelepípedos" em forma irregular e maçante.

Se as colônias mostrarem 70% ou mais de diferenciação, ou se forem esparsas, corte mecanicamente as colônias indiferenciadas e transfira-as para uma nova placa alimentadora. Caso contrário, basta remover as áreas ou colônias diferenciadas e proceder com a passagem.

Uma vez que as colônias diferenciadas tenham sido limpas, enzimas proteolíticas, como colagemnase, são adicionadas para levantar as células da placa com incubação a 37°C pelo tempo adequado. A mídia ES fresca é então adicionada para parar as reações enzimáticas. As colônias são mecanicamente desalojadas da placa e transferidas para um tubo de centrífuga, onde são divididas em tamanhos desejados com tubulação suave. As células ES são coletadas por centrifugação, resuspendidas em mídia ES e banhadas nas placas alimentadoras preparadas.

Depois de aprender a passar células ES, vamos olhar para uma das técnicas mais comuns usadas para diferenciar células ES em corpos embrionários - o método de queda de enforcamento.

Para começar, as células ES são separadas com a ajuda de enzimas proteolíticas como colagenase, e diluídas à concentração desejada em mídias que contêm fatores de diferenciação específicos da linhagem. A suspensão da célula ES é então depositada em gotas na tampa de uma placa de petri bacteriana. A tampa é rapidamente invertida e colocada sobre o prato, de modo que as gotas de mídia vão pendurar de cabeça para baixo e permitir que os corpos embrionários se desenvolvam.

Após cerca de dois dias, as gotas com EBs podem ser coletadas e emplacar em placas não aderentes para posterior cultivo. No ponto de tempo apropriado para a linhagem celular desejada, corpos embrióides são banhados de volta em pratos de cultura de tecido aderente gelatinizado para maior diferenciação.

Agora que cobrimos as técnicas básicas decultura e diferenciação de células ES, vamos ver como elas são adaptadas para necessidades experimentais específicas.

Como mencionado anteriormente, as células ES podem ser direcionadas para se diferenciar em tipos de células específicas em diferentes condições de cultivo. Neste experimento, os cientistas produziram neurônios motores a partir de células ES humanas. Isso foi feito pela primeira vez adicionando fatores à diferenciação de corpos embrionários que os direcionam para a linhagem neural, seguido por produtos químicos e condições de revestimento que transformam essas células especificamente em neurônios motores. Usando abordagens semelhantes, os pesquisadores têm sido bem sucedidos em diferenciar células ES em células musculares ritmicamente batidas cardíacas.

Como diferenciar células ES imita eventos que ocorrem à medida que os embriões se desenvolvem naturalmente, também podemos usá-los para investigar a biologia do desenvolvimento embrionário precoce. Um dos fenômenos estudados é a inativação do cromossomo X, ou XCI, o processo crucial pelo qual um dos dois cromossomos X é silenciado em cada célula de um mamífero fêmea. Ao visualizar a distribuição de RNAs e proteínas específicas no desenvolvimento de EBs, os cientistas ganharam insights valiosos sobre a biologia do XCI.

Finalmente, para aumentar a consistência e eficiência da experimentação celular ES, os cientistas estão continuamente tentando criar melhores técnicas para cultivar células ES. Uma abordagem é cultivar células ES em uma única camada, chamada de cultivo de monocamadas do tipo não colônia, ou NCM.

Lembra-se que as células ES humanas tendem a ser infelizes quando não estão crescendo como agregados 3D? Os cientistas mostraram que os produtos químicos conhecidos como inibidores de ROCHA aumentam a sobrevivência de células ES dissociadas, que permitem que elas sejam passagemdas como suspensões unicelulares, e sejam banhadas em alta densidade. A vantagem da técnica NCM é que cada célula estará mais igualmente exposta a fatores de crescimento e nutrientes no meio, reduzindo a heterogeneidade dentro da cultura, facilitando o cultivo de células ES em grande número.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre como cultivar e diferenciar células-tronco embrionárias. Agora você deve saber quais fatores são importantes para manter as células ES em seu estado indiferenciado, e como podemos aproveitar a pluripotência celular ES para gerar tipos de células específicas em um prato. Daqui para frente, os cientistas trabalharão para desenvolver condições de cultivo e diferenciação mais eficientes e bem definidas para produzir tipos de células especializadas que podem ser usadas em aplicações de medicamentos regenerativos. Obrigado por assistir!