Mapa de destino
Biólogos do desenvolvimento usam o mapeamento do destino como uma ferramenta para rastrear linhagens celulares enquanto um organismo amadurece. Isso é feito rotulando células em um estágio embrionário e, em seguida, rastreando-as e sua descendência durante todo o desenvolvimento do organismo. O mapeamento de destinos também é usado para estudar a migração celular e a diferenciação durante o desenvolvimento, bem como a regeneração e reparação durante a vida adulta.
Este vídeo fornecerá uma visão geral do mapeamento do destino, explicará um protocolo usado para gerar um mapa do destino em zebrafish, e mostrará algumas maneiras pelas quais essa técnica está sendo aplicada em laboratórios.
Antes de entrar nos detalhes processuais, vamos discutir o que é um mapa do destino e como ele é construído.
Em experimentos clássicos de mapeamento do destino, os cientistas mancharam grupos de células em um embrião inicial, como os do estágio gastrula, com um corante que seria passado para todos os descendentes dessas células. Depois de permitir que o embrião se desenvolvesse por um determinado período de tempo, eles viram as células manchadas no organismo mais maduro. A localização de células manchadas no organismo maduro foi então notada. Resultados agrupados de vários experimentos semelhantes permitiram a construção de um diagrama conhecido como mapa do destino.
Portanto, um mapa do destino é um plano global que descreve o destino de cada parte de um embrião precoce. Esses mapas ajudam os cientistas a determinar coisas como quais células embrionárias se diferenciam em quais células adultas funcionais e como migram e se organizam em estruturas maduras.
Cientistas têm usado muitos organismos modelo para criar mapas do destino, incluindo sapos, nematoides, peixes, filhotes e ratos. Alguns organismos modelo, como o zebrafish Danio rerio,têm uma vantagem adicional nesse tipo de experimento. Como são pequenos e permanecem transparentes durante grande parte do processo de desenvolvimento, os cientistas podem facilmente rastrear as células vendo os peixes sob um microscópio leve. É importante ressaltar que os avanços nas técnicas de rotulagem celular agora permitem que os cientistas marquem com precisão células únicas e as rastreiem à medida que o organismo se desenvolve, o que ajuda na criação de um mapa de destino extremamente detalhado.
Agora que você tem uma ideia sobre o que são mapas do destino, vamos discutir um protocolo para mapeamento do destino em zebrafish que usa fotoativação. Esta abordagem relativamente nova depende de proteínas fotoativas. São proteínas fluorescentes especiais, que são "enjauladas", o que significa que são mantidas em uma conformação específica para evitar a fluorescência. A aplicação de um pulso laser controlado causa uma alteração conformacional, chamada de "uncaging", que resulta em fluorescência visível.
Para realizar este experimento, essas proteínas enjauladas especializadas são primeiro sintetizadas e depois injetadas em um ou dois embriões de zebrafish estágio celular. Em seguida, os embriões podem amadurecer até o estágio de desenvolvimento desejado antes da fotoativação.
Em seguida, para preparar o peixe para fotoativação, os embriões são descorrioados para tornar o tecido alvo acessível. Em seguida, eles são montados em um meio opticamente claro, como a baixa temperatura de fusão agarose, que os mantém com segurança em uma posição estável. As amostras estão alinhadas para expor a área de interesse, e montadas em um microscópio equipado com laser. Um pulso laser é aplicado na área alvo contendo células de interesse, induzindo a fotoativação.
Após o tratamento a laser, os embriões são cuidadosamente removidos da agarose e devolvidos ao seu ambiente natural até que o estágio de desenvolvimento desejado seja alcançado. Para rastrear as células fotoativadas, os embriões são novamente incorporados em baixa temperatura de fusão, e as células fotoativadas podem então ser visualizadas e rastreadas usando fluorescência direta ou imunostaining.
Agora que você tem uma compreensão geral de um protocolo de mapeamento do destino, vamos dar uma olhada em alguns experimentos de laboratório que se aproveitam deste procedimento.
Além de estudar o desenvolvimento embrionário, o mapeamento do destino pode ser usado para examinar o reparo em sistemas maduros. Neste experimento, um subtipo celular específico foi ablado de uma retina de zebrafish transgênico. Os cientistas então rastrearam células-tronco adultas geneticamente rotuladas para determinar seu destino após a lesão. Por fim, foi realizada a análise da imagem, que demonstrou ativação de células-tronco adultas e posterior reparação tecidual.
Os cientistas também estão usando protocolos semelhantes para entender os destinos das células-tronco transplantadas. Aqui, células-tronco embrionárias humanas geneticamente marcadas, ou hESCs, foram transplantadas em um modelo de camundongo imunocomprometido. As células implantadas foram autorizadas a diferenciar-se por 8-12 semanas, após a qual o teratoma resultante, que é um tumor que contém tecido de múltiplas camadas germinativas, foi colhido, fixo e imunossundo para determinar o destino das células-tronco implantadas. Esse tipo de experimento ajuda os cientistas a confirmar o potencial in vivo diferenciativo das células-tronco cultivadas.
Como mencionado anteriormente, os cientistas realizam procedimentos de mapeamento do destino em vários organismos modelo, incluindo mamíferos. Neste estudo em particular, os cientistas marcaram células em uma região específica de um embrião de camundongos precoce usando abordagens genéticas indutíveis. Isso é feito administrando um agente indutor a um rato grávida que carrega descendentes geneticamente modificados. As células rotuladas foram rastreadas ao longo de estágios de desenvolvimento posteriores, o que ajudou os cientistas a determinar seu destino final.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre o mapeamento do destino. Este vídeo forneceu algumas informações sobre a criação de mapas de destino, revisou um protocolo específico de mapeamento do destino e discutiu algumas das modificações e aplicações desta técnica extremamente útil. Como sempre, obrigado por assistir!
O mapeamento do destino é uma técnica usada para entender como as células embrionárias se dividem, diferenciam e migram durante o desenvolvimento. Em…
Biólogos do desenvolvimento usam o mapeamento do destino como uma ferramenta para rastrear linhagens celulares enquanto um organismo amadurece. Isso é feito rotulando células em um estágio embrionário e, em seguida, rastreando-as e sua descendência durante todo o desenvolvimento do organismo. O mapeamento de destinos também é usado para estudar a migração celular e a diferenciação durante o desenvolvimento, bem como a regeneração e reparação durante a vida adulta.
Este vídeo fornecerá uma visão geral do mapeamento do destino, explicará um protocolo usado para gerar um mapa do destino em zebrafish, e mostrará algumas maneiras pelas quais essa técnica está sendo aplicada em laboratórios.
Antes de entrar nos detalhes processuais, vamos discutir o que é um mapa do destino e como ele é construído.
Em experimentos clássicos de mapeamento do destino, os cientistas mancharam grupos de células em um embrião inicial, como os do estágio gastrula, com um corante que seria passado para todos os descendentes dessas células. Depois de permitir que o embrião se desenvolvesse por um determinado período de tempo, eles viram as células manchadas no organismo mais maduro. A localização de células manchadas no organismo maduro foi então notada. Resultados agrupados de vários experimentos semelhantes permitiram a construção de um diagrama conhecido como mapa do destino.
Portanto, um mapa do destino é um plano global que descreve o destino de cada parte de um embrião precoce. Esses mapas ajudam os cientistas a determinar coisas como quais células embrionárias se diferenciam em quais células adultas funcionais e como migram e se organizam em estruturas maduras.
Cientistas têm usado muitos organismos modelo para criar mapas do destino, incluindo sapos, nematoides, peixes, filhotes e ratos. Alguns organismos modelo, como o zebrafish Danio rerio,têm uma vantagem adicional nesse tipo de experimento. Como são pequenos e permanecem transparentes durante grande parte do processo de desenvolvimento, os cientistas podem facilmente rastrear as células vendo os peixes sob um microscópio leve. É importante ressaltar que os avanços nas técnicas de rotulagem celular agora permitem que os cientistas marquem com precisão células únicas e as rastreiem à medida que o organismo se desenvolve, o que ajuda na criação de um mapa de destino extremamente detalhado.
Agora que você tem uma ideia sobre o que são mapas do destino, vamos discutir um protocolo para mapeamento do destino em zebrafish que usa fotoativação. Esta abordagem relativamente nova depende de proteínas fotoativas. São proteínas fluorescentes especiais, que são "enjauladas", o que significa que são mantidas em uma conformação específica para evitar a fluorescência. A aplicação de um pulso laser controlado causa uma alteração conformacional, chamada de "uncaging", que resulta em fluorescência visível.
Para realizar este experimento, essas proteínas enjauladas especializadas são primeiro sintetizadas e depois injetadas em um ou dois embriões de zebrafish estágio celular. Em seguida, os embriões podem amadurecer até o estágio de desenvolvimento desejado antes da fotoativação.
Em seguida, para preparar o peixe para fotoativação, os embriões são descorrioados para tornar o tecido alvo acessível. Em seguida, eles são montados em um meio opticamente claro, como a baixa temperatura de fusão agarose, que os mantém com segurança em uma posição estável. As amostras estão alinhadas para expor a área de interesse, e montadas em um microscópio equipado com laser. Um pulso laser é aplicado na área alvo contendo células de interesse, induzindo a fotoativação.
Após o tratamento a laser, os embriões são cuidadosamente removidos da agarose e devolvidos ao seu ambiente natural até que o estágio de desenvolvimento desejado seja alcançado. Para rastrear as células fotoativadas, os embriões são novamente incorporados em baixa temperatura de fusão, e as células fotoativadas podem então ser visualizadas e rastreadas usando fluorescência direta ou imunostaining.
Agora que você tem uma compreensão geral de um protocolo de mapeamento do destino, vamos dar uma olhada em alguns experimentos de laboratório que se aproveitam deste procedimento.
Além de estudar o desenvolvimento embrionário, o mapeamento do destino pode ser usado para examinar o reparo em sistemas maduros. Neste experimento, um subtipo celular específico foi ablado de uma retina de zebrafish transgênico. Os cientistas então rastrearam células-tronco adultas geneticamente rotuladas para determinar seu destino após a lesão. Por fim, foi realizada a análise da imagem, que demonstrou ativação de células-tronco adultas e posterior reparação tecidual.
Os cientistas também estão usando protocolos semelhantes para entender os destinos das células-tronco transplantadas. Aqui, células-tronco embrionárias humanas geneticamente marcadas, ou hESCs, foram transplantadas em um modelo de camundongo imunocomprometido. As células implantadas foram autorizadas a diferenciar-se por 8-12 semanas, após a qual o teratoma resultante, que é um tumor que contém tecido de múltiplas camadas germinativas, foi colhido, fixo e imunossundo para determinar o destino das células-tronco implantadas. Esse tipo de experimento ajuda os cientistas a confirmar o potencial in vivo diferenciativo das células-tronco cultivadas.
Como mencionado anteriormente, os cientistas realizam procedimentos de mapeamento do destino em vários organismos modelo, incluindo mamíferos. Neste estudo em particular, os cientistas marcaram células em uma região específica de um embrião de camundongos precoce usando abordagens genéticas indutíveis. Isso é feito administrando um agente indutor a um rato grávida que carrega descendentes geneticamente modificados. As células rotuladas foram rastreadas ao longo de estágios de desenvolvimento posteriores, o que ajudou os cientistas a determinar seu destino final.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre o mapeamento do destino. Este vídeo forneceu algumas informações sobre a criação de mapas de destino, revisou um protocolo específico de mapeamento do destino e discutiu algumas das modificações e aplicações desta técnica extremamente útil. Como sempre, obrigado por assistir!
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Biólogos do desenvolvimento usam o mapeamento do destino como uma ferramenta para rastrear linhagens celulares enquanto um organismo amadurece. Isso é feito rotulando células em um estágio embrionário e, em seguida, rastreando-as e sua descendência durante todo o desenvolvimento do organismo. O mapeamento de destinos também é usado para estudar a migração celular e a diferenciação durante o desenvolvimento, bem como a regeneração e reparação durante a vida adulta.
Este vídeo fornecerá uma visão geral do mapeamento do destino, explicará um protocolo usado para gerar um mapa do destino em zebrafish, e mostrará algumas maneiras pelas quais essa técnica está sendo aplicada em laboratórios.
Antes de entrar nos detalhes processuais, vamos discutir o que é um mapa do destino e como ele é construído.
Em experimentos clássicos de mapeamento do destino, os cientistas mancharam grupos de células em um embrião inicial, como os do estágio gastrula, com um corante que seria passado para todos os descendentes dessas células. Depois de permitir que o embrião se desenvolvesse por um determinado período de tempo, eles viram as células manchadas no organismo mais maduro. A localização de células manchadas no organismo maduro foi então notada. Resultados agrupados de vários experimentos semelhantes permitiram a construção de um diagrama conhecido como mapa do destino.
Portanto, um mapa do destino é um plano global que descreve o destino de cada parte de um embrião precoce. Esses mapas ajudam os cientistas a determinar coisas como quais células embrionárias se diferenciam em quais células adultas funcionais e como migram e se organizam em estruturas maduras.
Cientistas têm usado muitos organismos modelo para criar mapas do destino, incluindo sapos, nematoides, peixes, filhotes e ratos. Alguns organismos modelo, como o zebrafish Danio rerio,têm uma vantagem adicional nesse tipo de experimento. Como são pequenos e permanecem transparentes durante grande parte do processo de desenvolvimento, os cientistas podem facilmente rastrear as células vendo os peixes sob um microscópio leve. É importante ressaltar que os avanços nas técnicas de rotulagem celular agora permitem que os cientistas marquem com precisão células únicas e as rastreiem à medida que o organismo se desenvolve, o que ajuda na criação de um mapa de destino extremamente detalhado.
Agora que você tem uma ideia sobre o que são mapas do destino, vamos discutir um protocolo para mapeamento do destino em zebrafish que usa fotoativação. Esta abordagem relativamente nova depende de proteínas fotoativas. São proteínas fluorescentes especiais, que são "enjauladas", o que significa que são mantidas em uma conformação específica para evitar a fluorescência. A aplicação de um pulso laser controlado causa uma alteração conformacional, chamada de "uncaging", que resulta em fluorescência visível.
Para realizar este experimento, essas proteínas enjauladas especializadas são primeiro sintetizadas e depois injetadas em um ou dois embriões de zebrafish estágio celular. Em seguida, os embriões podem amadurecer até o estágio de desenvolvimento desejado antes da fotoativação.
Em seguida, para preparar o peixe para fotoativação, os embriões são descorrioados para tornar o tecido alvo acessível. Em seguida, eles são montados em um meio opticamente claro, como a baixa temperatura de fusão agarose, que os mantém com segurança em uma posição estável. As amostras estão alinhadas para expor a área de interesse, e montadas em um microscópio equipado com laser. Um pulso laser é aplicado na área alvo contendo células de interesse, induzindo a fotoativação.
Após o tratamento a laser, os embriões são cuidadosamente removidos da agarose e devolvidos ao seu ambiente natural até que o estágio de desenvolvimento desejado seja alcançado. Para rastrear as células fotoativadas, os embriões são novamente incorporados em baixa temperatura de fusão, e as células fotoativadas podem então ser visualizadas e rastreadas usando fluorescência direta ou imunostaining.
Agora que você tem uma compreensão geral de um protocolo de mapeamento do destino, vamos dar uma olhada em alguns experimentos de laboratório que se aproveitam deste procedimento.
Além de estudar o desenvolvimento embrionário, o mapeamento do destino pode ser usado para examinar o reparo em sistemas maduros. Neste experimento, um subtipo celular específico foi ablado de uma retina de zebrafish transgênico. Os cientistas então rastrearam células-tronco adultas geneticamente rotuladas para determinar seu destino após a lesão. Por fim, foi realizada a análise da imagem, que demonstrou ativação de células-tronco adultas e posterior reparação tecidual.
Os cientistas também estão usando protocolos semelhantes para entender os destinos das células-tronco transplantadas. Aqui, células-tronco embrionárias humanas geneticamente marcadas, ou hESCs, foram transplantadas em um modelo de camundongo imunocomprometido. As células implantadas foram autorizadas a diferenciar-se por 8-12 semanas, após a qual o teratoma resultante, que é um tumor que contém tecido de múltiplas camadas germinativas, foi colhido, fixo e imunossundo para determinar o destino das células-tronco implantadas. Esse tipo de experimento ajuda os cientistas a confirmar o potencial in vivo diferenciativo das células-tronco cultivadas.
Como mencionado anteriormente, os cientistas realizam procedimentos de mapeamento do destino em vários organismos modelo, incluindo mamíferos. Neste estudo em particular, os cientistas marcaram células em uma região específica de um embrião de camundongos precoce usando abordagens genéticas indutíveis. Isso é feito administrando um agente indutor a um rato grávida que carrega descendentes geneticamente modificados. As células rotuladas foram rastreadas ao longo de estágios de desenvolvimento posteriores, o que ajudou os cientistas a determinar seu destino final.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre o mapeamento do destino. Este vídeo forneceu algumas informações sobre a criação de mapas de destino, revisou um protocolo específico de mapeamento do destino e discutiu algumas das modificações e aplicações desta técnica extremamente útil. Como sempre, obrigado por assistir!
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Q1: What is a fate map and how do scientists construct one?
A fate map is a diagram outlining the fate of each part of an early embryo. Scientists construct fate maps by staining groups of cells in early embryos, such as gastrula stage cells, with dye that passes to all descendants. After allowing development, they note stained cell locations in mature organisms. Pooled results from multiple experiments create the complete fate map.
Q2: Why is zebrafish a preferred model organism for fate mapping experiments?
Zebrafish are ideal for fate mapping because they are small and remain transparent throughout much of development, allowing scientists to easily track cells under a light microscope. This transparency advantage, combined with advances in cell labeling techniques, enables precise marking of single cells and creation of extremely detailed fate maps during embryonic development.
Q3: How does photoactivation work in fate mapping protocols?
Photoactivation uses special fluorescent proteins that are caged, preventing fluorescence until activated. A controlled laser pulse causes uncaging, a conformational change that results in visible fluorescence. Scientists inject these photoactivatable proteins into early zebrafish embryos, then apply laser pulses to targeted cells at desired developmental stages to induce fluorescence and trace cell lineages.
Q4: What preparation steps are necessary before photoactivating embryonic cells?
Before photoactivation, embryos must be dechorionated to make target tissue accessible. They are then mounted in optically clear medium, such as low melting temperature agarose, which maintains steady positioning. Samples are aligned to expose the area of interest and mounted onto a laser-equipped microscope for precise photoactivation of targeted cells.
Q5: How can fate mapping be applied to study tissue repair in adult organisms?
Fate mapping can examine repair in mature systems by ablating specific cell subtypes and tracing genetically labeled resident adult stem cells to determine their fate following injury. Image analysis demonstrates activation of adult stem cells and subsequent tissue regeneration with somatic stem cells, revealing how stem cells respond to damage and contribute to healing.
Q6: What do scientists learn from transplanting labeled stem cells into animal models?
Scientists transplant genetically tagged human embryonic stem cells into immunocompromised mice and allow differentiation for 8-12 weeks. The resulting teratoma, a tumor containing tissue from multiple germ layers, is harvested and immunostained to determine implanted cell fate. This confirms the in vivo differentiative potential of cultured stem cells.
Q7: How do inducible genetic approaches enable fate mapping in mammalian embryos?
Scientists mark cells in specific regions of early mouse embryos using inducible genetic approaches by administering an inducing agent to pregnant mice carrying genetically modified offspring. Labeled cells are tracked throughout later developmental stages to determine their ultimate fate, providing detailed lineage information in mammalian development.
Capítulos neste vídeo
0:00
Overview
0:48
Principles of Fate Mapping
2:38
Fate Mapping in Zebrafish Using Photoactivation
4:29
Applications
6:31
Summary