2.11: Mapa de destino

Os biólogos do desenvolvimento usam o mapeamento do destino como uma ferramenta para rastrear linhagens celulares enquanto um organismo amadurece. Isso é feito rotulando as células em um estágio embrionário e, em seguida, rastreando-as e sua progênie ao longo do desenvolvimento do organismo. O mapeamento do destino também é usado para estudar a migração e diferenciação celular durante o desenvolvimento, bem como a regeneração e reparo durante a idade adulta.

Este vídeo fornecerá uma visão geral do mapeamento do destino, explicará um protocolo usado para gerar um mapa do destino no peixe-zebra e mostrará algumas maneiras pelas quais essa técnica está sendo aplicada atualmente em laboratórios.

Antes de entrar nos detalhes processuais, vamos discutir o que é um mapa de destino e como ele é construído.

Em experimentos clássicos de mapeamento de destino, os cientistas coraram grupos de células em um embrião inicial, como aqueles no estágio de gástrula, com um corante que seria passado para todos os descendentes dessas células. Depois de permitir que o embrião se desenvolvesse por um certo período de tempo, eles viram as células coradas no organismo mais maduro. A localização das células coradas no organismo maduro foi então anotada. Os resultados combinados de vários experimentos semelhantes permitiram a construção de um diagrama conhecido como mapa do destino.

Portanto, um mapa de destino é um plano geral que descreve o destino de cada parte de um embrião inicial. Esses mapas ajudam os cientistas a determinar coisas como quais células embrionárias se diferenciam em quais células adultas funcionais e como elas migram e se organizam em estruturas maduras.

Os cientistas usaram muitos organismos modelo para criar mapas de destino, incluindo sapos, nematóides, peixes, filhotes e camundongos. Alguns organismos modelo, como o peixe-zebra Danio rerio, têm uma vantagem adicional neste tipo de experimento. Como são pequenos e permanecem transparentes durante grande parte do processo de desenvolvimento, os cientistas podem rastrear facilmente as células visualizando os peixes sob um microscópio de luz. É importante ressaltar que os avanços nas técnicas de marcação de células agora permitem que os cientistas marquem com precisão células individuais e as rastreiem à medida que o organismo se desenvolve, o que ajuda na criação de um mapa de destino extremamente detalhado.

Agora que você tem uma ideia sobre o que são mapas de destino, vamos discutir um protocolo para mapeamento de destino em peixe-zebra que usa fotoativação. Essa abordagem relativamente nova depende de proteínas fotoativáveis. Estas são proteínas fluorescentes especiais, que são "enjauladas", o que significa que são mantidas em uma conformação específica para evitar a fluorescência. A aplicação de um pulso de laser controlado causa uma mudança conformacional, conhecida como "desenjaulamento", que resulta em fluorescência visível.

Para realizar este experimento, essas proteínas especializadas em gaiolas são primeiro sintetizadas e depois injetadas em um ou dois embriões de peixe-zebra em estágio celular. Em seguida, os embriões podem amadurecer até o estágio de desenvolvimento desejado antes da fotoativação.

Em seguida, para preparar o peixe para a fotoativação, os embriões são descorionados para tornar o tecido alvo acessível. Em seguida, eles são montados em um meio opticamente transparente, como agarose de baixa temperatura de fusão, que os mantém com segurança em uma posição estável. As amostras são alinhadas para expor a área de interesse e montadas em um microscópio equipado com laser. Um pulso de laser é aplicado à área alvo contendo células de interesse, induzindo a fotoativação.

Após o tratamento a laser, os embriões são cuidadosamente removidos da agarose e devolvidos ao seu ambiente natural até que o estágio de desenvolvimento desejado seja alcançado. Para rastrear as células fotoativadas, os embriões são novamente incorporados em agarose de baixa temperatura de fusão, e as células fotoativadas podem então ser visualizadas e rastreadas usando fluorescência direta ou imunocoloração.

Agora que você tem uma compreensão geral de um protocolo de mapeamento de destino, vamos dar uma olhada em alguns experimentos de laboratório que aproveitam esse procedimento.

Além de estudar o desenvolvimento embrionário, o mapeamento do destino pode ser usado para examinar o reparo em sistemas maduros. Neste experimento, um subtipo de célula específico foi ablacionado de uma retina transgênica de peixe-zebra. Os cientistas então rastrearam células-tronco adultas residentes geneticamente marcadas para determinar seu destino após a lesão. Por fim, foi realizada a análise de imagens, que demonstrou ativação de células-tronco adultas e posterior reparo tecidual.

Os cientistas também estão usando protocolos semelhantes para entender o destino das células-tronco transplantadas. Aqui, células-tronco embrionárias humanas geneticamente marcadas, ou hESCs, foram transplantadas para um modelo de camundongo imunocomprometido. As células implantadas foram diferenciadas por 8 a 12 semanas, após as quais o teratoma resultante, que é um tumor que contém tecido de várias camadas germinativas, foi colhido, fixado e imunocorado para determinar o destino das células-tronco implantadas. Esse tipo de experimento ajuda os cientistas a confirmar o potencial diferenciado in vivo das células-tronco cultivadas.

Como mencionado anteriormente, os cientistas realizam procedimentos de mapeamento de destino em vários organismos modelo, incluindo mamíferos. Neste estudo em particular, os cientistas marcaram células em uma região específica de um embrião de camundongo inicial usando abordagens genéticas induzíveis. Isso é feito administrando um agente indutor a uma rata grávida que carrega descendentes geneticamente modificados. As células marcadas foram rastreadas ao longo dos estágios posteriores de desenvolvimento, o que ajudou os cientistas a determinar seu destino final.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre mapeamento de destino. Este vídeo forneceu algumas dicas sobre a criação de mapas de destino, revisou um protocolo específico de mapeamento de destino e discutiu algumas das modificações e aplicações dessa técnica extremamente útil. Como sempre, obrigado por assistir!