2.8: Cultura e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias

As células-tronco embrionárias, ou células ES, têm uma série de propriedades únicas que as distinguem das células adultas comuns. Portanto, os cientistas desenvolveram técnicas especiais de cultivo para manter ou tirar proveito dessas propriedades. Quando cultivadas adequadamente, as células ES podem se dividir indefinidamente para fazer mais de si mesmas. Ao mesmo tempo, alterando as condições de cultura, as células ES podem ser direcionadas para se diferenciar em quase qualquer tipo de célula encontrada em nosso corpo; essa capacidade das células ES é chamada de "pluripotência".

Neste vídeo, você aprenderá como cultivar e passar células ES para que elas mantenham suas propriedades únicas, como induzir a diferenciação em células ES para formar tipos específicos de células e as maneiras pelas quais as técnicas de cultura e diferenciação de células ES estão sendo usadas e refinadas por pesquisadores hoje.

Antes de entrar em detalhes sobre os procedimentos de manutenção das células ES, é importante primeiro entender o que impede ou impulsiona a diferenciação das células ES. Para que as células ES mantenham suas propriedades únicas de pluripotência e auto-renovação, elas devem ser cultivadas com fatores específicos em seu meio de crescimento que suprimem a diferenciação espontânea.

Isso é mais comumente feito cultivando células ES em uma camada de "alimentadores", geralmente fibroblastos embrionários de camundongos, ou MEFs. As células alimentadoras "alimentam" as células ES com certos fatores, como a ativina A, que ajudam a manter as células ES em seu estado indiferenciado.

Recentemente, os cientistas também desenvolveram métodos de cultura sem alimentadores nos quais as células ES são cultivadas em meios com os fatores necessários adicionados em uma receita definida. Essa abordagem reduz a variabilidade e remove o componente não humano das culturas de células ES, o que é um pré-requisito para aplicações clínicas.

Outra característica das células ES é que elas crescem naturalmente em aglomerados ou colônias e tendem a ter baixa taxa de sobrevivência quando dissociadas em células únicas, especialmente células ES humanas. Como resultado, a passagem de células ES humanas geralmente requer retê-las em aglomerados intactos por meio de "picking" mecânico.

Quando as células ES são cultivadas em condições não aderentes, elas formam agregados 3D conhecidos como corpos embrióides, ou EBs, nos quais as células ES se diferenciam em todos os diferentes tipos de células. Ao variar as condições de diferenciação, como a adição de fatores de crescimento específicos ao meio, os cientistas estão desenvolvendo métodos para direcionar a diferenciação de células ES em tipos específicos de células.

Agora que você entende os princípios por trás da manutenção e diferenciação das células ES, vamos ver como cultivar e passar células ES em alimentadores MEF.

Os MEFs são obtidos de embriões de camundongos em estágio inicial e são inativados por produtos químicos ou radiação para evitar que se dividam ainda mais. Os MEFs inativados devem ser plaqueados em placas de cultura de tecidos gelatinizados pelo menos um dia antes de iniciar a cultura de células ES. Quando os alimentadores estão totalmente assentados, as células ES são descongeladas e semeadas nas placas.

Nos próximos dias, as células ES se transformarão em grandes colônias. Antes que as colônias comecem a se tocar e se fundir, a cultura ES deve ser passada. Deve-se observar a morfologia das células ES para ver se elas estão mostrando sinais de diferenciação. As colônias ES indiferenciadas geralmente parecem bem definidas e homogêneas, enquanto as células diferenciadas pareceriam "paralelepípedos" opacos e de formato irregular.

Se as colônias mostrarem 70% ou mais de diferenciação, ou se forem esparsas, corte mecanicamente as colônias indiferenciadas e transfira-as para uma nova placa alimentadora. Caso contrário, simplesmente remova as áreas ou colônias diferenciadas e prossiga com a passagem.

Uma vez que as colônias diferenciadas tenham sido limpas, enzimas proteolíticas, como a colagenase, são adicionadas para levantar as células da placa com incubação a 37? C pelo tempo apropriado. Um novo meio ES é então adicionado para interromper as reações enzimáticas. As colônias são desalojadas mecanicamente da placa e transferidas para um tubo de centrífuga, onde são divididas nos tamanhos desejados com pipetagem suave. As células ES são coletadas por centrifugação, ressuspensas em meio ES e plaqueadas nas placas alimentadoras preparadas.

Depois de aprender como passar as células ES, vejamos uma das técnicas mais comuns usadas para diferenciar as células ES em corpos embrióides - o método da gota suspensa.

Para começar, as células ES são destacadas com a ajuda de enzimas proteolíticas como a colagenase e diluídas até a concentração desejada em meios contendo fatores de diferenciação específicos da linhagem. A suspensão de células ES é então depositada em gotas na tampa de uma placa de Petri bacteriana. A tampa é rapidamente invertida e colocada no prato, para que as gotas de mídia fiquem penduradas de cabeça para baixo e permitam que os corpos embrióides se desenvolvam.

Após cerca de dois dias, as gotas com EBs podem ser coletadas e colocadas em placas não aderentes para posterior cultura. No momento apropriado para a linhagem celular desejada, os corpos embrióides são colocados de volta em placas de cultura de tecidos aderentes gelatinizados para maior diferenciação.

Agora que abordamos as técnicas básicas de cultura e diferenciação de células ES, vamos ver como elas são adaptadas para necessidades experimentais específicas.

Como mencionado anteriormente, as células ES podem ser direcionadas para se diferenciar em tipos específicos de células sob diferentes condições de cultura. Neste experimento, os cientistas produziram neurônios motores a partir de células ES humanas. Isso foi feito primeiro adicionando fatores para diferenciar corpos embrióides que os direcionam para a linhagem neural, seguidos por produtos químicos e condições de revestimento que transformam essas células especificamente em neurônios motores. Usando abordagens semelhantes, os pesquisadores tiveram sucesso em diferenciar as células ES em células do músculo cardíaco que batem ritmicamente.

Como a diferenciação de células ES imita eventos que ocorrem à medida que os embriões se desenvolvem naturalmente, também podemos usá-las para investigar a biologia do desenvolvimento embrionário inicial. Um dos fenômenos estudados é a inativação do cromossomo X, ou XCI, o processo crucial pelo qual um dos dois cromossomos X é silenciado em cada célula de um mamífero fêmea. Ao visualizar a distribuição de RNAs e proteínas específicas no desenvolvimento de EBs, os cientistas obtiveram informações valiosas sobre a biologia da XCI.

Finalmente, para aumentar a consistência e a eficiência da experimentação com células ES, os cientistas estão continuamente tentando desenvolver melhores técnicas para cultivar células ES. Uma abordagem é cultivar células ES em uma única camada, chamada de cultura monocamada do tipo não colônia, ou NCM.

Lembre-se de que as células ES humanas tendem a ficar infelizes quando não estão crescendo como agregados 3D? Os cientistas mostraram que os produtos químicos conhecidos como inibidores de ROCK aumentam a sobrevivência das células ES dissociadas, o que permite que elas sejam passadas como suspensões unicelulares e sejam plaqueadas em alta densidade. A vantagem da técnica NCM é que cada célula será mais igualmente exposta a fatores de crescimento e nutrientes no meio, reduzindo a heterogeneidade dentro da cultura e facilitando o crescimento de células ES em grande número.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre como cultivar e diferenciar células-tronco embrionárias. Agora você deve saber quais fatores são importantes para manter as células ES em seu estado indiferenciado e como podemos aproveitar a pluripotência das células ES para gerar tipos específicos de células em um prato. No futuro, os cientistas trabalharão para desenvolver condições de cultura e diferenciação mais eficientes e bem definidas para produzir tipos de células especializadas que possam ser usadas em aplicações de medicina regenerativa. Obrigado por assistir!