Name: Hemodinâmica Caracterização de roedores modelos de Hipertensão Arterial Pulmonar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a caracterizar hemodinamicamente modelos de roedores com hipertensão arterial pulmonar usando ecocardiografia e cateterização cardíaca direita. Este método permite analisar a função ventricular direita em doenças cardiopulmonares.

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SR é apoiado pelo NIH K08HL114643, Gilead Research Scholars in Pulmonary Arterial Hypertension e Burroughs Wellcome Fund Career Award for Medical Scientists.

Todos os procedimentos descritos seguir as orientações de cuidados de animais de Duke University School of Medicine. 1. Antes de iniciar o procedimento Nota: Antes de quaisquer procedimentos com animais, garantir que a permissão institucional adequado foi obtido. Tal como acontece com todos os procedimentos, usar medicação para a dor adequado para garantir que não há sofrimento animal. <ol><li> cateteres nivelada com solução salina estéril heparinizado (100 U / ml) para assegurar a desobstrução. Marca um ponto a partir da ponta do cateter equivalente ao comprimento do coração para o meio do gargalo (aproximadamente 4 cm para ratos e 2 cm de ratos). </li><li> Anestesiar o mouse ou rato. As escolhas do anestésico incluem isoflurano (3-4% de indução, manutenção 1,5% misturado com 100% de oxigénio), a cetamina / xilazina (80-120 / 10 mg / kg) e pentobarbital (40-80 mg / kg) 6. <ol><li> Por exemplo, com cetamina: xilazina (80-120 mg / kg: 10-16 mg / kg IP para ratinhos e 80-100 mg / kg: 5-10 mg / kg IP para ratos), uma dose única dura 20-50 minutos de anestesia. Para ecocardiografia, anestesiar ratinho ou um rato com isoflurano (3-4% para a indução e 1,5% para manutenção). Avaliar a profundidade da anestesia por beliscar o roedor na área cirúrgica para confirmar que os reflexos de retirada estão ausentes. Use pomada veterinária nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. Nota: agentes anestésicos diferentes podem ser usados ​​para obter resultados confiáveis ​​com o uso adequado e otimização (revisto em outros lugares 6). Nossa preferência por cateterismo é usar a cetamina: xilazina. Overdose com cetamina / xilazina pode profundamente diminuir a frequência cardíaca e da função cardíaca, por isso é fundamental para manter a temperatura adequada e controle respiratório. Para manter a frequência cardíaca (&gt; 400 / min) em camundongos, que rotineiramente vagotomia bilateral. A quantidade de cetamina / xilazina aqui vai geralmente duram de 20-30 min, que é suficiente para executar qualquer aberto ou com tórax fechado coração cateterismo seguido deeutanásia do animal. </li></ol></li><li> Prepare o rat / mouse para o procedimento cirúrgico (Figura 1). <ol><li> Raspar a pele do peito (para permitir a ecocardiografia) e da região cirúrgica, no pescoço direita. </li><li> Esfregue as regiões cirúrgicos raspadas com um movimento circular do centro para fora usando betadine, seguido por limpeza com um algodão embebido em álcool 70%. </li><li> Colocar o animal em uma plataforma cirúrgica com uma almofada de aquecimento por baixo. Definir o nível de aquecimento para manter uma temperatura corporal de 37-37,5 ° C. Monitorar a temperatura do corpo com uma sonda retal. A hipotermia pode resultar em bradicardia e hipertermia significativos resulta em taquicardia significativa. </li></ol></li></ol> 2. Ecocardiografia Nota: A descrição completa da ecocardiografia roedor é descrito em outros lugares 7. Para o mouse, antes da anestesia, as imagens podem ser obtidas na, animal contido manualmente acordado. Para o rato,anestesia antes da ecocardiografia é preferido como ratos são grandes demais para ser contido manualmente enquanto acordado). <ol><li> Paraesternal eixo longo (PLAX) View. <ol><li> Colocar o animal em decúbito dorsal sobre a plataforma ou restringi-lo manualmente. </li><li> Selecione Modo B para projetar uma imagem ao vivo 2D. </li><li> Alinhar o transdutor de ultra-som com uma frequência de 40 MHz para mouse ou 25 MHz para ratos para a linha paraesternal esquerda e gire o transdutor sentido anti-horário de 30 ° com o indicador de sonda apontando na direção caudal (5 a 11 horas posição de linha) . Ângulo do transdutor ligeiramente (de balanço ao longo do eixo curto do transdutor no mesmo plano tomográfico) para se obter uma vista completa da câmara LV no centro da tela. </li><li> Localizar e visualizar estas estruturas anatômicas (Figura 2A): o lúmen do ventrículo esquerdo (VE); septo interventricular (IVS); o lúmen do ventrículo direito (RV); aorta ascendente (AO); e átrio esquerdo (LA). </li> &lt;li&gt; Mudar para o modo M, uma vez que estas estruturas acima são claramente visualizados. Coloque a linha do indicador através da parte mais larga do lúmen do VE usando AO como ponto de referência e também fazer a mentira profundidade de foco no centro da LV Câmara (Figura 2B). Fazer medições similares da RV, alterando angulação do transdutor e obtenção de medidas do modo M. </li><li> Use loja de cine para criar um loop de vídeo para gravar os dados de medição off-line (dimensão câmara de LV, FS e espessura da parede). </li><li> Obter um traçado Doppler do fluxo de saída aórtico em PW modo de Doppler, colocando o cursor PW na aorta e a gravação (Figura 2C). </li></ol></li><li> -Esternal curto eixo Vista (PSAX) no nível da aorta. <ol><li> Alternar para o modo B. </li><li> Gire o transdutor de 90 ° no sentido horário a partir da vista eixo longo paraesternal para obter o ponto de vista paraesternal eixo menor (Figura 3). Mover e ângulo do transdutor em direção ao crânio para identify da válvula aórtica corte transversal. </li><li> Identificar a via de saída do ventrículo direito (VSVD) como uma estrutura em forma de meia-lua localizada no canto superior direito para a aorta, continuou com folhetos da válvula pulmonar e artéria pulmonar. </li><li> Manter estável na mesma posição manualmente. Mudar para PW modo Doppler. Nota: uma plataforma da estação para a realização do roedor e a sonda pode ser utilizado para minimizar a movimentação e variação na posição do transdutor. </li><li> Colocar o volume de amostra proximal ao nível da válvula pulmonar no centro da via de saída do ventrículo direito e, em seguida, posicionar o cursor paralelo à direcção do fluxo sanguíneo através do vaso (Figura 3B). Nota: É importante ajustar o ângulo de amostragem para a direcção do fluxo de sangue ou usar o software de ultra-som para corrigir uma alteração no ângulo. Sem correcção, o ângulo máximo para o recipiente é de 30 °, o que corresponde a ~ 15% subestimativa da velocidade. </li><li> AdjUst a escala (a velocidade do fluxo sanguíneo) conforme necessário para obter um &quot;bom&quot; envelope Doppler, que tem bordas brancas e um interior que indica o fluxo sanguíneo laminar oco escuro (Figura 3C). Grave o traçado Doppler. Nota: A &quot;má&quot; envelope Doppler não acomoda bordas brancas suficientes e um buraco escuro. </li><li> Se cateterismo não é realizada neste momento, permitir que o roedor a recuperar se foi utilizada anestesia. Não deixe o roedor autônoma até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal e não devolvê-lo para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Se cateterismo é realizado, prossiga para a Secção 3. </li></ol></li></ol> 3. Direito cateterismo cardíaco <ol><li> abordagem fechado no peito para medição de pressão RV <ol><li> Configuração: <ol><li> Ligue o transdutor de pressão para o canal de entrada 1. No software, defina o canal 1 para pressão e eláel 2 para a frequência cardíaca. </li><li> Para converter unidades para mmHg, gravar o traço da linha de base, efectuar uma calibração de pressão manualmente utilizando um medidor de pressão (se estiver usando um transdutor de pressão arterial e tubos PE). Em seguida, executar a conversão de unidades sob o canal 1. </li><li> Para definir a frequência cardíaca, desligue a entrada do canal 2. Selecione medições cíclicas sob o canal 2 e escolha o canal 1 para fonte e taxa para a medição. </li></ol></li><li> Posicione o mouse / rato debaixo de um microscópio de dissecação com o foco em profundidade e uma ampliação de 5x. </li><li> Faça uma incisão na pele a partir da mandíbula para o esterno (Figura 1). Coloque um par de afastadores de cada lado da incisão para expor totalmente a área do colo do útero. </li><li> Bluntly dissecar para separar as glândulas salivares para expor a veia jugular externa direita usando uma pinça fina ponta romba (Figura 4A, B). </li><li> Cuidadosamente isolar a veia jugular externa direita a partir do tecido conjuntivo circundante. </li> &lt;li&gt; Coloque dois pedaços de fio de seda (4-0 para os ratos; 6-0 para ratos) por baixo da veia jugular externa direita, ligadura da veia para distal (mais próximo à mandíbula quanto possível), e depois amarrar um nó frouxo proximal ( A Figura 4C). </li><li> Use íris tesoura para fazer um pequeno (corte) proximal &quot;nick&quot; ao nó amarrado distal. </li><li> Segure o cateter com uma pinça e inserir o cateter na corte da veia, e depois apertar o nó proximal. Nota: normalmente Usamos polietileno (PE) -10 tubagem (~ 2 Pe tamanho) para ratinhos e PE-50 (~ 3 Pe tamanho) para ratos, o qual está ligado ao transdutor de pressão regular, através de uma agulha G 31, G ou 21 e calibrado. Marcar o cateter com um marcador em um comprimento que corresponde aproximadamente à colocação da ponta do ventrículo direito. Como uma alternativa ao tubo de PE, um cateter de micromanómetro pode ser usado. Puxando o nó distal pode ajudar a introduzir o cateter. </li><li> Empurre cuidadosamente o cateter no coração e o monitor direitoa profundidade de avanço de acordo com a marca. Monitorar o traçado da pressão no software para verificar a localização de cateter e identificar a pressão RV (Figura 5). </li><li> Mantenha o cateter imóvel e recolher os dados (dados de alternância de gravação ao lado do botão Iniciar) por 2 min. </li><li> Proceda da coleta da amostra (Seção 4). </li></ol></li><li> Abordagem Open-peito por RV PV Análise Loop. Nota: análise do lacete PV do ventrículo direito não pode ser realizada com uma abordagem de tórax fechado, devido à rigidez do cateter de condutância, que não passe a partir do VPC para a RA. Comercialmente cateteres condutância disponíveis são projetados para análise do lacete LV PV. <ol><li> No software definir o canal 1 para a condutância; Canal 2 da pressão; e Canal 3 para a frequência cardíaca. </li><li> Entubar os ratos com um tubo de 16 G Teflon e ligar o tubo de um ventilador mecânico. Calcular e definir os parâmetros de ventilação para camundongos ou ratos usando o following fórmulas 6: volume corrente (V t, ml) = 6,2 x M 1,01 (massa M = animal, kg); taxa de respiração (RR, min -1) = 53,5 x M -0.26 (Figura 6A). </li><li> Espalhe álcool a 70% para a pele para reduzir a propagação da pele para o campo cirúrgico. </li><li> Faça uma incisão abaixo do processo xifóide e bilateralmente dissecar a pele com uma tesoura em direção ao flanco. </li><li> Cortar através da parede abdominal e abrir a cavidade abdominal por dissecação bilateral ao longo do diafragma. </li><li> Abra o diafragma para expor a ponta do coração e bilateralmente cortar a caixa torácica (Figura 6A). Evitar a evaporação e secagem por pulverização salina tecido dentro das cavidades torácica e peritoneais utilizando uma seringa. Nota: Normalmente, usamos uma tesoura de dissecção para abrir a cavidade e costela abdominal gaiola. O sangramento geralmente não é significativa, mas se houver sangramento, eletrocautério pode ser usado. </li><li> th cuidadosamente isoladoe veia cava inferior (IVC) a partir do tecido conjuntivo circundante. </li><li> Coloque um pedaço de fio de seda (4-0 para os ratos; 6-0 para ratos) em torno do IVC, e depois amarrar um nó frouxo (ou passe a sutura através de um tubo 16 G Teflon) (Figura 6B). </li><li> Perfurar a parede livre do VD apical com uma agulha de calibre 27-30 paralela à parede livre do VD e remover a agulha. Tenha cuidado para não empurrar a agulha em mais de 4 mm. Nota: Em alternativa, uma pequena peça de tubagem PE-60 pode ser utilizado para guiar a punção do cateter de condutância para o ápice do VD. </li><li> Insira a ponta da condutância cateter através da facada ferida na parede livre do VD apical até que todos os eletrodos estão dentro do ventrículo (Figura 6C). </li><li> Monitorar o ciclo de volume pressão no software e, em seguida, ajuste a posição do cateter para obter alças em forma consistente que não demonstram a variação respiratória significativa (Figura 7B, C). </li><li> Registrobaseline PV laços (dados de alternância de gravação ao lado do botão Iniciar) durante pelo menos 10 segundos para obter um número de PV laços. </li><li> Puxe a sutura colocada ao redor do IVC para alterar as pré-cargas e gravar os loops PV. Analisar os dados off-line e obter vários parâmetros de função sistólica do VD (Figura 7D). Esta análise foi previamente descrita 8. Nota: IVC pode, alternativamente, ser obstruída por fórceps. Monitorar o traçado da pressão RV para confirmar a redução da pré-carga. </li><li> Realizar salina e cuvete calibrações como anteriormente descrito para permitir a conversão de unidades de condutância em unidades de volume 6. </li><li> Depois de gravar os dados, puxe o cateter para fora e coloque a ponta do cateter imediatamente em um banho de água com solução salina. Ao terminar, limpe o cateter de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li></ol> 4. Recolha de coração e pulmão Amostras Observação: Como os procedimentos aqui umre descrito como terminal, o animal deve ser sacrificado após uma fechada ou de tórax aberto coração direito cateterismo. <ol><li> Eutanásia os ratos, abrindo o tórax (toracotomia bilateral) se foi utilizada uma abordagem de tórax fechado, Exsanguinação, ou desligando o ventilador após a overdose do anestésico. Nota: Deslocação cervical não é recomendado. </li><li> Para realizar perfusão inflação do pulmão, ligar o tubo de inflação para um ringstand definido para inflar os pulmões a uma pressão de 20 cm H 2 O (mas não abra a válvula ainda para inflar os pulmões). </li><li> Sem rodeios dissecar a traqueia de circundante músculo e tecido conjuntivo. </li><li> Coloque um pedaço de fio de seda (4-0 para os ratos; 6-0 para ratos) em torno da traqueia, e depois amarrar um nó frouxo. </li><li> Delicadamente esticar a traqueia, pressionando a cabeça e fazer um corte (70% da circunferência) perto da mandíbula. </li><li> Mantenha o alongamento suave e inserir a cânula traqueal (20 G para ratos ou 16 G para ratos).Segurar a cânula usando o fio de sutura. Conectar-se a cânula no tubo de inflação e amarrar a sutura ao redor da cânula para impedir o refluxo de fixadores. </li><li> Lave os pulmões com PBS usando uma seringa de 10 ml para apunhalar parede livre do VD e injetar em direção à artéria pulmonar. Nick átrio esquerdo uma vez que os pulmões começam a branquear. </li><li> Colher o coração, cortando na raiz da aorta. </li><li> Prender o lobo inferior direito do pulmão usando uma pinça hemostática mosquito e cortar o lobo inferior direito. Coloque os pedaços em microtubos e encaixe congelamento em nitrogênio líquido. </li><li> Inflar o pulmão com 10% de formalina tamponada neutra por 5 min e remover a cânula de traqueia seguida por ligação da traqueia. </li><li> Dissecar o pulmão para fora do tórax e corrigir com 10% de formalina tamponada neutra. Nota: Em alternativa, inflar o pulmão com os meios de corte óptima (OCT, diluída 1: 1 com PBS) e congelar em OCT não diluída para uma preparação mais tarde de secções congeladas. </li><li> Cuidadosamenteseparar os átrios dos ventrículos e isolar a parede livre do ventrículo direito dissecando ao lado do septo interventricular. </li><li> Pesar a RV e LV + septo (LV + S) para calcular um índice de Fulton (RV / LV + S) 9, que quantifica o grau de hipertrofia do VD. Nota: TheFulton índice varia em diferentes modelos de PH. Rat 10: controle, 0,28 ± 0,01; induzida por hipoxia, 0,57 ± 0,02; tratados com MCT, 0,51 ± 0,03. Rato C57BL6 / J 11: controle, 0,26 ± 0,01; SuHx (14 dias), 0,40 ± 0,02; SuHx (21 dias), 0,43 ± 0,01; SuHx (28 dias), 0,44 ± 0,03. </li><li> Snap congelar a RV e LV + S em nitrogênio líquido ou fixar em 10% de formalina tamponada neutra. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os protocolos descritos aqui descrevem uma caracterização abrangente da hemodinâmica e da função ventricular direita em modelos de hipertensão pulmonar em roedores. Embora o cateterismo cardíaco direito, conforme descrito aqui, seja um procedimento terminal, a mortalidade associada à ecocardiografia é mínima, o que permite a triagem e o acompanhamento da progressão da doença. No entanto, semelhante aos pacientes com HP que aumentaram acentuadamente a mortalidade com anestesia17, em nossa experiência, ratos com...

A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença da vasculatura pulmonar associada a infiltração de células inflamatórias, a proliferação do músculo liso e a apoptose de células endoteliais. Estas alterações resultam em obliteração das arteríolas pulmonares, posteriormente, levando à ventrículo direito (RV) disfunção e insuficiência cardíaca. A fim de compreender a fisiopatologia subjacente PAH e falência do VD na HAP, um número de diferentes modelos, incluindo modelos genéticos e farmacológicos, para estudar esta doença têm sido desenvolvidos (revisto em outros lugares 1,2). Destes modelos, os mais populares são (Hx) HAP induzida por hipoxia no mouse ea monocrotalina (MCT) e modelos SU5416-hipoxia (SuHx) no rato. No modelo de rato Hx, os ratinhos são expostos a 4 semanas de hipóxia (quer normobáricas ou hipobárica, o que corresponde a uma altitude de 18.000 pés com uma FiO2 de 0,10), com o desenvolvimento resultante de proliferação medial, o aumento da RV Systpressões Olic e o desenvolvimento de hipertrofia do VD 3. MCT numa dose única de 60 mg / kg resulta em lesão para as células endoteliais pulmonares através de um mecanismo claro que, em seguida, resulta no desenvolvimento de HAP 4. SU5416 é um inibidor dos receptores vasculares factor de crescimento endotelial (VEGFR) 1 e 2 bloqueador, e o tratamento com uma única injecção subcutânea de 60 mg / kg, seguida de exposição a hipoxia crónica durante 3 semanas resulta em hipertensão pulmonar permanente com alterações patológicas similares à observada na doença humana, com a formação de lesões vasculares obliterante 5. Nos últimos anos, diversos modelos de ratinho transgénicos para a hipertensão pulmonar tem sido desenvolvido. Estes incluem nocaute e mutações do receptor de proteína morfogenética óssea 2 (BMPR2), como mutações genéticas BMPR2 são encontrados em ambas as formas familiares e idiopática da HAP, heme oxigenase-1 nocaute e IL-6 superexpressão (revisto em outros lugares 1,2). Estes modelos de roedores diferentes de PH têm diferentes níveis de hipertensão pulmonar, hipertrofia RV e falência do VD. Enquanto a hipóxia e vários modelos de camundongos transgênicos resultar em PAH muito mais suave do que a qualquer modelo de rato 1, permite que testes de diferentes mutações genéticas e suas vias de sinalização molecular associados. O modelo MCT não resultar na HAP grave, embora MCT parece ser tóxico para as células endoteliais em diversos tecidos 4. O modelo SuHx é caracterizada por alterações vasculares mais semelhante ao observado em HAP idiopática em seres humanos, embora tanto a exposição requer manipulação e hipóxia farmacológico. Além disso, em todos estes modelos, pode haver uma separação entre as alterações histopatológicas, as pressões pulmonares e função do VD associados com o desenvolvimento de hipertensão arterial pulmonar. Isto está em contraste com a doença humana, onde há normalmente uma relação proporcional entre as alterações histopatológicas, a gravidade da pulmonhipertensão ary e do grau de falência do VD. Assim, uma caracterização detalhada destes modelos de roedores de PH é necessária, e envolve avaliações da função RV (tipicamente por ecocardiografia), hemodinâmica (por cateterismo cardíaco) e histopatologia do coração e pulmões (de colheita de tecidos). Neste protocolo, descrevemos as técnicas básicas usadas para a caracterização hemodinâmica de modelos de HAP no rato e do rato. Estas técnicas gerais pode ser aplicado a qualquer estudo do ventrículo direito e vasculatura pulmonar e não está limitado aos modelos de HAP. Visualizando o RV por ecocardiografia é relativamente simples em ratos, mas é mais desafiador em camundongos devido ao seu tamanho e da geometria complexa da RV. Além disso, alguns substitutos utilizados para quantificar a função do VD, como TAPSE, artéria pulmonar (AP) tempo de aceleração e PA Doppler onda chan, não são bem validadas em humanos e correlacionar apenas fracamente com a avaliação de puhipertensão lmonary e função RV por hemodinâmica invasiva. Determinação dos hemodinâmica RV é o melhor feito com um de tórax fechado, para manter os efeitos de uma pressão negativa intratorácica com a inspiração, embora cateterismo peito aberto com um cateter de impedância permite a determinação da pressão-volume (PV) loops e uma caracterização hemodinâmica mais detalhada . Como com qualquer procedimento, desenvolver a experiência com os procedimentos é fundamental para o sucesso experimental.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Imagem Vevo 2100 (120V)&nbsp;</td><td>VisualSonics, inc.&nbsp;</td><td>Estação de Imagem VS-11945</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>VisualSonics, inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transdutores Mecânicos de Alta Frequência</td><td>VisualSonics, inc.&nbsp;</td><td>MS250, MS550D, MS400</td><td></td></tr><tr><td>Gel de Ultrassom Parker&nbsp;</td><td>Laboratories Inc.&nbsp;</td><td>01-08</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 4/35</td><td>ADInstruments</td><td>ML765</td><td></td></tr><tr><td>Labchart 8</td><td>ADInstruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BP transdutor com torneira e cabo</td><td>ADInstruments</td><td>MLT1199</td><td></td></tr><tr><td>kit de calibração de transdutor BP</td><td>ADInstruments</td><td>MLA1052</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Tip Pressure Catheter para mouse</td><td>Millar</td><td>SPR-1000</td><td>Cateter alternativo disponível na Scisense FT111B (camundongo) e FT211B (rato)</td></tr><tr><td>Cateter de pressão Mikro-Tip para rato</td><td>Millar</td><td>SPR-513</td><td>Cateter alternativo disponível na Scisense FT111B (camundongo) e FT211B (rato)</td></tr><tr><td>Millar Mikro-Tip&nbsp; cateter de loop PV ultra-miniatura para camundongos</td><td>Millar</td><td>PVR-1035</td><td>Cateter alternativo disponível na Scisense FT112 (mouse)</td></tr><tr><td>Cateter de loop PV ultra miniatura Millar Mikro-Tip para ratos</td><td>Millar</td><td>SPR-869</td><td>Cateter alternativo disponível na Scisense FT112 (mouse)</td></tr><tr><td>Sistema PV Millar MPVS-300&nbsp;</td><td>Millar</td><td>MPVS-300</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Trança de Seda Preta Carretel de 100 Jardas</td><td>Roboz Surgical</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Trança de Seda Preta Carretel de 100 Jardas</td><td>Roboz Surgical</td><td>SUT-14-1</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Iris, Delicada, Integra Miltex</td><td>VWR</td><td>21909-248</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação VWR, Ponta Afiada/Romba</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>VWR Tesoura Delicada, 4 1/2"</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatos de duas estrelas, Excelta</td><td>VWR</td><td>63042-090</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>Crotaline</td><td>Sigma</td><td>C2401</td><td></td></tr><tr><td>SU5416</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3037</td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X Boom Stand Trinocular Zoom Stereo Microscope&nbsp;</td><td>AmScope</td><td>SM-3BX</td><td></td></tr><tr><td>PE (Tubo de Polietileno)-10</td><td>Braintree Scientific Inc</td><td>PE10 36 FT</td><td></td></tr><tr><td>PE (Tubo de Polietileno)-50</td><td>Braintree Scientific Inc</td><td>PE50 36 FT</td><td></td></tr><tr><td>PE (Tubo de Polietileno)-60</td><td>Braintree Scientific Inc</td><td>PE60 36 FT</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Anestesia de Isoflurano de Mesa</td><td>Kent Scientific</td><td>ACV-1205S</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma cirúrgica multifuncional Surgisuite</td><td>Kent Scientific</td><td>Surgisuite</td><td></td></tr><tr><td>Retractor set</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-5002</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de indução de anestesia</td><td>VetEquip</td><td>941443</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia Recipiente do filtro de gás</td><td>Kent Scientific</td><td>ACV-2001</td><td></td></tr><tr><td>Cone de nariz de roedor</td><td>VetEquip</td><td>921431</td><td></td></tr></tbody></table>

hemodinâmica caracterização de roedores modelos de hipertensão arterial pulmonar

Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension

A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença rara da vasculatura pulmonar caracterizada por apoptose de células endoteliais, proliferação de músculo liso e obliteração das arteríolas pulmonares. Isso, por sua vez, resulta em insuficiência ventricular direita (VD), com morbidade e mortalidade significativas. Modelos de HAP em roedores, no camundongo e no rato, são importantes para a compreensão da fisiopatologia subjacente a essa doença rara. Notavelmente, diferentes modelos de HAP podem estar associados a diferentes graus de hipertensão pulmonar, hipertrofia do VD e insuficiência do VD. Portanto, uma caracterização hemodinâmica completa de camundongos e ratos com HAP é fundamental para determinar os efeitos de drogas ou modificações genéticas sobre a doença. 
Aqui demonstramos procedimentos padrão para avaliação da função ventricular direita e hemodinâmica em modelos de HAP em ratos e camundongos. A ecocardiografia é útil para determinar a função do VD em ratos, embora a obtenção de visualizações padrão do ventrículo direito seja um desafio no camundongo acordado. O acesso para cateterismo cardíaco direito é obtido pela veia jugular interna em camundongos e ratos de tórax fechado. As pressões podem ser medidas usando tubos de polietileno com um transdutor de pressão de fluido ou um cateter de pressão de micromanômetro em miniatura. A análise do loop pressão-volume pode ser realizada no tórax aberto. Após a obtenção da hemodinâmica, o roedor é sacrificado. O coração pode ser dissecado para separar a parede livre do VD do ventrículo esquerdo (VE) e do septo, permitindo uma avaliação da hipertrofia do VD pelo índice de Fulton (VD/(VE+S)). Em seguida, as amostras podem ser colhidas do coração, pulmões e outros tecidos, conforme necessário.

Como cateterismo cardíaco direito em roedores é tipicamente um procedimento terminal que não é aplicável ao acompanhamento longitudinal, a ecocardiografia é uma excelente alternativa não invasiva para o rastreio e seguimento 12. Enquanto a pressão sistólica da artéria pulmonar em PAH humana no ecocardiograma geralmente é derivada de insuficiência tricúspide que normalmente é fácil de ser obtido na vista apical, tal visão não é obtido de forma confiável em roedores, impedindo que a estimativa da pressão sistól...

A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença das arteríolas pulmonares que leva à sua obliteração e ao desenvolvimento de insuficiência ventricular direita. Modelos de HAP em roedores são essenciais para a compreensão da fisiopatologia da HAP. Aqui demonstramos a caracterização hemodinâmica, com cateterismo cardíaco direito e ecocardiografia, em camundongos e ratos.

Hemodinâmica Caracterização de roedores modelos de Hipertensão Arterial Pulmonar

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle ...

O objetivo geral da ecocardiografia e da cateterização do lado direito do coração em roedores é determinar a função do coração direito em diversos modelos de doenças cardíacas e pulmonares. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na pesquisa de fisiologia cardiovascular, como, quais são os efeitos de manipulações genéticas ou de drogas sobre o desenvolvimento da hipertensão pulmonar? A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma análise abrangente da função do coração direito nesses modelos de doenças cardíacas e pulmonares.Para visualizar o eixo longo parasternal do coração de um roedor, comece posicionando um roedor anestesiado em posição supina. Confirme o nível apropriado de sedação mediante compressão dos dedos dos pés e aplique pomada veterinária nos olhos do animal. Em seguida, depile o tórax e aplique gel ultrassonográfico.Selecione o Modo B para projetar uma imagem viva 2D. Em seguida, alinhe um transdutor de ultrassom com a frequência apropriada à linha paraesternal esquerda. Gire o transdutor no sentido anti-horário em 30 graus, com o indicador da sonda apontando na direção caudal.Em seguida, incline levemente o transdutor, movendo o instrumento suavemente ao longo do eixo curto do transdutor no mesmo plano tomográfico para obter uma visão completa da câmara do ventrículo esquerdo no centro da tela. Localize e visualize a luz do ventrículo esquerdo, o septo interventricular, a luz do ventrículo direito, a aorta ascendente e o átrio esquerdo. Para visualizar o eixo curto paraesternal no nível aórtico, em modo B, gire o transdutor 90 graus e incline-o em direção à cabeça para identificar a vista em corte transversal da válvula aórtica.A seguir, mantendo o transdutor estável na mesma posição, alterne para o modo Doppler de onda de pulso. Em seguida, posicione o volume de amostragem próximo ao nível da valva pulmonar, no centro do trato de saída do ventrículo direito, e alinhe o cursor paralelamente à direção do fluxo sanguíneo através do vaso. Ajuste a escala ao longo da direção do fluxo sanguíneo conforme necessário para obter um bom envelope Doppler, ou seja, uma imagem com bordas brancas e um interior escuro e oco, indicativo de fluxo sanguíneo laminar, e registre o traçado Doppler.Para realizar uma cateterização cardíaca direita por toracotomia fechada, posicione o roedor anestesiado sob um microscópio de dissecação e faça uma incisão na pele do mandíbulo até o esterno. Coloque um par de afastadores em cada lado da incisão para expor completamente a região cervical. Em seguida, separe as glândulas salivares por dissecação romba, seguido pelo uso de pinças finas de ponta romba para expor a veia jugular externa direita.Isolar cuidadosamente a veia jugular externa direita do tecido conjuntivo circundante e posicionar dois pedaços de fio de seda sob a veia jugular externa direita. Realizar a ligadura distal da veia o mais próximo possível da mandíbula e fazer um nó solto proximalmente. Com uma tesoura de íris, fazer uma pequena incisão na veia jugular externa proximal ao nó amarrado distalmente.Em seguida, marque o cateter em um comprimento aproximadamente correspondente ao da veia jugular externa até o coração. Depois, usando pinça, insira o cateter na incisão e aperte o nó proximal. Empurre suavemente o cateter até o coração direito, monitorando a profundidade de avanço de acordo com a marca no cateter e verificando a localização do cateter in loco por meio do traçado de pressão no monitor do computador.Uma vez identificado um traçado da pressão ventricular direita, estabilize o cateter para a coleta de dados. Para obter loops de pressão-volume ventricular direita, em seguida entube o roedor. Então, faça uma incisão abaixo do processo xifoide e disseque bilateralmente a pele com tesoura em direção à região lombar.Para abrir a cavidade abdominal através da parede abdominal, realize uma dissecação bilateral através da parede abdominal abaixo do diafragma. Em seguida, abra o diafragma para expor o ápice do coração e corte bilateralmente a caixa torácica. Isole cuidadosamente a veia cava inferior dos tecidos conjuntivos circundantes e coloque gaze estéril embebida em solução salina normal sobre a cavidade abdominal e os locais de intubação.Em seguida, utilizando um pequeno pedaço de tubo PE 60, guie a punção do cateter de condutância até o ápice do ventrículo direito e insira a ponta do cateter através da incisão até que todos os eletrodos estejam dentro do ventrículo. Agora, monitore o laço de pressão-volume no software, ajustando a posição do cateter conforme necessário para obter laços com formato consistente e que não apresentem variação respiratória significativa. Para obter uma família de laços de pressão-volume, aplique suavemente pressão à veia cava inferior para reduzir o enchimento ventricular direito.Vários parâmetros hemodinâmicos podem então ser calculados a partir desses dados. Para realizar a perfusão com insuflação do pulmão, primeiro conecte o tubo de insuflação a um suporte em anel. Em seguida, dissecar cuidadosamente a traqueia a partir do músculo circundante e do tecido conjuntivo, e coloque um pedaço de sutura de seda ao redor da traqueia.Em seguida, faça um nó solto na sutura, pressione a cabeça para esticar suavemente a traqueia e corte 70% da circunferência da traqueia próxima à mandíbula. Mantendo a traqueia esticada, insira uma cânula traqueal e fixe a cânula com uma sutura. Conecte a cânula ao tubo de insuflação, depois perfure a parede do ventrículo direito com uma seringa de 10 mililitros cheia com PBS e lave os pulmões, injetando em direção à artéria pulmonar.Quando os pulmões começarem a embranquecer, faça um pequeno corte no átrio esquerdo uma vez. Em seguida, corte a raiz da aorta para colher o coração. Por fim, insufle os pulmões com formalina neutra tamponada a 10% durante cinco minutos e remova a cânula traqueal.Em seguida, ligue a traqueia, retire o pulmão da cavidade torácica e fixe o tecido pulmonar com formalina neutra tamponada a 10% fresca. Uma visão parasternal no eixo curto ao nível aórtico pode ser facilmente visualizada em roedores, permitindo o registro e a mensuração de traçados Doppler arteriais pulmonares, cujas formas estão associadas ao grau de hipertensão pulmonar. Em uma cateterização cardíaca direita com tórax fechado de um camundongo exposto à hipóxia crônica, a pressão sistólica do ventrículo direito está elevada a 45 milímetros de mercúrio, compatível com hipertensão pulmonar significativa.Em uma cateterização cardíaca direita com tórax aberto em um rato normal, a pressão sistólica do ventrículo direito é observada em um nível significativamente mais baixo, de 27 milímetros de mercúrio. O procedimento pode ser completado em poucos minutos, caso a técnica seja dominada e realizada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir que o roedor esteja adequadamente anestesiado e que não haja fontes significativas de sangramento ou desidratação tecidual que possam resultar em hipervolemia.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma caracterização hemodinâmica abrangente do coração direito. A prática é fundamental para dominar essas técnicas.

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Research

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